Bruksanvisning. EULISA dsdna IgG. Avsedd användning. Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot dsdna

Transkript

1 Bruksanvisning EULISA dsdna IgG Avsedd användning Enzymimmunoanalys för detektering av autoantikroppar IgG mot dsdna Mikrotitrering, 96 brunnar Förvara kitet vid +28 C Endast för in vitrodiagnostik. Dokument nr. E SE Januari 203 EULISA dsdna IgG SVENSKA

2 Innehåll. Introduktion och bakgrund 2. Varningar och försiktighetsåtgärder 3. Testprincip 4. Kitets innehåll 5. Material som krävs men som inte ingår 6. Förvaring av kitet 7. Reagens och provberedning / provkrav 8. Analysmetod 8.. Manuell användning 8.2. Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem 9. Utvärdering och kvalitetskontroll 0. Tolkning av resultat / metodens begränsningar. Prestanda.. Standardisering.2. Analytisk specificitet.3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet).4. Homogenitet i fast fas.5. Linjäritet.6. Precision.7. Frekvensdistribution av dsdnaak (IgG).8. Manuell drift jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem 2. Garanti 3. Symboler 4. Referenser 5. Sammanfattande flödesschema Den produkt som beskrivs i detta dokument har tillverkats i enlighet med IVDdirektivet 98/79/EG.

3 . Introduktion och bakgrund Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en kronisk autoimmunmedierad inflammatorisk sjukdom med varierande kliniska symptom, från lokaliserade hudlesioner till en destruktiv systemisk sjukdom utan kutana förändringar (). Antikroppar mot dubbelsträngat (ds)dna är en välkänd, specifik markör för SLE, med en prevalens mellan 5090 %, beroende på sjukdomens svårighetsgrad (2, 3, 4). Antikropparnas titer sammanfaller ofta med sjukdomsaktivitet och tillhandahåller ett verktyg för behandlingskontroll (5). Cirkulerande DNA/antiDNAimmunkomplex anses spela in i patogenesen hos SLE (6). dsdnaantikroppar utgör ett SLEkriterium enligt ARA (American Rheumatism Association). Den aktuella enzymkopplade immunadsorberande analysen (ELISA) är avsedd för kvantitativ eller kvalitativ bestämning av IgGantikroppar riktade mot dsdna i humant serum. Det immobiliserade antigenet är en högt renad beredning av plasmiddsdna (>90 % i supercoiltillstånd), fri från kromosomdna och protein (histoner). Testet är snabbt (inkubationstid 30 / 30 / 30 minuter) och flexibelt (delbar fast fas, reagenser som är klara att användas). Sex kalibratorer möjliggör kvantitativa mätningar; en negativ och en positiv kontroll kontrollerar analysprestandan. 2. Varningar och försiktighetsåtgärder Testkitet är endast avsett för in vitro diagnostiskt bruk och får inte användas i eller på människor eller djur. Använd inte reagenser efter angivet utgångsdatum. Vi rekommenderar starkt att protokollet följs. Provbuffert, kalibratorer och kontroller innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Tvättbufferten innehåller bromnitrodioxan och konjugatet innehåller metylisotiazolinon/bromnitrodioxan som konserveringsmedel. Substratet innehåller 3, 3', 5, 5'tetrametylbenzidin (TMB) och väteperoxid (H2O2). Stopplösningen, 0,5 M svavelsyra (H2SO4), är sur och frätande. Ovan angivna reagenser kan vara giftiga vid förtäring. Iakttag rutinmässiga försiktighetsåtgärder vid hantering av farliga kemikalier. Undvik all kontakt med kroppen, använd handskar och skyddsglasögon. Skölj grundligt med vatten, om någon av reagenserna kommer i kontakt med hud eller slemhinnor. Pipettera aldrig med munnen. Kassera i enlighet med lokala/nationella föreskrifter. 2

4 Natriumazid kan reagera med bly och kopparrör och bilda explosiva metallazider. Spola med stora mängder vatten vid kassering för att undvika ansamling av azider. Kalibratorer och kontroller innehåller komponenter med humant ursprung. De har visat negativa resultat vid tester för humant immunbristvirus (HIV)ag, hepatit B yt(hbs)ag, HIV /2ak samt hepatit Cvirus (HCV)ak, i tester som uppfyller FDA:s krav eller kraven i EU:s direktiv 98/79/EG. Det finns emellertid inga kända tester som kan garantera att produkter som härleds ur humant blod är fria från smittämnen. De måste därför hanteras som om de är smittbärande och kasseras på lämpligt sätt. Läs CDC:s (Center of Disease Control, Atlanta, USA) eller andra lokala/nationella riktlinjer beträffande laboratoriesäkerhet och dekontamineringsrutiner. 3. Testprincip Brunnarna i den fasta fasen bestryks med dsdna. På denna yta kommer följande immunologiska reaktioner att äga rum: :a reaktionen: dsdnaspecifika antikroppar i provet binder till det immobiliserade antigenet och bildar ett antigenantikroppskomplex. Därefter tvättas obundna provkomponenter bort från den fasta fasen. 2:a reaktionen: En andra antikropp, riktad mot humana IgGanti kroppar och konjugerad med HRP (pepparrotsperoxidas) tillsätts. Detta konjugat binds till komplexet. Därefter tvättas överflödigt konjugat bort från den fasta fasen. 3:e reaktionen: Det enzymmärkta komplexet omvandlar det färglösa substratet till en blå produkt. Graden av färgutveckling reflekterar koncentrationen av dsdnaantikroppar (IgG) i provet. 4. Kitets innehåll a. mikrobrunnsplatta som belagts med dsdna och förpackats hermetiskt i en folielaminatpåse tillsammans med en påse med torkmedel. Plattan består av 2 remsor som var och en kan delas upp i 8 enskilda brunnar. 3

5 b. Provbuffert, 00 ml, klar att användas, orange. Innehåller trisbuffrad koksaltlösning (TBS), bovint serumalbumin (BSA), tween och natriumazid. c. Tvättbuffert, 00 ml, 0xkoncentrat, blå. Innehåller TBS, tween och bromnitrodioxan. d. 6 kalibratorer, 2,0 ml vardera, 0 6, och 250 IU dsdnaantikroppar (IgG)/ml, klara att använda, gradvis blåfärgade. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. e. Negativ och positiv kontroll, 2,0 ml vardera, klara att använda, grön respektive röd. Innehåller TBS, BSA, tween och natriumazid. f. Antihumant IgG HRPkonjugat, 4 ml, klart att använda, rött. Buffrad lösning som innehåller stabiliseringsprotein, metylisotiazolinon samt bromnitrodioxan. g. Substratlösning, 4 ml, klar att använda, färglös. Innehåller en buffrad lösning av TMB och H2O2 i en flaska som är ogenomtränglig för ljus. h. Stopplösning (0,5 M H2SO4), 4 ml, färglös, klar att användas. Varning: Svavelsyra är frätande. i. Bruksanvisning j. Lotspecifikt analyscertifikat 4

6 5. Material som krävs men som inte ingår a. Avjoniserat eller destillerat vatten b. Graderad cylinder, 000 ml c. Rör för provspädning (överföringsrör i mikrobrunnsplattans format rekommenderas) d. Pipetter för 0, 00 och 000 µl (pipetter med och 8 kanaler rekommenderas) e. Tvätt för mikrobrunnsplatta (tillval) f. Fotometer för mikrobrunnsplatta, försedd med ett 450 nm filter g. ELISA utvärderingsprogram (rekommenderas) 6. Förvaring av kitet Förvara kitet vid 28 C. Det är stabilt fram till det utgångsdatum som anges på kartongens etikett. Använd inte kitet efter utgångsdatumet. 7. Reagens och provberedning / provkrav Komponenter från olika kit får inte bytas ut mot varandra eller slås samman, på grund av eventuella varierande frakt eller lagringsförhållanden. a. Innan påsen med mikrotiterplattan öppnas måste den ha uppnått rumstemperatur. Ta ut de mikrobrunnar som inte behövs ur ramen och lägg omedelbart tillbaka dem i påsen, tillsammans med påsen med torkmedel. Återförsegla påsen hermetiskt och förvara den i kylen för framtida användning. b. Späd ut tvättbufferten (0xkoncentrat [00 ml, blå]) med 900 ml avjoniserat vatten. Blanda noga. Den utspädda bufferten är stabil i flera veckor vid förvaring i kylskåp (28 C). 5

7 c. Beredning av proverna: Hantera patientproverna som om de kan överföra smittämnen. Förbered sera med vedertagna laboratoriemetoder och späd /00, t.ex. 0 µl serum µl provbuffert. Blanda noga. För snabb dispensering under analysen rekommenderas att kalibratorer, kontroller och prover förbereds i överföringsrör för mikrobrunn. Detta möjliggör användning av en pipett med 8 kanaler under analysen. Om proverna inte analyseras omedelbart ska de förvaras vid 28 C och analyseras inom 3 dagar. Vid längre förvaring rekommenderas en temperatur på 20 C eller lägre. Upprepad frysning och upptining av sera bör undvikas. Upptinade prover måste blandas före spädning. Provkrav: Sera med hög fetthalt eller sera som är hemolyserat eller mikrobiellt kontaminerat kan ge felaktiga resultat och bör undvikas. 8. Analysmetod 8.. Manuell användning Innan analysen påbörjas måste alla komponenter i kitet ha uppnått rumstemperatur (23 ± 3 C). För bästa resultat, d.v.s. maximalt förhållande mellan specifik signal och bakgrundssignal, är noggrann tvätt avgörande (steg a, c och e). Det är av yttersta vikt att tvättlösningen avlägsnas helt och hållet. För detta ändamål torka ordentligt plattan mot flera lager av absorberande papper. Automatiska tvättar måste verifieras mot resultat som uppnås med manuell tvätt. a. Precis före användning ska mikrobrunnarna tvättas en gång: fyll brunnarna med 350 µl tvättbuffert i varje, vänta i cirka 0 sekunder och avlägsna. b. Dispensera kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gröna och röda) samt de utspädda proverna snabbt i mikrobrunnarna; 00 µl per brunn. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera plattan i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). c. Tvätta brunnarna 4 gånger som i steg a. 6

8 d. Dispensera konjugatet (4 ml, klart att användas, rött) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 00 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. e. Upprepa tvättmomentet i steg c. f. Dispensera substratlösningen (4 ml, klar att användas, färglös, svart flaska) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 00 µl per brunn. Inkubera plattan som i steg b. Eftersom substratet är ljuskänsligt bör exponering för intensivt ljus undvikas (t.ex. direkt solljus) under inkubationen. g. Dispensera stopplösningen (4 ml, klar att användas, färglös. Varning: frätande!) snabbt (företrädesvis med en pipett med 8 kanaler); 00 µl per brunn. Använd samma sekvens som för substratet. Färgen ändras från blå till gul. Skaka plattan, företrädesvis på en orbital skakapparat i cirka 0 sekunder. h. Läs omedelbart av absorbansen i mikrobrunnsplattans fotometer vid 450 nm. Förvara kvarstående reagenser i kyl (28 C) om de ska användas igen. 8.2 Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem Denna produkt har validerats för användning med Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem. En lämplig programfil för genomförande och utvärdering av analys tillhandahålls på begäran. Parametrarna i detta program är endast ett förslag och kan behöva anpassas av användaren till kraven i den faktiska analysen. Vi har generellt försökt att hålla oss så mycket som möjligt till protokollet vid en manuell användning, enligt ovan. Emellertid, på grund av en högre temperatur inuti DS2, inkubationstiden för substratet bör förkortas. Paragraf.8. innehåller en prestationsjämförelse mellan manuell analys och DS2 ELISAsystemet. 9. Utvärdering och kvalitetskontroll Kvantitativ utvärdering: De data som erhålls utvärderas kvantitativt mot standardkurvan enligt nedan. Den kurva som visas är endast en modell. Den kan inte ersätta mätning av kalibratorer, tillsammans med kontroller och faktiska prov. Kurvan har konstruerats med ett konventionellt ELISA utvärderingsprogram, som använder 4 parameters funktion. Splineapproximering är också lämpligt. 7

9 Dynex DS2 xx manual op. oo mod 450nm IU dsdnaab/ ml 09FE00.FED/StdKurveV40J Om ingen datorstödd utvärdering är möjlig kan standardkurvan ritas för hand. Den möjliggör omvandling av absorbansvärdet i ett prov till dess koncentration, d.v.s. i IU dsdnaantikroppar (IgG) per ml serum. Kvalitativ utvärdering: Testet kan även utvärderas kvalitativt. Detta kräver mätning av den endast positiva kontrollen. Mätning och undersökning av den negativa kontrollen rekommenderas dock (se nedan: kvalitetskontroll). Vid kvalitativ testutvärdering jämförs absorbansen hos proverna med gränsabsorbansen (= cutoff). Den fastställs enligt följande formel: absorbansgränsvärde = absorbanspositiv kontroll x faktor Faktorn beror på kitloten och anges i det lotspecifika analyscertifikatet som medföljer varje testkit. Exempel: absorbanspositiv kontroll = 250 mod faktor = 0,35 absorbansgränsvärde = 250 mod x 0,35 = 438 mod För att få en uppskattning av hur positivt ett visst prov är för dsdnaab (IgG), kan man beräkna kvoten, enligt följande formel: kvot = absorbansprov / absorbansgränsvärde 8

10 Exempel: Absorbansgräns = 438 mod absorbansgräns = 480 mod kvot = 480 mod / 438 mod = 3,4 Kvalitetskontroll: Den positiva och negativa kontrollen kontrollerar analysens prestanda. Deras auktoriserade värden respektive godkända intervall anges i det lotspecifika analyscertifikatet. Kontrollernas värden måste falla inom de angivna intervallen, annars är analysresultaten ogiltiga. 0. Tolkning av resultat / metodens begränsningar Med utgångspunkt från mätning av en blodgivare och ett urval positiva sera (se nedan), föreslår vi för analys av patientsera: kvantitativ utvärdering kvalitative utvärdering IU dsdnaab (IgG) kvot per ml serum normalt (negativt) intervall < 35 < 0,90 cutoff 40,00 obestämbart intervall ,90, positivt intervall > 46 >, Dessa specifikationer anges endast som en indikation. För att kontrollera exaktheten bör varje analys inkludera parallella prover av normala sera. Ett negativt testresultat anger att patienten inte har förhöjda nivåer av IgGantikroppar mot dsdna. Om kliniska symtom på SLE ändå observeras kan ytterligare antinukleära antikroppar bestämmas. Eftersom dsdnaautoantikroppar sällan observeras hos normala individer bör ett positivt resultat anses utgöra en indikation för SLE. I några få fall uppstår emellertid dsdnaantikroppar i vissa andra autoimmuna sjukdomar. 9

11 Prover som visar resultat mellan ovan angivna gränser bör anses vara obestämbara och rapporteras som sådana. Vi rekommenderar att ytterligare ett prov görs två veckor senare och körs parallellt med det första provet för att dokumentera eventuell förändring i antikroppstitern. I likhet med alla serologiska analyser bör resultaten tolkas mot beaktande av patientens symtom och andra diagnostiska kriterier.. Prestanda.. Standardisering Testet är standardiserat med en renad serumberedning som innehåller IgGantikroppar som är specifikt inriktade mot dsdna. Denna beredning har kalibrerats enligt den första internationella standarden för dsdnaak, kodad Wo/80. Graden av reaktivitet i provet mäts i internationella enheter (IU dsdnaak (IgG)/ml serum)..2. Analytisk specificitet Testet medger specifik bestämning av humana IgGantikroppar, riktade mot dsdna..3. Detektionsgräns (analytisk sensitivitet) Detektionsgränsen definieras som den koncentration av analytet som motsvarar genomsnittlig absorbans av provbuffert plus 3faldig standardavvikelse (s). Det fastställdes som < IU dsdnaak (IgG) per ml serum (n = 24). Rekommenderat mätintervall: IU dsdnaak (IgG) per ml serum.4. Homogenitet i fast fas Mätning av homogenicitet i fast fas är en normal del av kvalitetskontrollen av varje produktionslot. Det bestäms genom 288falding mätning av ett IgGpositivt prov som inte är saturerande på 3 valda plattor. Kriterium för godkännande: modvariationskoefficient (cv) över plattorna < 8 %. Bilden nedan visar ett typiskt utdrag (fast fas lotnr. 0809C) av en sådan analys. 0

12 mod 450nm platta tidigt (n/0) sent (9n/0) medelvärde cv % rad rad a , rad b ,4 rad c ,8 rad d ,5 rad e ,7 rade f ,9 rade g ,5 rad h ,5 medelvärde cv % 2,6 2,4 2,6 2,2,7,4,5 2,2,6,0,6,2 2,5 line a line b line c line d line e line f line g line h m OD 450nm early / late plate, row no. 09FE00.FED/FphHomV40J

13 .5. Linjäritet För att bedöma testets dosresponsförhållande, mättes positiva sera i seriell 2 faldig spädning. Kriterium för godkännande: linjär regression av fyra spädningar efter varandra måste ge en korrelationsfaktor > 0,98. Ett typiskt resultat visas nedan. L m / b A A N D 00 s d IU 50 serum serum 2 serum 3 lin.regr. lin.regr.2 lin.regr nl serum / well 09FE00.FED/LinearV40J.6. Precision För att bedöma testets precision fastställdes resultatens variabilitet under följande förhållanden: a. inom analys och mellan 3 analyser, b. mellan 3 operatörer och c. mellan 2 kitloter. a. Variabilitet inom analys och mellan analyser (n = 24 respektive 72) prov medelvärde variabilitet (cv %) IU/ml inom analys mellan analyser 23 3,3 3, ,2 3, ,0 2,0 2

14 b. Variabilitet mellan operatörer (n = 2) prov medelvärde variabilitet IU/ml (cv %) 27 4, , ,4 b. Variabilitet mellan 2 kitloter (n = 6) prov medelvärde variabilitet IU/ml (cv %) 27 8, , ,4.7. Frekvensdistribution av dsdnaak (IgG) Detta analyserades i sera från blodgivare, jämnt fördelat mellan kön och ålder och från sera som befunnits positiva för Smautoantikroppar enligt CEgodkänt referenselisa. Smantikroppar anses ytterst specifika för SLE. Följande fördelning av analyt observerades: blodgivarsera positiva sera n: 60 n: 9 medelvärde: IU/ml medelvärde: 39 IU/ml medelvärde + s: 2 IU/ml medelvärde s: 47 IU/ml medelvärde + 2s: 3 IU/ml medelvärde 2s: < 0 IU/ml median: 8, IU/ml median: 0 IU/ml 95:e percentilen: 22 IU/ml 5:e percentilen: 59 IU/ml ROCanalys av dessa data användes för att bestämma gränsvärdet som 40 IU dsdnaak (IgG)/ml (7). De data som presenteras här visar på en diagnostisk specificitet och sensitivitet hos denna ELISA på cirka 98 % respektive nästan 00 %. Dessa värden gäller endast analyserade sera; andra provsamlingar kan ge andra resultat. 3

15 <,22,48,8 2,2 2,68 3,26 3,98 4,84 5,9 7,8 8,75 0,7 3 5,8 9,3 23,5 28,6 34,8 42,4 5,6 62,9 76,6 93, relative frequency (%) blood donor sera 25 ) 20 (% y c n 5 e u q fre e 0 tiv la re 5 cutoff 0 < IU dsdnaab/ml positive sera cutoff 5 0 IU dsdnaab/ml 09FE00.FED/HäufgPlotV40J 4

16 Dynex DS2 (IU/mL).8. Manuell förfarande jämfört med Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem Variabilitet: Genom att använda prover från en och samma kitlot, jämfördes analysresultatens variabilitet mellan manuell användning och Dynex DS2 automatiskt ELISAsystem: manuell användning Dynex DS2 variabilitet inom analys medelvärde cv =,7 % medelvärde cv = 2,3 % (n = 6) variabilitet mellan analyser medelvärde cv = 3,3 % medelvärde cv = 4,2 % (n = 48) Standardkurva: visas i paragraf 9 Korrelation: y =,082 x r = 0, manual operation (IU/mL) 09FE00.FED/KorrDynexDS2V40J 5

17 2. Garanti Euro Diagnostica AB garanterar att levererad produkt har testats grundligt för att säkerställa att de egenskaper som specificeras här har uppfyllts. Inga ytterligare garantier lämnas. De prestationsdata som presenteras här erhölls med användning av angiven metod. Eventuell modifikation av metoden kan påverka resultaten varvid Euro Diagnostica AB friskriver sig från alla garantier, såväl uttryckliga som underförstådda eller lagstiftade. Euro Diagnostica AB bär inte heller något ansvar för eventuella skador, vare sig direkta, indirekta eller efterföljande som uppstår till följd av felaktig användning eller förvaring av produkten. 3. Symboler Katalognummer Satsnummer Innehåller tillräcklig mängd för <n> tester Medicinteknisk produkt för in vitrodiagnostik Conformité Européenne Skyddas från solljus 6

18 Temperaturgränser Hållbar till Varning Biologiska risker Tillverkare 7

19 4. Referenser. Tan, E. M., et al.: The 982 revised criteria for the classifiction of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 25 (982), Ludivico, C. L., et al.: Predictive value of antidna antibody and selected laboratory studies in systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 7 (980), Schwartz, R. S.: AntiDNA antibodies and the problem of autoimmunity. Cell Immunol 99 (986), Arbuckle, M. R., et al.: Development of antidsdna autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus. Scan J Immunol 54 2 (200), Bootsma, H., et al.: Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus. Lancet 345 (995), Tan, E. M.: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Adv Immunol 33 (982), Sommer, R., and Eitelberger, F.: Wertigkeit der GliadinAntikörper im Serum zur Diagnose der Zöliakie. Wien Klin Wochenschr 04/4 (992),

20 5. Sammanfattande flödesschema a. Späd sera i /00 i provbuffert (00 ml, klar att användas, organge) och blanda. b. Späd tvättbufferten (0xkoncentrat [00 ml, blå]) med vatten och blanda. c. Tvätta brunnarna en gång med 350 ul tvättbuffert vardera. Dispensera 00 ul av kalibratorerna (2,0 ml i varje, klara att användas, gradvis blå), kontrollerna (2,0 ml i varje, klara att användas, grön och röd) samt de utspädda proverna i den fasta fasens brunnar. Mätningar i duplikat rekommenderas. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (23 ± 3 C). d. Tvätta brunnarna 4 gånger med 350 ul tvättbuffert vardera. e. Dispensera 00 µl av konjugatet (4 ml, klart att använda, rött) i brunnarna. Inkubera som i steg c. f. Upprepa tvättmomentet i steg d. g. Dispensera 00 µl av substratlösningen (4 ml, klar att använda, svart flaska) per brunn. Inkubera som i steg c och tillsätt därefter 00 µl stopplösning (4 ml, klar att använda, färglös) per brunn och skaka plattan en kort stund. h. Mät omedelbart absorbansen vid 450 nm. i. Kvantitativ utvärdering: Bestäm standardkurvan och omvandla provernas absorbans, med användning av denna kurva, till deras respektive antikroppskoncentration (IU dsdnaak (IgG)/ml). j. Kvalitativ utvärdering: Bestäm gränsabsorbansen genom att multiplicera absorbansen i den positiva kontrollen med den faktor som anges i analyscertifikatet. Beräkna därefter provernas kvot genom att dela deras absorbans med gränsabsorbansen. 9