VERIFIERING AV ANALYS FÖR KONCENTRATIONSMÄTNING AV BIOLOGISKA LÄKEMEDEL MOHAMAD DAOUD

VERIFIERING AV ANALYS FÖR KONCENTRATIONSMÄTNING AV BIOLOGISKA LÄKEMEDEL MOHAMAD DAOUD Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Biomedicinska Analytiker programmet Mars - Maj 2014 Malmö högskola Hälsa och samhälle 205 06 Malmö

VERIFIERING AV ANALYS FÖR KONCENTRATIONSMÄTNING AV BIOLOGISKA LÄKEMEDEL Mohamad Daoud Daoud, M. Verifiering av analys för koncentrationsmätning av biologiska läkemedel. Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för biomedicinsk vetenskap, 2014. Biologiska läkemedel är stora molekyler som har renats eller producerats från ett biologiskt ursprung. De används idag i stor utsträckning runt om i världen på grund av deras effektivitet att minska symtomen som kan uppstå vid olika mycket svåra sjukdomar. Detta arbete fokuserar på biologiska läkemedel som hämmar cytokinet tumörnekrotisk faktor (TNF). Läkemedlen används bland annat vid svåra autoimmuna sjukdomar. Vid autoimmuna sjukdomar aktiveras cellerna i immunsystemet vilket leder till utsöndring av olika cytokiner till exempel interleukin 1 och TNF. Dessa cytokiner påverkar kroppen på olika sätt genom att aktivera eller inhibera vissa produktionsprocesser i kroppen. Syftet med projektet var att verifiera en cellbaserad metod som används för koncentrationsmätning av det biologiska läkemedlet Infliximab (en TNF antagonist) i patientserum. Metoden som används i detta projekt kallas för reporter gene assay och den baseras på användning av en ilite cellinje. ilite är humana erytroleukemiceller K562 som är transfekterade med nukleär faktor kappa-b. Denna faktor aktiveras när TNF binder sig till TNF receptorer på cellytan. Aktiveringen av denna faktor leder till produktion av enzymet Eldflugeluciferas. Produktionen av enzymet är indirekt proportionell mot koncentrationen av TNF antagonist i serum. Dessutom innehåller cellerna en reporter gen för Renilla luciferas som uttrycks konstant. Renilla luciferas används som en internkontroll för att normalisera variationer som kan orsakas av provhantering samt transfektionseffektivitet. Luminescensen som utvecklas på grund av inverkan av Eldflugeluciferas på luciferas substrat samt inverkan av Renilla luciferas på stopp substrat mäts med hjälp av en luminometer. Dag-till-dag variationen för fem analyserade prov som analyserades vid fyra olika tillfällen var mellan 5-28 %, lot-till-lot variationen för fyra prov som analyserades fyra gånger vid fyra olika tillfällen var mellan 14-21 %. Alla normala serumprover från friska frivilliga blodgivare var negativa med en koncentration av Infliximab mindre än 0,65 µg/ ml. Resultaten visar att metoden är stabil och känslig jämfört med Biomonitors resultat. Dessutom visar resultaten att medelvärden av de olika körningarna från Euro Diagnostica (ett laboratorium som tillverkar immunologiska kit, Malmö) korrelerar väl med resultaten från Biomonitors laboratorium i Köpenhamn. Korrelationen för 19 analyserade prov var 0,99. Nyckelord: Autoimmuna sjukdomar, biologiska läkemedel, cytokiner, Eldflugeluciferas, Renilla luciferas, reporter gene assay och tumörnekrotisk faktor. 2

VERIFICATION OF ANALYSIS FOR CONCENTRATION MEASUR- EMENT OF BIOLOGICAL DRUGS Mohamad Daoud Daoud, M. Verification of analysis for concentration measurement of biological drugs. Degree project in Biomedical Laboratory Science, 15 credits. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2014. Biological drugs are large molecules that have been purified from or produced from a biological origin. They are used in great extent around the whole world because of their efficiency in reducing the symptoms of very severe diseases. The present work focus on biological drugs that inhibit tumor necrosis factor (TNF). Biological drugs are used for treatment of different autoimmune diseases. In autoimmune diseases activated cells of the immune system leads to secretion of various cytokines such as interleukin 1 and TNF. These cytokines affect the body in different ways by activating or inhibiting certain processes in the body. The purpose of this project was to verify a cell-based method which used for concentration measurement of the biological drug Infliximab (a TNF antagonist) in patient serum. The method which used in this project is called the reporter gene assay, and it is based on the use of an ilite cell line. ilite are human erythroleukemia K562 cells which are transfected with the nuclear factor kappa- B. This factor is activated when the tumor necrosis factor binds to its receptors on the cell surface. The activation of this factor leads to the production of the enzyme Firefly luciferase. Production of the enzyme is indirectly proportional to the concentration of TNF antagonist in the serum. Moreover, the cells contain a reporter gene for Renilla luciferase which is under constant expression. Renilla luciferase is used as an internal control to normalize the variations that may be caused by sample handling and transfection efficiency. The luminescence developed due to the influence of Firefly luciferase on luciferase substrate and Renilla luciferase on stop substrate is measured by using a luminometer. Day-today variations for five samples were analyzed at four different times were between 5-28 % while variations of lot-to-lot of 4 samples were analyzed at four different times were 14-21 %. The concentration of Infliximab in all the serum samples from healthy volunteer blood donors were less than 0.65 µg / ml. The results show that the method is robust and sensitive as compared to Biomonitors results. Furthermore, the results show that the mean value of the different runs from Euro Diagnostica (a laboratory that produces immunological kits, Malmö) for day-to-day and lot-to-lot variation agrees quite well with those from Biomonitors laboratory in Copenhagen. The correlation for the nineteen analyzed samples was 0.99. Keywords: Autoimmune diseases, biological drugs, cytokines, Firefly luciferase, Renilla luciferase, reporter gene assay and tumor necrosis factor. 3

FÖRORD Jag skulle vilja tacka mina handledare Lisbeth Witt på Euro Diagnostica samt Anna Laurén på Wieslab för en bra handledning, stöd och hjälp. Jag vill även tacka alla personal som jobbar på båda ställen för deras uppmuntran, stöd dessutom för tillståndet att använda lokaler och material för att kunna utföra projektet på det bästa sättet. 4

INNEHÅLLSFÖRTECKNING FÖRORD... 4 INLEDNING... 6 Tumörnekrotisk faktor... 6 Biologiska läkemedel... 7 Neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar... 7 Tekniker som används för koncentrationsmätning av biologiska läkemedel... 8 Reporter gene assay... 8 Syfte... 8 MATERIAL OCH METOD... 8 ilite TM Infliximab IVD kit... 8 Metod... 9 Provberedning... 9 Tillsats av proverna, kalibratorer, kontroller och TNF-α... 9 Överföring av de olika blandningarna från den genomskinliga plattan till den vita plattan samt tillsättning av ilite TM TNF- α celler... 9 Tillsättning av substrat- och stoppreagens och mätning av luminescensen... 10 Kurvanpassning och beräkning av koncentration... 10 Verifikation av variation... 10 Etisk bedömning... 10 RESULTAT... 10 Korrelation... 10 Dag-till-dag variation... 11 Lot-till-lot variation... 12 Beräkningsmetoder... 13 ilite koncentrationskurvor... 14 Normala serumprover... 15 DISKUSSION... 15 Resultat diskussion... 15 Metoddiskussion... 17 SLUTSATS... 17 REFERENSER... 18 5

INLEDNING Immunsystemet som också kallas för immunförsvaret är ett av de viktigaste systemen hos alla individer. Immunsystemets främsta uppgift är att förhindra infektioner, det vill säga att försvara kroppen från angrepp av patogena mikroorganismer såsom bakterier, virus och svampar [1,2]. Systemet indelas i två delar, den första kallas för medfödda (innate) immunsystemet och den består av monocyter, dendritiska celler, granulocyter, mastceller, NK- celler och vissa lösliga faktorer såsom cytokiner, antimikrobiella peptider och komplementpeptider. Den andra delen kallas för det förvärvade (adoptiva) immunsystemet och den består av lymfocyter samt några lösliga faktorer såsom antikroppar och cytokiner [1-4]. Vid ett angrepp (infektion), immunaktivering eller en vävnadsskada påbörjar kroppen en försvarsreaktion det vill säga en inflammation för att förhindra spridning av skadan eller infektionen. Aktiveringen av inflammationsreaktionen leder till ett ökat blodflöde till det skadade området vilket blir svullet, rött och varmt [1-5]. Immunförsvaret kan i vissa fall reagera på ett felaktigt sätt så att immunreaktionen vänds mot kroppens egna organ. I detta fall riktas antikroppar och aktiverade T- lymfocyter mot kropps egna antigener och aktiverar inflammatoriska molekyler och celler. När dessa celler och molekyler blir aktiverade sker en nedbrytning av det attackerade organet. Sjukdomarna som orsakas av en felaktig funktion av det förvärvade immunförsvaret kallas för autoimmuna sjukdomar [1,2,4]. Under de senaste trettio åren har studier visat att vissa autoimmuna sjukdomar såsom inflammatoriska tarmsjukdomar, artritsjukdomar och inflammatoriska hudsjukdomar är närbesläktade eftersom de har samma verkningsmekanism på både cellulär och molekylär nivån [6]. Vid en autoimmunreaktion aktiveras cellerna i immunsystemet på samma sätt som vid en bakterieinfektion. När cellerna blir aktiverade utsöndras interleukin 1 (IL 1) och tumörnekrotisk faktor (TNF) [1,4,7]. Forskning om TNF som även benämns TNF alfa har visat att den spelar en stor roll och är inblandad i patogenesen av de nämnda inflammatoriska sjukdomarna [6, 8]. Tumörnekrotisk faktor TNF är ett cytokin som utsöndras av makrofager, monocyter, aktiverade T-celler, mastceller med mera. Det produceras i höga halter vid autoimmuna reaktioner, vävnadsskada samt vid igenkänning av mikrober [1, 4, 7]. När translationen av mrna av TNF aktiveras produceras ett trimeriskt pro-tnf protein. Pro-TNF saknar signaleringsförmåga och den införs i plasmamembranet i form av en cellbunden TNF (tmtnf, en homotrimer av 26- kda) [6]. Lösligt TNF (stnf, en homotrimer av 17- kda) frisätts från cellerna när TNF- alfa konverting enzym (TACE) klyver tmtnf från cellytan [6]. Båda formerna (stnf och tmtnf) är biologiskt aktiva och deras aktivitet och mängd är beroende på bland annat inblandade celltyper, mängden av aktivt TACE och hur cellerna blir aktiverade. Deras ligander kan interagera med de två TNF receptorerna (TNFR1 och TNFR2) som uttrycks på en stor del av cellerna [6]. 6

stnf kan binda till båda receptorerna men den största delen av dess biologiska aktivitet förmedlas genom TNFR1. tmtnf kan fungera både som en ligand och en receptor det vill säga den förmedlar sina proapoptotiska och inflammatoriska aktiviteter genom en reverssignalering via tmtnf eller genom TNFR2. Beroende på cellernas metaboliska tillstånd kan receptor-medierade effekter av stnf och tmtnf leda till aktiveringen av nukleär faktor kappa-b (NF-κB) [6]. Aktiveringen av cellerna i immunsystemet leder till en snabb produktion av TNF och IL-1. Dessa cytokiner tillsammans kallas för proinflammatoriska cytokiner eftersom de bidrar till uppkomsten av inflammation [1,4,9]. TNF fungerar som ett immunstimulerande och immunsuppressivt medel eftersom den påverkar cellerna i kroppen på olika sätt. Vissa celler ökar sin produktion av till exempel interleukin och akutfasproteiner medan aktiviteten av andra celler inhiberas [2,4,10,11]. Biologiska läkemedel De är stora molekyler som innehåller ett komplexsubstans som är biologiskt aktivt till exempel proteinstruktur baserad på peptider från mus eller människa och som har renats från eller producerats i ett biologiskt ursprung (vävnad eller levande celler) [6,12]. TNF antagonister är biologiska läkemedel som används vid till exempel autoimmuna sjukdomar för att minska sjukdomens aktivitet [10]. Nu förtiden finns fem olika TNF antagonister såsom Infliximab, Adalimumab, Golimumab, Etanercept och Certolizumab [6,13]. Antagonisternas uppgift är att binda TNF molekylerna (stnf och tmtnf) och på så sätt hämmar de bindningen mellan dessa molekyler och sina receptorer på cellytan. Detta leder till en minskning i aktiveringsprocesser i cellerna och även symtomen som kan uppstå vid autoimmuna sjukdomar [6,13]. Enligt socialstyrelsen i Sverige är TNF antagonister mest kostnadsdrivande läkemedlen (ungefär 12 % av den totala förmånskostnaden). De har ett försäljningsvärde på drygt två miljarder kronor per år, det vill säga genomsnittligt ungefär 130,000 kronor per patient varje år [14]. I vissa fall fungerar inte antagonisterna på det sättet som förväntas, det vill säga en del av patienter (30 %) svarar inte på behandling på grund av immunogenicitet, farmakokinetiska och farmakodynamiska interaktioner [13,15]. Immunogenicitet innebär att patienter bildar antikroppar (Anti drug antibodies ADAb) mot läkemedlet eftersom dessa molekyler kan framkalla ett immunsvar [13,15,16]. Farmakokinetiska effekter innebär en förändring i läkemedlets koncentration och kan bero på förändringar i distribution, upptag och eliminering av läkemedlet i blodet [15]. Farmakodynamiska interaktioner medför en förstärkning eller försvagning av läkemedlets effektivitet utan att koncentrationen av läkemedlet förändras i blodet och kan till exempel bero på att TNFs betydelse vid inflammationen hos den individuella patienten har förändrats [15]. Patienter som inte svarar på behandling med en antagonist på grund av utveckling av ADAb bör byta läkemedlet med en annan antagonist [15]. I de fallen koncentrationen av läkemedlet i blodet är låg bör dosen höjas så att den ligger inom det rekommenderade intervallet [15]. Neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar Antagonisterna kan som andra biologiska molekyler aktivera immunförsvaret. Aktiveringen av immunförsvaret leder till bildning av två olika typer av antiläkemedels antikroppar. En typ binder till läkemedlet utan att påverka dess 7

terapeutiska aktivitet, de kallas för icke-neutraliserande antikroppar. Den andra typen av antikroppar kallas för neutraliserande antikroppar (NAbs) eftersom de binder till det aktiva sätet i läkemedlets molekyl [16]. Dessa antikroppar blockerar bindningen mellan TNF molekyler och antagonister det vill säga TNF kan binda sig till sina receptorer på cellytan, aktivera och inhibera vissa processer i cellerna samt påbörja en inflammationsprocess [1,4]. Tekniker som används för koncentrationsmätning av biologiska läkemedel Nuförtiden används olika metoder för koncentrationsmätning av Infliximab i patientserum såsom fastfas ELISA, vätske radioimmunoanalys (RIA) och reporter gene assay. Den första metoden innebär en bindningsreaktion mellan antikroppar och antigener, den andra metoden innebär användning av ett radioaktivt ämne medan reporter gene assay (RGA) innebär användning av en ilite cellinje [15]. Reporter gene assay RGA är en analys som utförs med en in vitro ilite TNF reporter cellinje [15,17]. Analysen används för att mäta koncentrationer av både TNF antagonister och NAbs i serumprover [13,17]. Reporter celler är humana erytroleukemi celler K562 som är transfekterade med NFκB [15,17]. I detta cellsystem kontrollerar NFκB reporter genkonstruktion av Eldflugeluciferas [15,17]. Dessutom innehåller cellerna Renilla luciferas reporter gen som kontrolleras av en konstitutiv promotor det vill säga den uttrycks hela tiden [15,17,18]. Renilla luciferas används i denna metod som en internkontroll för att normalisera variationer som kan orsakas av provhantering samt transfektionseffektivitet [18]. Cellerna är stoppade i sin normala cellcykel för att cellerna ska kunna tillverka samma mängder av Renilla luciferas [13]. De blir aktiverade när TNF molekylerna binds till sina receptorer på cellytan [17]. Aktiveringen av cellerna leder till produktion av enzymet Eldflugeluciferas som är direkt proportionell mot TNF koncentration men omvänt proportionell mot koncentrationen av Infliximab i serumet [13,15,17]. Syfte Syftet med projektet var att verifiera en cellbaserad metod som används för analys av serumprover från patienter som går på behandling med TNF antagonist. Studien syftar dessutom till att undersöka om metoden kan etableras på laboratoriet för att underlätta uppföljningen av läkemedlets effektivitet. MATERIAL OCH METOD ilite TM Infliximab IVD- kit Kitet (Biomonitor Ltd, Galway, Irland, referensnummer 90-88) innehåller två mikrotiterplattor (en vit och en genomskinlig platta), ilite TM TNF-α celler, TNF-α (8ng/ ml), DIL A (RPMI), DIL B (92 % RPMI + 8 % normal human serum), Dual- Glo luciferasbuffert, Dual- Glo luciferassubstrat, Dual- Glo Stop & Glo -buffert, Dual- Glo Stop & Glo -substrat, en positiv och en negativ kontroll samt sex kalibratorer (A-F) med följande koncentrationer av Infliximab 50, 40, 30, 20, 10 och 5 ng/ ml. Dessutom användes in-house reagenser med ett annat lotnummer (Biomonitor, Köpenhamn). 8

De övriga materialen som krävdes var extra ilite TM TNF-α celler med tre olika lotnummer, en luminometer (Molecular Devices, United Kingdom), en spädningsplatta, pipetter med olika volymer, polypropylenrör och en koldioxid inkubator. Dessutom användes tjugo serumprover från friska frivilliga personer (Blodcentralen, Växjö) det vill säga serum är fritt från Infliximab. För verifiering av Infliximab koncentrationsresultat användes nitton serumprover från patienter som går på behandling med Infliximab och som redan analyserats på Biomonitor i Köpenhamn där resultatet finns sparat i Wieslabs labdatasystem. Metod Metoden kan delas in i fyra olika moment enligt Biomonitors bruksanvisning för koncentrationsmätning av Infliximab (ilite TM Infliximab - IVD- kit, Biomonitor, Galway, Irland) [19]. Provberedning Proverna rumstempereras och blandas med hjälp av en vortex. Reagenserna (DIL A och DIL B), kalibratorerna, TNF-α och kontrollerna tinas, rumstempereras och blandas ordentligt medan cellerna och substratreagenser förvaras i frysen under detta steg. Proverna späds till fyra olika spädningar med DIL B respektive DIL A i en mikrotiterplatta enligt följande tabell. Tabell 1. Visar hur spädningsprocessen av proverna går till Spädning Volym av DIL B µl Provvolym µl Volym av DIL A µl Spädningsfaktor Sp a I 230 20 ospätt serum -- 12,5 Sp II -- 100 µl av sp I 150 31,3 Sp III -- 100 µl av sp II 150 78,3 Sp IV -- 100 µl av sp III 150 195 a. spädning Tillsats av proverna, kalibratorer, kontroller och TNF-α Till den genomskinliga mikrotiterplattan sätts 100 µl från varje kalibrator, kontroll samt från varje av de fyra spädningarna av proverna. Därefter tillsätts 100 µl av TNF-α till samtliga brunnar, plattan förses med lock och brunnarnas innehåll blandas genom en försiktig skakning av plattan eller med hjälp av en skakningsapparat vid en låg hastighet. Plattan inkuberas därefter i inkubatorn i 30 minuter vid 37 C i 5 % koldioxid. Överföring av de olika blandningarna från den genomskinliga plattan till den vita plattan samt tillsättning av ilite TM TNF-α celler Under inkubationen av plattan i föregående steg tinas cellerna snabbt i ett vattenbad vid 37 C. Vialen vänds några gånger för att få en jämn cellsuspension. Från den genomskinliga plattan överförs 50 µl i duplikat till den vita plattan med hjälp av en automat multikanal pipett. Cellsuspensionen (1,5 ml) överförs till ett rör som innehåller 6 ml av DIL B så att cellsuspensionen späds 1:5. Röret vänds upp och ner några gånger för att säkerställa en jämn cellsuspension. Därefter tillsätts 50 µl av den spädda cellsuspensionen till samtliga brunnar i plattan. Locket sätts tillbaka på plattan och den inkuberas i tre timmar vid 37 C i 5 % koldioxid. Substratreagenserna plockas ut ur frysen och rumstempereras. 9

Tillsättning av substrat- och stoppreagens och mätning av luminescensen Hela mängden av Dual- Glo luciferasbuffert överförs till vialen av frystorkat Dual- Glo luciferassubstrat. Sedan överförs hela innehållet av Dual- Glo Stop & Glo -substrat till vialen av Dual- Glo Stop & Glo - buffert. Båda vialerna blandas ordentligt och skyddas från ljuset med hjälp av en aluminiumfolie. Plattan plockas ut från inkubatorn och därefter tillsätts 80 µl av Dual- Glo luciferasreagens till varje brunn. Plattan förvaras efteråt mörkt i tio minuter vid rumstemperatur. Luminescensen som utvecklas i varje brunn på grund av inverkan av Eldflugeluciferas på substratet mäts med hjälp av luminometern. Efter mätningen av luminescensen tillsätts 80 µl av substrat 2 till alla brunnar. Plattan förvaras mörkt i tio minuter vid rumstemperatur och luminescensen mäts igen efter inkubationen. Luminescensen som utsöndras i detta steg är från inverkan av renilla luciferas på sitt substrat. Kurvanpassning och beräkning av koncentration Biomonitors beräkningsprogram är en excelmall med möjlighet att välja linjär och fyra parametrar logistik (4PL) kurvanpassning. Koncentrationen bestäms för alla fyra spädningarna av provet mot kalibratorkurvans kurvanpassning. Den slutliga koncentrationen av provet ges av beräkningsprogrammet och motsvarar provet med högsta koncentrationen av Infliximab av de fyra spädningarna för provet som ligger inom avläsningsintervall. Programmet meddelar dessa värden utan att kontrollera erhållna värden av de andra spädningarna. Detta ger inte en bra bild på koncentrationen av Infliximab i patientserum. Därför krävs ytterligare en manuell avläsning av erhållna resultat från programmet. Normaliserade TNF aktivitet beräknas genom kvoten mellan TNF aktivitet (Eldflugeluciferas aktivitet) och Renilla luciferas aktivitet. Verifikation av variation Metoden användes för bestämning av både dag-till-dag och lot-till-lot variation. Dag-till-dag variation mäter hur koncentrationen av Infliximab varierar när samma prover körs några gånger med samma kit lotnummer. Lot-till-lot variation mäter hur koncentrationen av Infliximab varierar när proverna analyseras med olika cell lotnummer. Etisk bedömning Ingen etisk prövning behövdes för detta projekt eftersom serumproverna som används är avkodade och anonyma och resultaten kan inte kopplas till en specifik person. RESULTAT Korrelation Nitton serumprover från patienter som går på behandling med Infliximab och har redan analyserats på Biomonitor i Köpenhamn där resultaten finns sparade i Wieslab labdatorsystem. Dessa serumprover analyserades även hos Euro Diagnostica i Malmö. Proverna har olika koncentrationer av Infliximab, det vill säga vissa prover har för låga (mindre än 0,65µg/ml) medan andra har för höga (mer än 31µg/ml) koncentrationer av Infliximab och resten av proverna med värden däremellan. I tabell 2 finns erhållna resultat av samtliga prover efter 10

manuell avläsning från både Biomonitor och Euro Diagnostica. Koncentrationen av Infliximab är i µg/ ml och den avlästes mot ilite kalibratorkurva efter maskering av både den högsta och lägsta kalibratorn (A och F). ILite koncentrationskurvan som användes i detta försök är linjär kurvanpassning. Tabell 2. Visar erhållna resultat av koncentrationer av Infliximab (µg/ ml) i nitton serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab. Dessutom erhållna resultat av samtliga serumprover från Biomonitor. Prov Biomonitor µg/ml Euro Diagnostica µg/ml Prov Biomonitor µg/ml Euro Diagnostica µg/ml 4 < 0,65 < 0,65 17 >31 24,8 5 < 0,65 < 0,65 19 1,13 1,29 6 < 0,65 < 0,65 21 4,20 5,73 7 8,51 9,12 24 26,5 23,98 8 4,60 4,51 25 9,91 9,75 9 >31 >31 27 20,1 19,72 10 4,62 3,82 30 8,62 8,05 11 < 0,65 < 0,65 33 11,0 10,14 12 3,61 3,90 40 3,90 3,12 13 4,14 3,97 Figuren nedan visar sambandet mellan erhållna resultat från Biomonitor och Euro Diagnostica efter en manuell avläsning. Figuren visar även hur erhållna resultat stämmer med varandra genom R 2 som är 0,9828. Korrelationen för de nitton serumproverna är 0,99. Figur 1. Visar en jämförelse av erhållna resultat av nitton serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab mellan Biomonitor och Euro Diagnostica. Figuren visar att resultaten korrelerar väl med varandra. Dag-till-dag variation Fem prover valdes ut från föregående körning och analyserades ytterligare tre gånger med samma kit lotnummer. Tabellen nedan (tabell 3) visar värdena som beräkningsprogrammet valde (beräkningsmallens avläsning) ur ilite 11

Prov Prov koncentrationskurva. ilite koncentrationskurva som användes för avläsning är linjär mellan 10 µg/ml och 40 µg/ml, det vill säga efter maskering av både den högsta och lägsta kalibratorn A och F. Tabellen visar även medelvärde samt standardavvikelse av de fyra körningarna av varje prov. Tabellen visar att koncentrationerna av samtliga prover är låga och stämmer ganska bra med varandra. Värdena för fyra prover varierar mellan 6-15 % medan värdena för det femte provet varierar med 28 %. Tabell 3. Visar erhållna resultat av beräkningsmallen avläsning av koncentrationen av Infliximab (µg/ ml) i fem serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab. Försök Medelvärdet SD CV % A002 & A003 A004 A005 A006 µg/ ml 8 1,43 1,30 1,63 1,83 1,55 0,232 15 10 1,44 1,66 1,54 1,93 1,64 0,212 13 13 1,64 1,55 1,81 1,89 1,72 0,155 9 19 0,94 1,46 1,03 1,72 1,29 0,367 28 25 9,98* 1,75 1,7 1,92 1,79 0,115 6 *räknas inte med i medelvärdet och standardavvikelse Tabell 4 visar koncentrationer av Infliximab i samtliga serumprover efter en manuell avläsning av erhållna resultat från ilite koncentrationskurvan. Tabellen innehåller även medelvärde och standardavvikelse av de fyra körningarna av samtliga serumprover. Dessutom innehåller tabellen erhållna resultat från Biomonitor efter en manuell avläsning det vill säga värdena som finns sparade i Wieslabs datasystem. Tabellen visar att det inte finns en stor variation i koncentration av Infliximab mellan de fyra körningarna jämfört med Biomonitors resultat. Värdena för fyra prover varierar mellan 5-13 % medan värdena för det femte provet varierar med 28 %. Tabell 4. Visar erhållna resultat av manuell avläsning av koncentrationen av Infliximab (µg/ ml) i fem serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab. Försök Medelvärdet Biomonitor SD CV % A002 & A003 A004 A005 A006 µg/ ml µg/ml 8 3,91 4,77 4,84 4,54 4,52 0,42 9 4,60 10 3,65 3,79 3,79 4,12 3,84 0,20 5 4,60 13 3,84 3,81 3,76 6,52 3,98 0,36 9 4,10 19 0,94 1,46 1,03 1,72 1,29 0,37 28 1,13 25 9,98 9,63 8,15 11,22 9,75 1,26 13 9,90 Lot-till-lot variation Fyra prover valdes ut från första körningen och analyserades ytterligare tre gånger med tre olika cell-lotnummer. Tabell 5 visar erhållna resultat av koncentrationer av Infliximab i samtliga serumprover som bestämdes av beräkningsprogrammet. Dessutom innehåller tabellen medelvärden och standardavvikelse av fyra körningar av varje prov. Värdena avlästes på samma sätt som dag till dag variation. Tabellen visar att koncentrationerna av samtliga prover är låga och stämmer ganska bra med varandra. Värdena varierar mellan 8-21 %. 12

Prov Prov Tabell 5. Visar erhållna resultat av beräkningsmallen avläsning av koncentrationen av Infliximab i fyra serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab. Varje serumprov körs fyra gånger med fyra olika cell-lotnummer Lottnummer 1329602 1334307 1335101 1331202 *Körs inte med detta lottnummer Medelvärdet µg/ ml SD CV % 8 1,55 1,44 1,37 1,81 1,54 0,19 13 13 1,72 1,50 1,50 1,79 1,62 0,15 9 19 1,29 0,88 0,95 * 1,04 0,22 21 25 1,79 1,61 1,75 1,96 1,78 0,14 8 Tabell 6 visar koncentrationer av Infliximab i de samtliga serumprover efter manuell avläsning av erhållna resultat från ilite koncentrationskurvan. Tabellen innehåller även medelvärde och standardavvikelse av samtliga serumprover av de fyra körningarna. Dessutom innehåller tabellen erhållna resultat från Biomonitor det vill säga värdena som finns sparade i Wieslabs datasystem. Värdena avlästes efter maskering av den högsta och lägsta kalibratorn (A och F). Tabellen visar att det finns en liten variation i koncentration av Infliximab mellan de fyra körningarna jämfört med Biomonitors resultat. Värdena varierar mellan 14-21 %. Tabell 6. Visar erhållna resultat av manuell avläsning av koncentrationen av Infliximab (µg/ ml) i fyra serumprover som tillhör patienter som går på behandling med Infliximab. Lottnummer 1329602 1334307 1335101 1331202 Medelvärdet µg/ ml SD CV % Biomonitor µg/ ml 8 4,52 3,54 3,11 4,59 3,94 0,73 19 4,60 13 3,98 3,35 2,84 3,69 3,47 0,49 14 4,10 19 1,29 0,88 0,95 * 1,04 0,22 21 1,13 25 9,75 7,34 6,78 8,93 8,20 1,38 17 9,90 *Körs inte med detta lotnummer Beräkningsmetoder Biomonitors beräkningsprogram ger möjlighet att välja mellan två olika kurvanpassningar. Båda metoderna använder rådata från luminometern men de behandlar resultatet på olika sätt. Den ena använder en linjär kurvanpassning av kalibratorerna B till E. Den andra metoden använder en fyra parametrar logistisk (4PL) kurvanpassning. Tabellen nedan visar en jämförelse mellan erhållna resultat från båda beräkningsmetoderna av proverna i försök A008 och erhållna resultat från Biomonitor (Tabell 7). 13

Tabell 7. Visar en jämförelse av erhållna resultat från två olika beräkningsmetoder som använder två olika kurvformer och erhållna resultat från Biomonitor. Linjär beräkningsmetod 4PL beräkningsmetod (µg/ Biomonitor (µg/ ml) Prov (µg/ ml) ml) 8 4,59 4,05 4,61 9 >31 >31 >31 11 <0,65 <0,65 <0,65 13 3,69 3,64 4,11 24 23,98 24,16 26,5 25 8,93 8,66 9,90 27 19,72 18,42 20,10 30 8,05 7,55 8,62 40 3,12 2,92 3,90 ilite kalibratorkurva Kurvformen i det högre koncentrationsintervallet av kalibratorkurvan varierade mycket mellan försöken vilket gör att kurvanpassningen varierar. Vissa försök gav en kurva med "hook" (figur 2) medan andra försök gav en mer planande kurva (figur 3) R 2 = 0,99 Figur 2. Visar ett exempel på hur ilite koncentrationskurvan böjs i de första fyra försöken (A002- A005). Blå linje är resultat på kalibrator (CAL-curve) medan röd linje är resultat för de fyra olika spädningarna av provet (Trendline). 14

Figur 3. Visar ett exempel på hur ilite koncentrationskurvan planar sig i slutet i de sista tre försöken (A006-A008). Blå linje är resultat på kalibrator (CAL-curve) medan röd linje är resultat för de fyra olika spädningarna av provet (Trendline). Normala serumprover Nitton normala serumprover från friska frivilliga blodgivare som köptes från blodcentralen i Växjö kördes på samma sätt som patienternas serumprover. Erhållna resultat visar att alla körda prover är normala och ligger under 0,65 µg/ml. DISKUSSION I detta projekt analyserades serumprover som tillhör patienter som går på behandling med TNF antagonist (Infliximab) med hjälp av en cellbaserad metod, RGA. Ett antal försök utfördes i detta projekt för att kontrollera hur koncentrationer av Infliximab i serumproverna förändras vid användning av reagenser och celler med olika lotnummer. Resultat diskussion Erhållna resultat av koncentrationer av Infliximab i nitton serumprover från både Euro Diagnostica och Biomonitor stämde väl överens med varandra. Manuell avläsning av erhållna resultat visade ingen stor skillnad mellan laboratorierna. Korrelationen för de nitton analyserade serumproverna var 0,99 samt R 2 var 0,98. Detta bevisar att resultaten stämmer överens med varandra, det vill säga resultaten är tillförlitliga. I försöket dag-till-dag variation analyserades fem serumprover fyra gånger med samma kit lotnummer. Försöket utfördes för att studera hur resultaten varierar när proverna analyserades vid olika tillfällen. Erhållna resultat som själva programmet har avläst efter bearbetning av rådata är låga och ger inte en riktig bild av den riktiga koncentrationen av Infliximab i serumproverna. Detta beror på att beräkningsprogrammet alltid meddelar värdet som motsvarar provet med den högsta koncentrationen av Infliximab (av de fyra spädningarna för provet om det ligger inom avläsningsintervall). Värdet meddelas utan att programmet 15

kontrollerar erhållna värden av de andra spädningarna. När en manuell avläsning av bearbetade rådata utfördes registrerades nya värden för Infliximab i de samtliga serumproverna. Värdena för prover 8, 10, 13 och 25 avviker mellan 5 och 13 procent medan värdena för provnummer 19 avviker 28 procent. Enligt bruksanvisning var detta försök godkänt eftersom variationer i värdena mellan dagarna var mindre än 25 procent i samtliga prover förutom provnummer 19. Halten av Infliximab i provnummer 19 var låg och en orsak kan ha varit ett pipetteringsfel som kan leda till den stora variationen. Medelvärdet av de fyra körningarna av samtliga serumprover stämmer bra med erhållna resultat från Biomonitor. I försöket lot till lot variation valdes fyra serumprover ut från första körningen och analyserades ytterligare tre gånger med tre olika cell-lotnummer vid tre olika tillfällen. Detta försök utfördes för att kontrollera hur resultaten påverkas när serumproverna analyseras med dessa celler. Erhållna resultat från detta försök visade att koncentrationer av Infliximab i de fyra körningarna avvek mellan 14 och 21 procent vilket är godkänt enligt bruksanvisningen. Rådata från luminometern kan bearbetas på två olika sätt med hjälp av Biomonitors program, det vill säga med två olika beräkningsmetoder. Erhållna resultat från båda beräkningsmetoderna av försöket A008 stämmer relativt med varandra. Detta beror på att båda metoderna tar emot rådata från luminometern men motsvarande koncentrationer av Infliximab avläses ur olika kurvformer. Erhållna resultat för samtliga serumprover från Biomonitor stämmer väl med erhållna resultat från Euro Diagnostica. De båda metoderna (linjär och fyra parametrar logistisk beräkningsmetoder) visar likartade resultat, därmed kan båda metoderna användas på laboratoriet. Med syftet att följa läkemedlets effektivitet är det bättre att välja en metod och använda den systematiskt. ilite koncentrationskurvorna från de körda försöken indelas i två olika former. De första fyra försöken (A002-A005) som kördes med samma kit lotnummer har en ilite koncentrationskurva som böjs i slutet. Resten av försöken (A006-A008) har en koncentrationskurva som planar ut sig i slutet. Detta kan bero på bland annat användning av celler samt reagenser med olika lotnummer från olika ställen. De första fyra försöken (A002- A005) kördes med samma reagens lotnummer från Galway i Irland, A006 och A007 kördes också med reagenser från Galway i Irland men med ett annat lotnummer medan A008 kördes med Hepesbuffrade reagenser från Biomonitor i Köpenhamn. Dessutom kördes försöken A002-A005 med samma cell lotnummer medan resten av försöken (A006, A007 och A008) kördes med andra tre olika cell-lotnummer. Användning av celler med olika lotnummer är ger sämre resultat än användning av reagenser med olika lotnummer på grund av skillnad i transfektionseffektivitet. Att koncentrationskurvan böjs i slutet är ett problem eftersom den varierande kurvformen gör avläsning av prover i det höga området blir osäker och subjektiv. Orsaken för detta skulle kunna bero på att CO2 inkubatorn inte håller CO2 nivån stabil och att ph i DIL (A/B) som är cellodlingsmedium (RPMI) då inte blir korrekt. Celler kan vara känsliga för variation för ph i odlingsmedium. Den misstanken stärks av att Hepesbuffrade buffertar ger en bättre kurvform. 16

På Euro Diagnostica utfördes en manuell avläsning av bearbetade rådata. Därefter skickades både rådata och resultatet till Biomonitor i Köpenhamn för att validera de valda värdena. På Euro Diagnostica fick 62 värden godkänt av 72 medan hos Biomonitor i Köpenhamn fick endast 39 värden av 62 godkänt. Detta betyder att bara 63 % av erhållna resultat på Euro Diagnostica fick Biomonitors godkännande. Detta kan bero på att den manuella avläsningen av resultatet är subjektivt, det vill säga två personer kan tolka resultatet på två olika sätt beroende av deras erfarenhet. Resten av värdena som inte fick godkänt i båda laboratorierna kan bero på att dubbelproverna avviker mer än 20 % från varandra. Tio prover av 72 (14 %) borde köras om enligt Euro Diagnostica medan enligt Biomonitor borde 24 prover av 72 (33 %) köras om eftersom kurvan har en liten böjning i slutet. Erhållna resultat av de tjugo normala serumproverna visar att koncentrationer av Infliximab i samtliga serumprover ligger under 0,65 µg/ ml, det vill säga ingen av de blodgivarna använder Infliximab. Metoddiskussion Metoden fungerar otrolig bra särskilt i de sista tre försöken på grund av användning av automatiserad multikanalpipett samt reagenser med olika lotnummer. Metoden är oerhört känslig och en liten variation i koncentrationen av Infliximab kan detekteras. Metoden är dyr eftersom varje kit kostar ungefär 9000 kronor och den kan användas för att mäta koncentrationer av Infliximab i enbart tio serumprover. En variant skulle kunna vara att först screena proverna vid en spädning istället för vid fyra olika spädningar, men resulten visar att en stor del av proverna bör analyseras vid flera spädningar för att hamna innanför korrekt avläsningsintervall. Dessutom är metoden tidskrävande på grund av en lång inkubationstid. Cellerna kan inte odlas vidare samt måste användas inom 30 minuter på grund av att de är stoppade i sin normala cellcykel. Felkällor som kan förekomma i metoden är att tiderna för varje moment inte hålls, att cellerna inte tinas tillräckligt snabbt eller att de får stanna länge i vattenbadet innan användning. Pipetterings fel är även det en vanlig felkälla eftersom det är små volymer som används i försöket. Dessutom leder felanvändning av reagenserna till falska förhöjda värden. SLUTSATS ilite infliximab assay är ett känsligt och pålitligt test som kan användas för koncentrationsbestämning av infliximab i patientblod. Resultaten som uppnåddes i detta projekt stämmer väl med Biomonitors resultat och projektrapporten kommer att vara underlag för beslutet om etablering av metoden på Wieslabs laboratorium. 17

REFERENSER 1. Truedsson L, Ernerudh J, Hammarström L, Winqvist O, Skogh T, Van Hage M, Dahle C, Skattum L, Rönnelid J, (2012) Klinisk immunologi, Estonia, Pagroup. 2. Ericson E, Ericson T, (2011) Klinisk mikrobiologi infektioner immunologi vårdhygien, Egypten, Sahara. 3. Abbas A, Lichtman A, (2011) Basic aimmunology Functions and Disorders of the Immune System, China, Saunders Elsevier. 4. Wold A, Mölne J,(2012) Inflammationssjukdomar, Kina, Liber. 5. Hedner L, (2007) Invärtesmedicin, Poland, Pozkal. [5] 6. Tracey D, Klareskog L, Sasso E, Salfeld J, Tak P, (2008) Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: A comprehensive review, Sciencedirect, 117, 244-279. 7. Brändên H, Andersson J, (2004) Grundläggande immunologi, Denmark, Narayana. 8. Vincent F, Morand E, Murphy K, Mackay F, Mariette X, Marcelli C, (2013) Antidrug antibodies (ADAb) to tumour necrosis factor (TNF) specific neutralising agents in chronic inflammatory diseases: a real issue, a clinical perspective. Ann Rheum Dis, 72, 165-178. 9. Agger R, Andersen V, Leslie G, Aasted B, (2006) Immunologi, Denmark, Narayana. 10. Lunell E, (2001) Farmakologi, Sweden, Lund: Studentlitteratur. 11. O Shea J, Ma A, Lipsky P, (2002) Cytokines and autoimmunity, Nature Reviews Immunology, 2, 37-45. 12. Läkemedelsverket, (2014) Biologiska läkemedel, >http://www.lakemedelsverket.se/malgrupp/foretag/lakemedel/biologi ska-lakemedel/< (20140425) 13. Bendtzen K, (2013) Personalized medicine: Theranostics (Therapeutics diagnostics) essential for rational use of tumor necrosis factor- alpha antagonists. Discovery Medicine, 15(83), 201-211. 14. Socialstyrelsen, (2013) Läkemedelsförsäljningen i Sverige- analys och prognos, > http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2013/2013-4-21< (20140405). 18

15. Steenholdt C, Ainsworth M, Tovey M, Klausen T, Thomsen O, Brynskov J, Bendtzen K, (2013) Comparison of techniques for monitoring Infliximab and antibodies against Infliximab in crohn s disease. Ther Drug Monit, 35 (4), 530-538. 16. Carrascosa J, (2012) Immunogenicity in biologic therapy: Implications for Dermatology, Actas Dermosifiliogr, 104(6), 471-479. 17. Lallemand C, Kavrochorianou N, Steenholdt C, Bendtzen K, Ainsworth M, Meritet J, Blanchard B, Lebon P, Taylor P, Charles P, Alzabin S, Tovey M, (2011) Reporter gene assay for the quantification of the activity and neutralizing antibody response to TNF α antagonists. Journal of Immunological Methods, 373, 229-239. 18. Shifera A, Hardin J, (2010) Factors modulating expression of Renilla luciferase from control plasmids used in luciferase reporter gene assays, NIH Public Access, 396(2), 167-172. 19. Biomonitor, (2013) Bruksanvisning ilite TM Infliximab-IVD-kit, >http://www.biomonitor.dk/wp-content/uploads/3143-rev-02-eng.pdf< (20140320). 19