ASPERGILLUS-ANTIGENER

Transkript

1 ASPERGILLUS-ANTIGENER Aspergillus antigens Aspergillus fumigatus antigens Aspergillus fumigatus positive control serum Aspergillus positive control sera SERODIAGNOS AV ASPERGILLOS GENOM IMMUNOPRECIPITATION IVD

2 1- KLINISK BETYDELSE Bio-Rad producerar olika Aspergillus-antigener för serodiagnos av aspergillos genom immunoprecipitation. Det är oftast enklare att diagnosticera aspergillos genom att påvisa specifika antikroppar i sera hos patienter än genom direkt identifiering av fungus. 2- PRINCIP Bio-Rad-antigenerna kan användas i olika immunoprecipitationsreaktioner. Följande två metoder rekommenderas särskilt: IMMUNOELEKTROFORES (IEP) ELEKTROSYNERES (ES) Immunoprecipitationsteknik ökar dessutom den diagnostiska precisionen för aspergillos genom identifiering av specifika antikroppar för två enzymer, kymotrypsin och katalas, som förekommer i antigenextrakt. Dera enzymatiska aktivitet visas i precipitationsbågar. 3- INNEHÅLL Aspergillus fumigatus antigens (Aspergillus fumigatus antigener), kod Två vialer med frystorkade antigener som ska rekonstitueras i 1 ml sterilt destillerat vatten (ca 10 reaktioner). - Aspergillus fumigatus metabolic antigen - Aspergillus fumigatus somatic antigen Aspergillus antigens (Aspergillus antigener), kod Fyra vialer med frystorkade antigener som ska rekonstitueras i 1 ml sterilt destillerat vatten (ca 10 reaktioner). - Aspergillus flavus metabolic antigen - Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen - Aspergillus terreus metabolic antigen Aspergillus fumigatus positive control serum (Aspergillus fumigatus positivt kontrollserum), kod En vial frystorkat anti-aspergillus fumigatus kaninserum som ska rekonstitueras i 1 ml sterilt destillerat vatten. Aspergillus positive control sera (Aspergillus positiva kontrollsera), kod Fyra vialer frystorkat anti-aspergillus kaninserum som ska rekonstitueras i 1 ml sterilt destillerat vatten. - Aspergillus flavus positive control serum 62

3 - Aspergillus nidulans positive control serum - Aspergillus niger positive control serum - Aspergillus terreus positive control serum 4- SAMMANSÄTTNING Antigener (två typer): Metabolisk antigen, erhålls genom filtrering av odlingar efter 10 dagars inkubering vid 30 C. Somatisk eller cellulär antigen erhålls från unga mycelodlingar (3 dagar, utan sporer) som är krossade och blandade vid 30 C. 5- FÖRVARING I frystorkad form är reagenserna hållbara till utgångsdatumet på förpackningen om de förvaras vid +2 8 C på en torr plats. Efter rekonstituering: reagenserna kan förvaras flera månader vid 20 C uppdelad i portioner. Tina inte reagenserna flera gånger. 6- PROVER 1. Tester bör endast utföras på serumprover som tagits i torra rör. 2. Följ rekommendationerna nedan vid hantering, bearbetning och förvaring av serumprover: - Iaktta normala försiktighetsåtgärder vid insamling av serumprover. - Låt proverna koagulera fullständigt före centrifugering. - Rören ska alltid vara förslutna. - Separera serumet efter centrifugering och förvara det i ett tätt förslutet förvaringsrör. - Proverna kan förvaras vid +2 8 C om screeningen sker inom 24 timmar. Om analysen inte kommer att slutföras inom 24 timmar, eller om proverna ska skickas iväg, ska proverna frysas vid -20 C eller kallare. - Tina helst proverna endast en gång. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt efter upptining innan testet utförs. 3. Interferens på grund av höga nivåer av albumin eller bilirubin, lipider, hemoglobin har inte testats. 4. Värm inte proverna. 7- FÖRFARANDE A) NÖDVÄNDIGT MEN EJ BIFOGAT MATERIAL Natrium-barbital Klorvätesyra 63

4 Destillerat vatten Barbital Glycin Tris-buffert 0,05M ph7 Agaros 30 % H 2 O 2 N-acetyl-DL-fenylalanin-naftylester Dimetylformamid Diazoblue B B) IMMUNOELEKTROFORES (foto 1) Immunoelektrofores (Grabar) kan utföras på objektglas för mikroskopisk undersökning. Bered en gel med hjälp av renat agar eller agaros blandat till 1 % med barbitalbuffertlösning ph 8,2 (med tillsats av mertiolat 1/10 000). Skär ut en fördjupning i gelen, 60 mm lång och 2 mm bred samt två hål 2 mm i diameter på var sida om fördjupningen med 4 mm avstånd (se schematisk teckning). Droppa 20 µl outspädd antigen i de två hålen på sidorna. Tillsätt en potential med 5 volt/centimeter i objektglasets ändar i 1 timme och 30 minuter. Placera serumet i fördjupningen i mitten och låt det diffundera i fuktig miljö i rumstemperatur (18 30 C) i 48 timmar. På tredje dagen ska objektglasen sänkas ned i tvättlösning i 24 timmar. Läs av objektglasen på fjärde dagen. En Coomassie Blue-färgning kan vara nödvändig för att kunna läsa av fina detaljer. C) ELEKTROSYNERES (bild 1) Elektrosyneres (Bussard) eller mot-elektrofores kan utföras med agarosgel eller cellulosaacetat. Tekniken är enkel, mycket känslig och snabb, vilket är bra när stora mängder sera undersöks. Med hjälp av agarosgel och mikroskopobjektglas kan hål skäras ut enligt den schematiska teckningen: Placera antigener på katodsidan (-) och sera på anodsidan (+). Hålen som är 2 mm i diameter ska vara åtskilda med 6 mm. Fyll antigenhålen med rena lösningar som är spädda - och +. Fyll serahålen med 20 mikroliter. Tillsätt en 5 volt/centimeter potential i 1 timme och 30 minuter. 64

5 Reaktionen kan vanligtvis avläsas direkt efter migrationen. Om det krävs Coomassie Blue-färgning måste den föregås av två på varandra följande tvättar i fysiologiskt serum (under 1 natt), därefter i destillerat vatten (24 timmar) följt av torkning. Vi rekommenderar testning i parallella positiva kontroller enligt samma förfarande som för antigener. D) IDENTIFIERING AV ENZYMATISK AKTIVITET I VISSA PRECIPITATIONSBÅGAR De vanligast observerade bågarna efter immunoelektrofores kallas C och j (se schematisk teckning) och påvisar enzymatisk aktivitet (C: kymotrypsin och J: katalas). Fler bevis för förekomst av dessa enzymer tillhandahålls av specifika reaktioner (BIGUET et al.) (se bilaga). E) REAGENSBEREDNING 1) BUFFERT - VERONAL ph 8,2 Natrium-barbital 15,85 g HCl 1N 23 ml H 2 O q.s.p ml - BARBITAL- NATRIUM-BARBITAL TRIS-GLYCIN (BBNa TG) ph 8,8 A. Natrium-barbital 65 g Barbital 10,35 g H 2O q.s.p ml B. Glycin 281 g Tris 226 g H 2 O q.s.p ml När likadana delar av lösningarna a och b blandas, erhålls en buffert med ph 8,8 och osmolariteten 0,08. 2) 1 % AGAROS (VIKT/VOLYM) Agaros 10 g H 2 O 500 ml Låt koka upp och kyl därefter ned (till ca 60 C.) Tillsätt barbitalbuffert ph 8,2 500 ml eller BBNa TG-buffert ph 8,8 500 ml (späds med 50 % destillerat vatten). 65

6 3) KATALAS 30 % H 2 O 2, späds med TRIS 0,05M ph7-buffert (0,3 ml H 2 O ml buffert) på immunoelektroforesagaros. Positiv reaktion: bubblor omkring den specifika bågen. 4) KYMOTRYPSIN - LÖSNING A N-acetyl-DL-fenylalanin-naftylester 5 mg Dimetylformamid 2 ml - LÖSNING B Diazoblue B 10 mg Tris-buffert 0,05 M ph 7,4 18 ml Innan lösning A* och B* blandas ska elektrosyneresmembranet inkuberas i 30 minuter vid 37 C i denna blandning. Eliminera blandningen, inkubera över natten vid 37 C i 18 ml B-reagens. Tvätta membranen med vatten. Positiv reaktion: lilafärgade bågar motsvarar kymotrypsin-aktivitet. 66

7 F) ÖVERSIKTSTABELL P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. AV: EXELSEN KROLL-WEEXE. Analys av ASPERGILLUS ANTIGENER (tabell). Buffert Potential Tid Färgning Immunoelektrofores Agaros 1 % / 5 V / cm 90 mn veronalbuffert ph 8,2 Foto 1 Agaros 1 % / BBNa TG-buffert ph 8,8 25 V / cm 60 mn Coomassie Blue Elektrosyneres Agaros 1 % / 5 V / cm 90 mn Pur O O O O O O veronalbuffert ph 8,2 1/2 O O O O O O 1/4 O O O O O O 1 S 2 S 1 ou 2 Sr Agaros 1 % / 10 V / cm 60 mn 1 et 2 : S : Antigener Serum Bild 1 BBNa TG-buffert ph 8,8 Sr : Kontrollserum * Se 6 Förfarande (E Reagensberedning) Coomassie Katalas Agaros 1 % / 5 V / cm 90 mn Spädd H 2 O 2 * veronalbuffert ph 8,2 Positiv reaktion: Foto 2 8- UTVÄRDERING Närvaro av precipitationsbågar vid immunoprecipitationsteknik mot aspergillusantigen indikerar aspergillosinfektion. Eftersom elektrosyneres är snabbare rekommenderas det framför immunoelektrofores för screening. Sera som visar sig vara positiva vid elektrosyneres måste emellertid bekräftas med immunoelektrofores. Enzymatisk aktivitet av kymotrypsin och katalas i vissa precipitationsbågar ger ytterligare bevis på specificiteten. Vid bronkopulmonell eller diffus aspergillos, är tester positiva i % av fallen och specifika bågar kan i allmänhet observeras. Blue bubblor omkring Agaros 1 % / 25 V / cm 60 mn den specifika j- BBNa TG-buffert ph 8,8 bågen Kymotrypsin Agaros 1 % / 5 V / cm 90 mn A*- och B*-reagenser veronalbuffert 8,2 Positiv reaktion: Foto 3 Agaros 1 % / 25 V / cm 60 mn lila färg på den BBNa TG-buffert ph 8,8 specifika C-bågen 67

8 Vid aspergillom har reaktionerna ett högt positivt värde: 5 till 10 bågar och C-båge kan vanligtvis observeras. Vid allergisk aspergillusbronkit är reaktionen positiv i 50 % av fallen. Precipitationsantikroppar uppträder sent i infektionen: i vissa fall påträffas de när en andra screening görs, en månad efter den första undersökningen. 9- TESTRESULTAT/KVALITETSKONTROLL AV TESTET A) PÅVISANDE AV PRECIPITATIONSBÅGAR Testresultatet för Aspergillus-antigener kontrolleras med aspergillos positiva kontrollsera (anti-aspergillus kaninserum som erhålls genom immunisering av djuret med blandade standardiserade A. fumigatus-antigener och med metaboliska standardiserade A. flavus-, A. niger-, A. nidulans- och A. terreusantigener). Påvisande av precipitationsbågar genom immunoelektrofores (ph = 8,2) Positivt kontrollserum Anti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus A. fumigatus + somatisk antigen 4 till 8 bågar A. fumigatus + metabolisk antigen 3 till 5 bågar A. nidulans metabolisk antigen 3 till 5 bågar - - A. niger metabolisk antigen 3 till 5 bågar A. terreus metabolisk antigen 3 till 5 bågar 68

9 B) PÅVISANDE AV ENZYMATISKAKTIVITET PRECIPITATIONSBÅGAR Immunoelektrofores (ph = 8,2) Elektrosyneres (ph 8,2) Påvisande av enzymatisk + katalasaktivitet efter tillsats av H 2 O 2, bubblor omkring j-bågen, visar katalasaktivitet Påvisande av enzymatisk + kymotrypsinaktivitet efter inkubation med reagens A och B, lilafärgad C-båge, visar kymotrypsinaktivitet 10- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och bereds i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio- Rad. 11- ANVÄNDNINGENS BEGRÄNSNINGAR Diagnos på aspergillos ska endast göras efter övervägande av kliniska, radiologiska och biologiska (mikrobiologiska, histologiska, serologiska) bedömningar, varvid varje separat utförd analys ska tolkas med försiktighet. 69

10 12- REFERENSER 1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967) 31, pp DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l immunoprécipitation et de l immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses bronchopulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150 pages. 70

11 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 82

12 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2003 Fax.: +33 (0) code: