Monolisa Anti-HBs PLUS 192 tests 72566

Transkript

1 Monolisa Anti-HBs PLUS 192 tests ENZYMANALYS (EIA) FÖR DETEKTION OCH NIVÅBESTÄMNING AV ANTIKROPP MOT HEPATIT B YTANTIGEN (ANTI-HBs) I HUMANT SERUM ELLER HUMAN PLASMA IVD Tillverkarens kvalitetskontroll Alla reagenser tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag.

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. ANVÄNDNINGSOMRÅDE 2. PRESENTATION AV TESTET 3. TESTPRINCIP 4. TESTETS BESTÅNDSDELAR 5. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 6. HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR 7. NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL 8. BEREDNING AV REAGENSER 9. FÖRVARING OCH VALIDITET 10. PROVER 11. TESTFÖRFARANDE 12. VALIDERING AV RESULTAT FÖR KVALITATIV OCH KVANTITATIV METOD 13. BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN 14. SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING 15. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 16. TESTRESULTAT 17. REFERENSER 58

3 1 - ANVÄNDNINGSOMRÅDE Monolisa anti-hbs PLUS är en immunologisk enzymanalys för kvalitativ och kvantitativ detektion av det totala antalet antikroppar mot hepatit B ytantigen (anti-hbs) i humant serum eller human plasma. 2 - PRESENTATION AV TESTET Förekomst av antikroppar mot hepatit B ytantigen är en viktig faktor för diagnos och prognos av hepatit B-virusinfektion (HBV). Vid akut hepatit B-infektion kan anti-hbs påvisas hos nästan 80 % av patienterna 1 till 3 månader efter att hepatit B ytantigen (HBsAg) påträffats. Anti-HBs används i epidemiologisk undersökning för att bedöma tidigare exponering för hepatit B hos potentiella hepatit B-vaccinmottagare för övervakning av vaccinationer och urval av plasma med höga antikroppskoncentrationer för beredning av specifika immunoglobuliner. Monolisa Anti-HBs PLUS är en direkt immunologisk enzymanalys av antikropps-sandwich-typ, som använder mikrobrunnar av polystyren täckta med ursprungliga HBsAg (suptyperna ad och ay) som fast fas och en konjugatlösning innehållande pepparrots- och peroxidasmärkt HBsAg (humant, subtyperna ad och ay). Bestämningen av anti-hbs-nivåer har standardiserats genom användning av WHO:s Anti-HBs referensberedning uttryckt i milli-internationella enheter per milliliter (mie/ml). En nivå större än eller lika med 10 mie/ml anses allmänt vara standard för påvisande av skydd mot HBV efter vaccination. Verifiering av minst ett minimum anti-hbs-titer på 10 mie/ml, dvs. en immunitetströskeltiter, är viktigt för korrekt hantering av vaccinerade personer som därefter kan utsättas för HBsAg-positiva vätskor och prover. 3 - TESTPRINCIP I analysproceduren blir patientprover och kontroller inkuberade med de antigentäckta mikrobrunnarna. Om antikroppar mot HBs är närvarande i provet eller kontrollen binder de antigenen. Överflödigt prov tvättas bort. Konjugatet läggs sedan till i mikrobrunnarna. Konjugatet binds till valfritt antigen-antikroppskomplex som förekommer i mikrobrunnarna. Överflödigt konjugat avlägsnas genom tvätt och en kromogen-/substratlösning läggs till i mikrobrunnarna och tillåts inkubera. Om ett prov innehåller anti-hbs orsakar det bundna enzymet (HRP) en färgning av tetrametylbenzidin (TMB) i kromogenlösningen som blir blå. Den blå färgen blir gul efter tillsats av en stopplösning. Om ett prov inte innehåller anti-hbs förblir kromogen-/substratlösningen i brunnen färglös under substratinkubationen och efter tillsats av stopplösningen. Färgintensiteten, som mäts spektrofotometriskt, är proportionell mot mängden anti-hbs som finns i provet. Avläsningar av absorbansvärde för patientprover jämförs med ett gränsvärde som bestäms genom 10 mie/ml-kalibratorn. 59

4 4 - TESTETS BESTÅNDSDELAR Alla reagenser som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. MÄRKNING TYP AV REAGENS INNEHÅLL R1 MIKROPLATTA 2 mikroplattor 12 remsor med 8 brunnar som sensibiliserats med en blandning av hepatit B ytantigen, subtyp ad och ay (humant ursprung). R2 KONCENTRERAD TVÄTTLÖSNING (20X) 1 vial Tris-NaCl-buffert ph 7,4 235 ml Konserveringsmedel : ProClin TM 300 (0,04%) C0 ANTI-HBS NEGATIV KONTROLL 1 vial Buffert med fosterkalvserum och proteinstabilisatorer 2,2 ml Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5%) C1 10 mie/ml kalibrator 1 vial Buffert med Anti-HBs antikroppar av humant ursprung, fosterkalvserum, 3 ml proteinstabilisatorer och provindikatorfärgämne Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5%) C2 100 mie/ml kalibrator positiv kontroll 1 vial Buffert med Anti-HBs antikroppar av humant ursprung, fosterkalvserum, 2,2 ml proteinstabilisatorer och provindikatorfärgämne Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5%) C3 400 mie/ml kalibrator 1 vial Buffert med Anti-HBs antikroppar av humant ursprung, fosterkalvserum, 2,2 ml proteinstabilisatorer och provindikatorfärgämne Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5%) C mie/ml kalibrator 1 vial Buffert med Anti-HBs antikroppar av humant ursprung, fosterkalvserum, 2,2 ml proteinstabilisatorer och provindikatorfärgämne Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5 %) R6 UTSPÄDNINGSVÄTSKA 1 vial Buffert med fosterkalvserum och proteinstabilisatorer 27 ml Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,1%) R7a KONCENTRERAT KONJUGAT (11X) 1 vial Buffert med HBsAg (humana ad och ay-subtyper) täckta med peroxidas 2,5 ml och proteinstabilisatorer Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,5%) R7b KONJUGATUTSPÄDNINGSMEDEL 1 vial Buffert med fosterkalvserum och proteinstabilisatorer 25 ml Konserveringsmedel : Proclin 300 (0,1%) R8 SUBSTRATBUFFERT 1 vial Citronsyra- och natriumacetatlösning ph 4,0 60 ml ph 4,0 innehållande H 2 O 2 (0,015%) och DMSO (4%) R9 KROMOGEN 1 vial Lösning innehållande tetrametylbensidin (TMB) 5 ml R10 STOPPLÖSNING 1 vial 1 N svavelsyralösning 28 ml * Kontrollerna är kalibrerade enligt en intern referens, som är kalibrerad i enlighet med första IRP WHO 1977-referensen Förvara kitet vid 2-8 C. Låt alla reagenser utom konjugatkoncentrat värmas upp till rumstemperatur (18-30 C) före användning. Omedelbart efter användning ska de åter förvaras vid 2-8 C. Förvara alla oanvända remsor/plattor i förpackningen och förslut den. Ta inte bort torkmedlet. Förvara remseplattorna vid 2 8 C. 60

5 5 - FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Resultatens kvalitet är beroende av om följande krav enligt god laboratoriesed uppfylls: Namnet på testet och testets specifika ID-nummer är skrivna på ramen för varje mikrotiterplatta. Det specifika ID-numret anges också på varje remsa. Monolisa Anti-HBs PLUS : Specifikt ID-nummer = 63. Kontrollera det specifika ID-numret före användning. Om ID-numret saknas eller om det skiljer sig från det angivna numret för den analys som ska utföras ska remsan inte användas. Använd inte reagenser då bäst före-datumet har passerats. Blanda inte reagenser från olika partier inom en bestämd testkörning. KOMMENTAR : För tvättlösningen (R2, etikettmärkning : 20X grönfärgad), peroxidassubstrat buffert (R8, märknings-id : TMB buf. blåfärgad), kromogen (R9, märknings-id : TMB 11X, lilafärgad) och stopplösning (R10 märknings-id : 1N rödfärgad) är det möjligt att använda andra partier än de som ingår i testet, om samma parti används inom en viss testkörning. Dessa reagenser kan användas tillsammans med vissa andra produkter från vårt företag. Dessutom kan tvättlösningen (R2, etikettmärkning: 20X grönfärgad) blandas med de 2 andra tvättlösningarna som ingår i olika Bio-Radreagens-satser (R2, etikettmärkningar: 10X blå- eller 10X orangefärgad) vid korrekt blandning, förutsatt att endast en blandning används vid en given testkörning. Kontakta vår avdelning för teknisk service om du vill ha mer information. Innan reagenserna används ska de stabiliseras i rumstemperatur i 30 minuter. Rekonstituera noggrant reagenserna och undvik all förorening. Utför inte testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre engångsmaterial. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenset har hällts i. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika lösningarna som innehåller konjugat- eller substratlösning. Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara rosafärgad. Om den rosa färgen förändras några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagenset inte kan användas och måste ersättas. Framkallningslösningen kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har förtvättats med 1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Detta reagens måste förvaras i mörker. Använd en ny pipettspets för varje serum. Tvättningen av brunnarna är ett kritiskt steg i proceduren. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvättning kan leda till felaktiga resultat. Använd aldrig samma behållare för att fördela konjugatet och framkallningslösningen. 6 - HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Vissa reagenser innehåller ProClin 300 (0.04%, 0.1 % och/eller 0.5%) R43 : Kan ge allergi vid hudkontakt. S28/37 : Vid kontakt med huden, tvätta genast med mycket tvål och vatten. Använd lämpliga skyddshandskar. Xi Irriterande Monolisa Anti-HBs PLUS innehåller humana blodkomponenter som testats och befunnits ickereaktiva för hepatit B ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (HCV) och antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV-1 och HIV-2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagenser och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material som har varit i direkt kontakt med prover och reagenser av humant ursprung, liksom tvättlösningar, som smittfarligt material. Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Använd engångshandskar när du hanterar reagenser och prover. Tvätta händerna noggrant efter hanteringen. 61

6 Pipettera inte med munnen. Prover, reagenser av humant ursprung liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter måste omhändertas efter saneringen enligt följande : - antingen sänkas ned i blekmedel vid en slutkoncentration på 5% natriumhypoklorit (1 del blekmedel till 10 delar smittfarlig vätska eller smittfarligt vatten) i 30 minuter, - eller autoklaveras i 121 C i minst 2 timmar. Autoklavering vid 121 C i minst 1 timme är den bästa metoden för att inaktivera HIV- och HBV-virus. VARNING! HÄLL INGA LÖSNINGAR SOM INNEHÅLLER NATRIUMHYPOKLORIT I AUTOKLAVEN. Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10%. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel och torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Glöm inte att neutralisera och/eller autoklavera lösningar, tvättavfall och vätskor som innehåller biologiska prover innan de hälls ut i vasken. Ett säkerhetsdatablad kan erhållas på begäran. 7 - NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL Destillerat eller avjoniserat vatten. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat. Automatiska eller halvautomatiska inställbara eller fast inställda pipetter för 10 µl till 200 µl, 1 ml, 5 ml och 10 ml. Mätcylindrar med volymerna 25 ml, 100 ml och ml. Behållare för smittfarligt avfall. Vattenbad eller torr inkubator, inställd via termostat på 37 C ± 1 C. Automatiskt, halvautomatiskt eller manuellt tvättsystem för mikroplattorna. Avläsningsutrustning för mikroplattor (utrustad med 490, 450 och 620 nm-filter). Absorberande papper. Engångshandskar. Rena polypropylenbehållare för TMB-beredning. 8 - BEREDNING AV REAGENSER Innan reagenserna i Monolisa Anti-HBs PLUS-analyskitet används ska de stabiliseras i rumstemperatur i 30 minuter. 1) Reagenser färdiga att använda Mikroplatta (R1) Varje stödram innehåller 12 remsor och är förrpackad i en försluten påse. Klipp upp påsen med en sax eller skär upp den med en skalpell 0,5-1 cm ovanför förslutningen. Öppna påsen och ta ut ramen. Lägg tillbaka oanvända remsor i påsen. Stäng påsen noggrant och förvara den i +2-8 C. Utspädningsvätska (R6) Anti-HBs negativ kontroll (C0) 10 mie/ml kalibrator (C1) 100 mie/ml kalibrator positiv kontroll (C2) 400 mie/ml kalibrator (C3) 1000 mie/ml kalibrator (C4) Homongenisera reagenser innan du använder vortexblandare eller vänd dem försiktigt upp och ner. 2) Reagenser att späda Koncentrerad tvättlösning (20X) : R2 Späd 1:20 med destillerat vatten för att få en färdig tvättlösning. Bered 800 ml för en platta med 12 remsor. Konjugatarbetslösning (R7a + R7b) Låt konjugatsutpädningsmedlet (R7b) anta rumstemperatur. Vänd ner konjugatutspädningsmedlet (R7b, färglöst till blekt rör) och konjugatkoncentrat (R7a, grönt) i blandningen innan användning. 62

7 Förbered en 1:11 spädning för varje remsa som ska testas (exempel : tillsätt 100 µl konjugatkoncentrat (R7a) för varje 1 ml konjugatutspädningsmedel (R7b) i ett rent polypropylenrör). Använd följande tabell som en guide. Blanda väl men försiktigt för att undvika skumbildning. Aktiv konjugatlösning. Skyddas från ljus, både vid rumstemperatur och vid 2-8 C. Arbetskonjugatlösning ska vara grön. Den är hållbar i 8 timmar vid rumstemperatur och i 24 timmar vid förvaring vid +2-8 C. Konjugatlösning kan förberedas genom att pipettera hela innehållet i konjugatkoncentratflaskan (R7a) i konjugatutspädningsmedlet (R7b). Blanda alltid arbetslösningen genom att vända den upp och ner innan användning. Ställ tillbaka oanvänt konjugatkoncentrat (R7a) i kylen omedelbart efter användning. För att undvika kontamination av konjugat, använd rena handskar och rör inte pipetternas spetsar. Beredning av konjugatarbetslösning med remsa Antal remsor som ska * 24** användas Mängd koncentrerad konjugat R7a (µl) Mängd konjugatut spädnings-medel R7a (ml) * 1 hel platta ** 2 hela plattor Utspädd substratarbetslösning (R8 + R9) Låt kromogen (R9) och substratbuffert (R8) anta rumstemperatur. Vänd ner kromogen och substratbuffert i blandningen innan användning. Späd kromogen (R9) 1:11 med substratbuffert (R8) för varje remsa som ska testas (exempel: tillsätt 1 ml reagens R9 i 10 ml reagens R8). 10 ml krävs och är tillräckligt för 1 till 12 remsor. Homogenisera. Blanda den utspädda substratarbetslösningen försiktigt innan användning. Vänta fem minuter innan användning. Utspädd substratarbetslösning ska användas inom åtta timmar från beredning och förvaras mörkt i rumstemperatur. Kromogen (R9) ska vara rosa. Annan färg indikerar reagenskontamination : i detta fall har kromogen inte använts. Förbered endast den mängd reagens som ska användas inom 6 timmar och försäkra dig om att volymen med utspädd reagens räcker för hela körningen. Använd följande tabell som en guide : Beredning av utspädd substratarbetslösning med remsa Antal remsor som ska * 24** användas Mängd kromogen (µl)(r9) Mängd substrat buffert (ml)(r8) * 1 hel platta ** 2 hela plattor 9 - FÖRVARING OCH VALIDITET Testet ska förvaras i +2 8 C. Om det förvaras i rätt temperatur kan alla reagenser som ingår användas till det sista förbrukningsdatum som anges påförpackningen (om inga specialinstruktioner anges). R1 :När den vakuumförslutna förpackningen har öppnats kan remsorna användas i upp till 1 månad förutsatt att de förvaras vid +2-8 C i samma väl förslutna förpackning. R2 : Den utspädda tvättlösningen kan förvaras vid rumstemperatur (2-30 C) i 2 veckor. Den koncentrerade tvättlösningen (R2) kan förvaras vid C. R7a + R7b : ktiv konjugatlösning. Skyddas från ljus, både vid rumstemperatur och vid 2-8 C. Konjugatarbetslösning kan användas i 24 timmar om de förvaras vid +2-8 C och 8 timmar om de förvaras vid rumstemperatur (18-30 C). R8 + R9 : Efter rekonstitutionen kan reagensen förvarad i mörker användas i 6 timmar vid rumstemperatur (18-30 C). Efter öppning är alla de övriga reagenserna stabila till och med det bäst före-datum som finns angivet på förpackningen om de förvaras i +2 8 C. 63

8 10 - PROVER Ta ett blodprov enligt de normala rutinerna. Analysen ska utföras på serum eller plasma. Endast följande prover har testats: serum som insamlats i standardrör eller rör som innehåller åtskiljande gel, plasma som insamlats med EDTA eller heparin. Vid användande av plasma som insamlats med citrat eller ACD blir resultaten lägre än de som erhållits med serum för 20%. Prover som innehåller aggregat måste klaras genom centrifugering innan testet utförs. Suspenderade fibrinaggregat eller fibrinpartiklar kan ge falskt positiva resultat. Proverna bör förvaras vid +2 8 C om screeningen utförs inom 7 dagar, eller djupfrysas vid 20 C. Undvik upprepad frysning/upptining. Om proverna ska skickas bör de förpackas i enlighet med föreskrifterna om transport av etiologiska agenser. Transportera dem helst frusna. KOMMENTAR : Prover som innehåller upp till 90 g/l albumin och 100 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triglycerid och hemolyserade prover som innehåller upp till 2,55 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. Använd inte prover som behandlats vid 56 C i 30 minuter. 11. TESTFÖRFARANDE Följ beskrivningen noggrant. Använd negativa och positiva kontrollserum för varje test för att validera testkvaliteten. Handla enligt god laboratoriesed. METOD 1. Definiera noga provfördelnings- och identifieringsplanen. 2. Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur innan du påbörjar analysproceduren. 3. Bered konjugatarbetslösningen (R7a + R7b), utspädd substratarbetslösning (R8 + R9) och spädd tvättlösning (spädd R2) 4. Ta ut mikroplattans ram och de färdiga remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. Ta bort remsor som inte behövs för analysen och byt ut dem mot märkta nollremsor vid behov. 5. Späd prover, kalibratorer och kontroller 3:4 i provspädning R6 och följ en av de två procedurerna nedan : a. Prover, kalibratorer och kontroller kan spädas i brunn (tillsätt 25 µl av provspädning R6 i varje brunn först, och därefter 75 µl prov eller kontroll inom 15 minuter, blanda sedan försiktigt genom minst 2 aspirationer för att undvika skumbildning). b. Prover kalibratorer och kontroller kan förspädas 3:4 i provspädning R6 före tillsats i brunnen (till exempel, späd 150 µl prov i 50 µl provspädning R6, blanda försiktigt för att undvika skumbildning och överför sedan 100 µl till brunnen). OBS : Efter att provet tillsatts ändrar spädningsmedlet färg från lila till blått. Det är möjligt att verifiera förekomsten av prov i brunnarna genom en spektrometrisk avläsning vid 620 nm (se avsnitt 14 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING). 6. Tillsätt direkt, utan föregående tvätt av plattan och i ordningsföljd, beroende på vald metod: Kvalitativ bestämning - Anti-HBs negativ kontroll (C0) i brunn A1, - 10 mie/ml kalibrator (C1) i brunnar B1, C1 och D1, mie/ml kalibrator positiv kontroll (C2) i brunn E1, - Prover i brunnar F1, G1 etc. Kvantitativ bestämning - Anti-HBs negativ kontroll (C0) i brunn A1, - 10 mie/ml kalibrator (C1) i brunnar B1 och C1, mie/ml kalibrator positiv kontroll (C2) i brunn D1, mie/ml kalibrator (C3) i brunn E1, mie/ml kalibrator (C4) i brunn F1, - Prover i brunnar G1, H1 etc. Beroende på systemet som används kan man ändra kontrollernas position eller distributionsordningen. 7. Om det går, täck brunnarna med självhäftande folie genom att trycka över hela ytan. Se till att det blir tätt. 8. Inkubera plattan i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 2 C. 64

9 9. Ta bort den självhäftande folien. Sug upp innehållet i alla brunnarna i en behållare för vätskeformigt avfall och tillsätt omgående minst 0,375 ml tvättlösning i varje brunn. Låt varje brunn stå i blöt i 30 till 60 sekunder mellan varje tvättcykel. Aspirera igen. Upprepa tvättsteget 4 gånger (minst 5 tvättningar). Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka plattan genom att vända den upp och ned på ett absorberande papper.) 10.Om du använder en automatisk tvättanordning följer du samma arbetssätt. 11.Fördela snabbt 100 µl konjugatarbetslösning (R7a + R7b) i varje brunn. Täck, om möjligt, med ny självhäftande folie och inkubera i 60 ± 5 minuter vid 37 C ± 1 C. OBS : Konjugatet är grönfärgat. Det är möjligt att verifiera förekomsten av konjugat i brunnarna genom en spektrometrisk avläsning vid 620 nm (se avsnitt 14 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING). 12.Ta bort den självhäftande folien. Sug upp innehållet i alla brunnarna i en behållare för vätskeformigt avfall och tillsätt omgående minst 0,375 ml tvättlösning i varje brunn. Låt varje brunn stå i blöt i 30 till 60 sekunder mellan varje tvättcykel. Aspirera igen. Upprepa tvättsteget 4 gånger (minst 5 tvättningar). Den återstående volymen måste vara mindre än 10 µl. (Om det behövs kan du torka plattan genom att vända den upp och ned på ett absorberande papper.) 13.Om du använder en automatisk tvättanordning följer du samma arbetssätt. 14.Tillsätt snabbt 100 µl utspädd substratarbetslösning (R8 + R9) i varje brunn. Låt reaktionen fortgå i mörker i 30 ± 5 minuter i rumstemperatur (18 30 C). Använd ingen självhäftande folie under denna inkubering. OBS : Den utspädda substratarbetslösningen är rosafärgad. Det är möjligt att verifiera förekomsten av konjugat i brunnarna genom en spektrometrisk avläsning vid 490 nm (se avsnitt 14 : SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING). 15.Tillsätt 100 µl av stopplösningen (R10). Använd samma ordningsföljd och fördelningshastighet som för den utspädda substratarbetslösningen. Homogenisera reaktionsblandningen. 16.Torka noggrant av mikroplattans botten. Vänta minst 4 minuter efter tillsatsen av stopplösningen innan avläsning görs. Avläs den optiska densiteten vid 450/ nm och 405/ nm med hjälp av mikroplattans avläsare inom 30 minuter efter att reaktionen har avbrutits. Kontrollera korrelationen mellan avläsningen och fördelnings- och identifieringsplanen för mikroplattan och proverna innan resultaten registreras VALIDERING AV RESULTAT FÖR KVALITATIV OCH KVANTITATIV METOD Medelvärdet för absorbans hos 10 mie/ml kalibrator (C1) är gränsvärdet för analysen. För Anti-HBs negativ kontroll (C0) Det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än 0,000 och mindre än eller lika med 0,070. (0,000 < OD C0 0,070). För positiv kontroll (C2) Det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än eller lika med 0,400. (OD C2 0,400). Om något av ovan angivna kriterier för negativ kontroll (C0) och positiv kontroll (C2) inte uppfylls för kvalitativ och kvantitativ metod är analysen ogiltig och måste upprepas. För 10 mie/ml kalibrator (C1) Det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än eller lika med 0,050 och mindre än eller lika med 0,200 (0,050 OD C1 0,200). Varje uppmätt absorbansvärde måste vara större än eller lika med 1,5 av OD för absobansvärdet hos den negativa kontrollen (C0) : OD C1 (1,5 x OD C0 ). Vid kvalitativ metod Om ett av de 10 mie/ml kalibratorgränsvärdena är utanför det acceptabla intervallet (det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än eller lika med 0,050 och mindre än eller lika med 0,200) ska medelabsorbans beräknas från de två återstående absorbansvärdena. Analysen är giltig. Om flera OD C1 -uppmätta värden är utanför det acceptabla intervallet är analysen ogiltig och måste upprepas. Vid kvantitativ metod Om ett av de två OD C1 -uppmätta värdena är utanför det acceptabla intervallet (det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än eller lika med 0,050 och mindre än eller lika med 0,200) är analysen ogiltig och måste upprepas. 65

10 13 - BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTATEN För varje prov kan uppmätta absorbansvärden jämföras med det beräknade gränsvärdet och möjliggör bestämning av närvaro eller frånvaro av anti-hbs antikroppar. 1. Kvalitativ metod Beräkna medelvärdet för det uppmätta absorbansvärdet för 10 mie/ml kalibrator (C1) Exempel : 10 mie/ml kalibrator (C1) B C D Totalt = Medelvärde ODC1 = 0,246 / 3 = 0,082 Om ett av de 10 mie/ml absorbansvärdena är utanför det acceptabla intervallet (det uppmätta absorbansvärdet måste vara större än eller lika med 0,050 och mindre än eller lika med 0,200) ska medelabsorbans beräknas från de två återstående absorbansvärdena. Beräkning av gränsvärdet (CO) Gränsvärdet för analysen är medelabsorbans hos 10 mie/ml kalibrator (C1) : CO = Medelvärde ODC1 Utvärdering av resultaten Prover med absorbansvärden som är större än eller lika med gränsvärdet anses vara reaktiva. Prover med absorbansvärden som är mindre än eller lika med gränsvärdet anses vara icke-reaktiva. De som har värden som är större än avläsarens övre linjäritetsgräns ska rapporteras som reaktiva. KOMMENTAR : På grund av mångfalden av antikroppar och antigener som används i analysen kan resultaten bli olika beroende på vilken analys man väljer. Vaccinationsstrategier : olika rekommendationer föreslås, beroende på vilka regioner och länder som är inblandade. Vid byte av analysmetod under vaccinationsuppföljning måste koncentrationen för anti-hbs antikroppar bestämmas med båda metoderna under en övergångsperiod. 2. Kvantitativ metod För att bestämma koncentrationen av anti-hbs antikroppar i serum- och plasmaprover måste följande anti-hbs-kalibrator användas : C0 (0 mie/ml), C1 (10 mie/ml), C2 (100 mie/ml), C3 (400 mie/ml) och C4 (1000 mie/ml). Kalibratorer tillsätts direkt i varje brunn, utan att plattan först tvättas, och i den ordningsföljd som beskrivs i analysproceduren (se avsnitt 11: TESTFÖRFARANDE). Avläs den optiska densiteten vid 450/ nm med hjälp av en plattavläsare (A450). För fler prover med absorbansvärden (A450) större än eller lika med C3-uppmätt absorbansvärde: A450 ODC3), avläs den optiska densiteten vid 405/ nm. A450 hos fyra kalibratorer C0, C1, C2 och C3 visas i jämförelse med deras tilldelade koncentrationer med hjälp av en polynom (kvadratisk) regression. Observera att A450 hos1000 mie/ml kalibratorn (C4) inte kan användas i detta diagram eftersom det absorbansvärdet skulle hamna utanför spektrofotometerns intervall. Därav behovet av ett andra diagram. Prover med uppmätta absorbansvärden som är mindre än ODC3 tolkas med diagrammet som erhålls med A450 hos de fyra kalibratorerna. A405 hos C3 (400 mie/ml) och C4 (1000 mie/ml) kalibratorer visas i jämförelse med deras tilldelade koncentrationer genom s.k. point to point. En rak linje dras genom dessa punkter. Därefter avläses anti-hbs-koncentrationen (mie/ml) för varje prov där absorbansvärdena korsar varandra. A405- kurvan används för att bestämma koncentrationerna för serum- och plasmaprover vars koncentrationer är större än 400 mie/ml och mindre än eller lika med 1000 mie/ml. Prover med anti-hbs-koncentrationer större än 1000 mie/ml kan spädas med utspädd tvättlösning (utspädd R2) och återanalyseras SPEKTROFOTOMETRISK VERIFIERING AV PROV- OCH REAGENSPIPETTERING (TILLVAL) VERIFIERING AV PROVSPÄDNING (R6) OCH PROVPIPETTERING Efter att provet tillsatts ändrar utspädningsvätskan R6 färg från lila till blått. Förekomsten av prov och utspädningsvätska (R6) i brunnen kan verifieras genom spektrometisk avläsning vid 620 nm: OD-värdet för varje brunn som innehåller prov eller kontroll som spätts ut måste vara större än eller lika med 0,150 (ett värde som är lägre än så är en indikation på dålig fördelning av prov eller kontroll). 66

11 VERIFIERING AV KONJUGATARBETSLÖSNINGSPIPETTERING (R7a + R7b) Konjugatarbetslösningen (R7a +R7b) är grönfärgad. Förekomsten av utspädd konjugatarbetslösning i brunnen kan verifieras med spektrometrisk avläsning vid 620 nm : OD-värdet för varje brunn måste vara större än eller lika med (ett värde som är lägre än så är en indikation på dålig fördelning av konjugatarbetslösningen). VERIFIERING AV PIPETTERINGEN AV DEN UTSPÄDDA SUBSTRATARBETSLÖSNINGEN (R8 + R9) Den utspädda substratarbetslösningen (R8 + R9) är rosafärgad. Förekomsten av rosa framkallningslösning i brunnen kan verifieras genom en automatisk avläsning vid 490 nm : en brunn med framkallningslösning måste ha en optisk densitet som är större än 0,100 (ett lägre OD-värde indikerar dålig fördelning av framkallningslösning). Det blir en signifikant färgförändring för de tomma brunnarna från ofärgat till rosa efter tillsats av preparerad utspädd substratarbetslösning TESTETS BEGRÄNSNINGAR Proceduren och resultatutvärderingen måste följas vid analys av serum- eller plasmaprover för närvaro av antikroppar mot HBs. Användaren av detta test rekommenderas att läsa bipacksedeln noga innan testet genomförs. Testanvisningarna måste följas mycket noga, i synnerhet när det gäller pipettering av prover och reagens, tvättning av plattor och tider vid inkubation. Om anvisningarna inte följs vid tillsättning av prov eller reagens kan testresultaten bli falskt negativa. Vi rekommenderar att prover där det finns en misstanke om felaktigt testförfarande testas på nytt. Faktorer som kan påverka validiteten hos resultaten är: misslyckad tillsats av prov i brunnen, bristfällig tvätt av mikroplatta, att inte följa angivna tider och temperaturer, tillsats av fel reagens i brunnarna, närvaro av metaller eller att stänka blekmedel i brunnarna. På grund av variationerna i immunologisk reaktion från en patient till en annan, såväl efter HBVinfektion som ytterligare vaccination eller terapeutisk immunoglobulininjektion, rekommenderas att tolka resultat med lågt värde med försiktighet TESTRESULTAT Analytiska resultat nedan har erhållits med analysutvärderingar för Monolisa Anti-HBs PLUS. Resultat som erhållits i laboratorium kan skilja sig från dessa. 1. Reproducerbarhet inom testet fem positiva prover och ett negativt prov har testats tio gånger i tre replikat i samma serie. Prov medelvärde OD SD CV % Anti-HBs negativ 0,023 0,003 13,6 Anti-HBs positiv ~ 20 mie/ml 0,143 0,005 3,4 Anti-HBs positiv ~ 50 mie/ml 0,358 0,012 3,3 Anti-HBs positiv ~ 100 mie/ml 0,715 0,019 2,6 Anti-HBs positiv ~ 150 mie/ml 1,231 0,037 3,0 Anti-HBs positiv ~ 300 mie/ml 1,982 0,048 2,4 2. Reproducerbarhet mellan tester Tre positiva prover och ett negativt prov har testats två gånger per dag i duplikat under 20 dagar enligt EP5 NCCLS-proceduren (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) Prov medelvärde OD SD CV % Anti-HBs negativ 0,023 0,004 15,5 Anti-HBs positiv ~ 20 mie/ml 0,146 0,008 5,5 Anti-HBs positiv ~ 150 mie/ml 1,284 0,060 4,9 Anti-HBs positiv ~ 300 mie/ml 2,015 0,067 3,6 3. Precision Kvantitativa resultat anges i mie/ml och är kalibrerade enligt en intern referens, som är kalibrerad i enlighet med första IRP WHO-referensstandarden En korrelationsstudie har utförts genom testning av 0, 10, 100, 400 och 1000 mie/ml-koncentrationer som erhållits med WHO:s internationella standard jämfört med testkalibratorer. 67

12 Korrelationskoefficient och lutningen för den erhållna korrelationslinjen är R2 = 0,99 och en = 0, Analytisk sensitivitet var lägre än 2 mie/ml enligt NCCLS-proceduren KOMMENTAR : Analytisk sensitivitet motsvarar den lägre detektionsgräns som motsvarar den lägre mätbara analytkoncentrationen specifikt från noll, beräknat från medelvärden och standardavvikelser som erhållits med punkterna 0 och 10 mle/ml. 5. Metod linjäritet Fem höga Ant-HBs Ab positiva prover (924 mie/ml, 330 mie/ml, 326 mie/ml, 544 mie/ml och 857 mie/ml) har spätts två gånger upp till 1/32 eller 1/64. Täckningshalten ligger mellan 92% och 116%. 6. Mätområde Mätområdet är mellan 2 och 1000 mie/ml, dvs. mellan den nedre detektionsgränsen och referenskurvans maxpunkt. De titrar som är belägna under detektionsgränsen uttrycks på följande sätt: < 2,00 mie/ml, och de titrar som är belägna över mätområdet uttrycks på följande sätt: > 1000 mie/ml. 7. Hook -effekt Fyra outspädda prover med höga anti-hbs-antikroppskoncentrationer ( mie/ml, 5500 mie/ml, mie/ml och 9000 mie/ml) har testats. Koncentration mie/ml mie/ml 9000 mie/ml 5500 mie/ml DO 450 Avläst vid 405 nm Avläst vid 405 nm Avläst vid 405 nm Avläst vid 405 nm DO Resultat > 1000 mie/ml > 1000 mie/ml > 1000 mie/ml > 1000 mie/ml All hook -effekt har uppvisats under resultatutvärderingen. 8. Specificitet a) 179 patienter med olika sjukdomar (hepatit A, hepatit C, VIH1, VIH2, HTLV, HSV, EBV, rubella, toxoplasmos, myelom (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, cirros och multitransfusion) har testats med Monolisa Anti-HBs PLUS. 21 prover har befunnits positiva med Monolisa Anti-HBs PLUS och två andra CE-märkta anti- HBs detektionsanalyser. 1 ANA-positivt prov har befunnits positivt för anti-hbs Ab enbart med Monolisa Anti-HBs PLUS. 2 ANA-positiva prover har befunnits positiva för anti-hbs Ab med Monolisa Anti-HBs PLUS och ett konkurrerande test. b) Noggrannheten för Monolisa anti-hbc PLUS-testet har bestämts genom analys av blodprov från blodgivare och ej utvalda kliniska patienter. Plats1 Plats 2 Plats 3 TOTALT Blodgivare och sjukhuspatienter Blodgivare Sjukhuspatient Antal prover Antal positiva Specificitet (%) 99,4% 100% 98,7% 99,4% Specificiteten är 99,4 % (98,8 % till 99,8 % med 95 % konfidensintervall). 9. Känslighet 654 prover från olika populationer med vaccinerade eller naturligt infekterade patienter har testats med Monolisa Anti-HBs PLUS och ett annat anti-hbs-test. Icke överensstämmande prover har testats på nytt med en tredje CE-märkt teknik. Monolisa Concordance Patientprofil N Test 1 CE märkt Test 2 CE märkt* Vaccinerad ,8% 99,1% Utredd hepatit B 71 95,8% 100% Kronisk hepatit B % - Sjukhuspatienter ,6% - Totalt ,5% 99,5% Bland dessa 654 testade patienter har 617 befunnits anti-hbs-positiva och 37 -negativa (patienter smittade med kronisk hepatit) med test 1. För dessa 617 patienter är överensstämmelsen 98,4% (97% till 99,2% med 95% konfidensintervall). * Känsligheten hos Monolisa Anti-HBs PLUS är efter analys av icke överensstämmande prover med test 2 99,2% (98,1% till 99,7% med 95% konfidensintervall). 68

13 17 - REFERENSER 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : , Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: , Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : , Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: , Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : , Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: , McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: , Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination United States, MMWR 51(No. 25): , Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: , Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : , Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediateto-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: , U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., (USG PO 530-SW ). 16.Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : ,

14 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

15 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

16 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: