Förmågan hos Purified Protein Derivate, Phytohemagglutinin och Enterotoxin B att stimulera lymfocyter till prolifiering

Transkript

1 Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Förmågan hos Purified Protein Derivate, Phytohemagglutinin och Enterotoxin B att stimulera lymfocyter till prolifiering XXXX och YYYY Årskull: BMA-07 Laborationsrapport i Laboratoriemedicin I, termin 5 Laborationsdatum: Inlämnad: Handledare: Karin Emanuelsson Godkänd: /KE Statistik: OK

2 Abstrakt Lymfocytstimulering är en metod där man mäter lymfocyternas förmåga att prolifiera. Vid denna laboration används metoden för att undersöka vilken påverkan mitogenet Phytohemagglutinin (PHA)och superantigenet Stafylococcus aureus enterotoxin B ( SEB) samt det konventionella antigenet Purified protein derivate(ppd) har på CD4 + - celler. Syftet med laborationen är att undersöka förmågan hos PHA, PPD och SEB att stimulera T-celler till proliferation samt variationen mellan de olika stimuli. Som provmaterial användes renade monoukleära celler från perifert blod. Dessa fraktionerades och utodlades med ovanstående stimuli på två olika cellodlingsplattor för att prolifiera under 4 respektive 6 dagar. Den metod som användes för att mäta hur stor andel T-celler som prolifierat efter stimulering var BrdU-ELISA. Detta är en enzymmärkt ELISA-metod som baseras på inkorporerering av pyrimidin analogen BrdU i växande cellers DNA. För att kunna avgöra hur stor andel celler som prolifierat gjordes en spektrofotimetrisk avläsning efter tillsats av substratet TMB ( tetrametyl-benzidin). De resultat som erhölls efter avläsningen var ej realistiska eller tillförlitliga. Resultatet från ett annat laborationsförsök gav mer realistiska absorbansvärden där PHA och SEB hade en markant lymfocytprolifiering redan dag 4, varpå prolifieringen vid dag 6 minskat. PPD hade däremot en låg prolifiering dag 4 som fram till dag 6 ökade. Nollprovet visade ingen stor skillnad i prolifiering mellan dag 4 och 6. Nyckelord Lymfocytstimulering, superantigen, proliferationsbestämning, BrdU. 2

3 Introduktion Lymfocytstimulering är en metod där man mäter lymfocyternas förmåga att prolifiera. Cellerna får under en korttidscellodling genomgå en klonal proliferation där de stimuleras in vitro av främmande antigen eller mitogen. Genom denna metod kan man undersöka vilken påverkan olika stimuli kan ha på CD4 + - celler. Konventionella antigen kräver att proteinet tas upp av antigen presenterande celler (APC) och därefter bearbetas till en peptid varefter den presenteras i peptidklyftan på MHC klass II (Major Histocompatibility Complex). Komplexet kräver bindning till en T-cells receptor (TCR) för vidare signaltransduktion och proliferation (2). Mitogen är antigen som utsöndras och uttrycks av olika bakteriestammar. Dessa stimulerar alla T- celler till en polyklonal proliferation. Superantigen har även de en väldigt stark förmåga att prolifiera T-celler. Det som skiljer superantigen från konventionella antigen är att de ej kräver upptag av APC för att där bearbetas till peptider. De presenteras istället direkt på cellytan tillsammans med MHC klass II. Samtidigt som bindning till MHC klass II sker så korsbinder superantigenet den konstanta delen på Vβ-kedjan på TCR och α-kedjan på MHC klass II. Detta leder till en stark signaltransduktion och en proliferation i hög takt (3). Vid denna laboration används två cellodlingsplattor med olika inkubationstid, 4 och 6 dagar, för att undersöka skillnad i tillväxt hos T-celler efter stimulering av de tre olika antigenen PHA, PPD och SEB. Lektinet PHA är ett mitogen som stimulerar alla T-celler till polyklonal prolifiering samt produktion av cytokinerna TNF-α och interleukin-2. PPD deriveras från Mykobakterier och är däremot ett konventionellt antigen som ger en monoklonal T-cells stimulering (1). Detta antigen igenkänns endast av en unik TCR. SEB är ett av många enterotoxiner som utsöndras av Stahpylococcus aureus och fungerar som ett superantigen. Konventionella antigen som exempelvis PPD kräver en aktiveringstid på 7 dagar medan superantigen endast behöver 3 dagar för aktivering(3). BrdU-ELISA är en metod som används för att mäta hur stor andel T-celler som har prolifierat efter stimulering med tillväxtfaktorer, cytokiner eller mitogener. Detta är en enzymmärkt ELISA-metod som baseras på att pyrimidin analogen 5-bromo-2 -deoxyuridine (BrdU) inkorporeras i växande cellers DNA och ersätter kvävebasen tymidin med BrdU. Markören sätts till en cellkultur och inkuberas, under denna tid inkorporeras komplexet i lymfocyternas DNA. Plattan centrifugeras för att ta bort odlingsmediet varpå cellerna fixeras vilket möjliggör denaturering av DNA som är nödvändig för antikroppen anti-brdu-pod åtkomst till DNA-molekylen. Markören kan därefter detekteras genom tillsats av ett substrat och en absorbansmätning som görs med en ELISA-reader för kvantifiering. Absorbansvärdet korrelerar direkt till mängden DNA som syntetiserats och därmed till antalet celler som prolifierat i respektive brunn (4). 3

4 Hypotesen för laborationen är att antalet celler som prolifierats med PPD tros vara lägre dag 4 i jämförelse med dag 6 eftersom detta är ett konventionellt antigen som kräver en längre aktiveringstid än superantigen. De T-celler som stimulerats av superantiget SEB kommer troligtvis även att ha prolifierat i mycket högre grad redan dag 4, då dessa endast kräver en aktiveringstid på 3 dagar. Prolifieringsgraden för superantigenet vid dag 6 kan även ha avtagit på grund av ett minskat näringstillskott samt eventuell apoptos av T-celler. Syftet med laborationen är att undersöka förmågan hos PHA, PPD och SEB att stimulera T-celler till proliferation samt variation mellan de olika stimuli. De erhållna resultaten redovisas med statistiska beräkningar. 4

5 Material och Metod Framrening av mononukleära celler Ett venprov togs i ett CPT-rör som är ett blodprovsrör innehållande EDTA. Röret vändes 8-10 gånger direkt efter provtagningen och centrifugerades därefter i en swing-out rotor, 30 minuter vid 1500 RCF utan broms. Efter centrifugeringen hade de mononukleära cellerna samt trombocyterna samlats till ett vitt lager precis under plasmalagret och ovan gelen. Det vita lagret med de mononukleära cellerna sögs upp med en steril pasteurpipett och överfördes till ett 15 ml sterilt centrifugrör. Allt laborativt arbete utfördes i sterilbänk. De överförda cellerna tvättades med sterilt PBS upp till 14 ml. Röret vändes några gånger och centrifugerades i 15 minuter vid 300 RCF med broms. Den erhållna supernatanten sögs av och de kvarvarande cellerna resuspenderades med vortex. Till cellerna sattes därefter 10 ml steril PBS och röret vändes 5 gånger innan det centrifugerades i 10 minuter vid 300 RCF. Supernatanten sögs av och pelleten resuspenderades med 4 ml RPMI-medium ( RPMI-1640, 10% fetal calf serum, 100 units/ml penicillin och 100µl/ml Streptomycin, GIBCO). Därefter sattes 10 µl cellsuspension i Bürker räknekammare och antalet mononukleära celler räknades i 16 CD-rutor. Slutkoncentrationen av celler överskred det rekommenderade värdet på 0,5-1 x 10 6 celler/ml. Cellsuspensionen späddes därför 1:40. Utsådd med olika antigener i cellodlingsplattor Två cellodlingsplattor märktes med dag 4 och dag 6, varefter 200 µl sterilt vatten sattes till alla markerade brunnar runt provbrunnarna på båda cellodlingsplattorna. Cellsuspension med en volym på 50 µl sattes i 20 brunnar på vardera platta. Därefter sattes 50 µl av antigenen: PHA( 5µg/ml), PHD ( 5µg/ml) och SEB (10ng/ml) till alla brunnarna med cellsuspension samtidigt som 50 µl RPMIodlingsmedium sattes till de fem noll-brunnarna. Två blankprover och två bakgrundsprover med 100 µl odlingsmedium respektive cellsuspension sattes i båda plattorna, se figur i laborationsanvisning (2). Cellodlingsplattorna inkuberades i 37 C i en 5% CO 2 inkubator. Ena plattan i 4 dagar och den andra i 6 dagar. BrdU inmärkning För inmärkningen av celler användes Cell Proliferation ELISA, BrdU (colometric) från Roche applied science. En volym på 10 µl Dilute BrdU labeling reagent (förspädd 1:100 med ett odlingsmedium) sattes till alla brunnar innehållande PHA, PPD, SEB, Nollproven samt blank. Plattan inkuberades därefter 4,5 h i 37 C i en 5% CO 2 inkubator. Mikroplattan centrifugerades vid 300 RCF i 10 minuter. Efter centrifugeringen avlägsnades labeling lösningen från plattan och sattes in i ett värmeskåp med en temperatur på 60 C under en timme. Mikroplattan förvarades därefter i kylskåp fram till dag 7. Samma procedur utfördes på den platta som inkuberats i 6 dagar. 5

6 Till varje brunn med celler på båda plattorna sattes 200 µl fixeringslösning (Fixdenat). Plattorna inkuberades i rumstemperatur i 30 minuter. Fixeringslösningen avlägsnades från brunnarna. Till de fixerade cellerna sattes 100 µl anti-brdu-pod arbetslösning med en spädning på 1:100. Plattorna inkuberades sedan i rumstemperatur under 90 minuter. Konjugatlösningen avlägsnades och brunnarna tvättades tre gånger med 200 µl tvättlösning med en spädning på 1:10. När alla tre tvättsteg utförts sattes 100 µl substratlösning ( TMB) till varje brunn. Plattorna inkuberades i rumstemperatur i cirka 30 minuter tills en färgförändring skett. Absorbansmätning utfördes i en ELISA-reader, först vid våglängden 492 nm på båda plattorna. Därefter sattes 25 µl 1 M H 2SO 4 till varje brunn varpå plattorna sattes på skak under 1 minut (300 rpm). En ny absorbansmätning gjordes vid 450 nm. Statistiska beräkningar Erhållna absorbansvärden sammanställdes och median, medelvärde och standardavvikelse beräknades efter utfört Q-test. Efter detta gjordes ett F-test samt ett Mann-Whitney U-test. Dessutom gjordes One way Anova (Post hoc med Tukey och Bonferrloni) och en sammanställning av de olika antigenens mätvärden i en box-plot. 6

7 Resultat De resultat som erhölls efter avläsningen var ej realistiska eller tillförlitliga, se tabell 1. Men vid ett annat laborationsförsök erhölls mer realistiska absorbansvärden där PHA och SEB hade en markant lymfocytprolifiering redan dag 4, varpå prolifieringen vid dag 6 minskat. PPD hade däremot en låg prolifiering dag 4 som fram till dag 6 ökade. Nollprovet visade ingen stor skillnad i prolifiering mellan dag 4 och 6, se tabell 1. På de erhållna absorbansvärdena utfördes ett Q-test. Ett extremvärde kunde strykas. Därefter kunde medelvärde, median samt standardavvikelse beräknas för samtliga stimuli, se tabell 1. Ett F-test gjordes och superantigenen SEB och PHA samt nollprovet ansågs inte ha någon signifikant skillnad i spridning mellan dag 4 och dag 6. Det konventionella antigenet PPD visades däremot efter beräkning ha signifikant skillnad i spridning mellan dag 4 och dag 6, se tabell 3. Ett Mann-Whitney U-test utfördes. Resultatet av detta gav ett p-värde på > 0,05 vilket tyder på att det inte finns någon signifikant skillnad mellan medelvärdet hos de oberoende grupperna. Samtidigt gjordes ett One Way Anova-test där medelvärdet mellan de olika antigen-grupperna jämfördes. Detta resulterade i ett p-värde på <0,05 det finns alltså en signifikant skillnad mellan antigenen. För att jämföra mellan vilka antigen det finns en signifikant skillnad utfördes ett Post hoc test. Testet visade att det finns en signifikant skillnad mellan alla individuella antigen. Samtliga p-värden sammanställdes i tabell 3. För att redovisa alla mätvärden för de olika antigenen samt nollprovet sammanställdes detta i en boxplot. Denna visar ej på några extremvärden, men man kan däremot se skillnader i hur prolifieringen skett beroende på stimuli och dag, se figur 1. Diskussion Efter utförd laboration erhölls inga realistiska värden. Det fanns inga tydliga skillnader mellan superantigenen och det konventionella antigenet. Nollprovet hade dessutom samma grad av proliferation som antigen, detsamma gäller bakgrundsproven och blankproven. Detta betyder alltså att vår hypotes ej kan förlita sig på vårt resultat. Dock anses hypotesen ge en verklig bild av hur resultatet borde ha sett ut. De felkällor som kan ha uppstått är för det första att antigenen kan ha varit felaktigt spädda, vilket kan ha resulterat i en otillräcklig proliferation. Det kan även ha skett en kontaminering av antigenen, eftersom nollprovet visade liknande absorbansvärden som brunnarna med celler som stimulerats med antigen. En annan felkälla kan vara att det inte fanns tillräckligt med renade celler i brunnarna, men sannolikheten för detta är låg då koncentrationsbestämning av celler gjordes i Bürkers räknekammare innan cellsuspensionen sattes i brunnarna på odlingsplattorna. Men det kan däremot vara så att cellerna inte kunnat fästa till underlaget på brunnarna vilket lett till att en stor del av cellerna gått förlorade. Denna tes kan styrkas av att det vid infärgning med substrat inte uppstod någon markant färgförändring. Det går dessutom inte att utesluta den mänskliga faktorn eller eventuella systematiska fel som pipetter, centrifuger och ELISA-readern. 7

8 För att förebygga eventuella fel under laborationen borde antalet celler i brunnarna kontrolleras efter varje steg. Dessutom kan man variera antigenkoncentrationen för att hitta en optimal koncentration av antigen för bästa möjliga prolifiering. Eftersom vår laboration inte gav några tillförlitliga resultat så tilldelades vi tidigare erhållna värden som vi sedan kunde bearbeta. Där kunde mer realistiska resultat ses att PHA och SEB hade en markant lymfocytprolifiering redan dag 4, varpå prolifieringen vid dag 6 minskat. PPD hade däremot en låg prolifiering dag 4 som fram till dag 6 ökade. Nollprovet visade ingen stor skillnad i prolifiering mellan dag 4 och 6, se tabell 1. Detta stöder vår hypotes, där prolifieringen beror på aktiveringstiden som i sin tur beror på stimulit, alltså om lymfocyterna stimulerats av ett superantigen eller ett konventionellt antigen. Prolifieringsgraden för superantigenen mellan dag 4 och dag 6 har troligast avtagit på grund av ett minskat näringstillskott samt eventuell apoptos av T-celler. F-testet tyder på att superantigenen SEB och PHA samt nollprovet inte har någon signifikant skillnad i spridning mellan dag 4 och dag 6. Det konventionella antigenet PPD visades däremot ha signifikant skillnad i spridning mellan dag 4 och dag 6, se tabell 3. Även detta stöder vår hypotes. Det resultat som erhölls från Mann-Whitney U-testet gav ett p-värde på > 0,05. Detta pekar på att det inte finns någon signifikant skillnad mellan medelvärdet hos de oberoende grupperna. One Way Anova-testet visar däremot att det finns en signifikant skillnad i medelvärdet mellan de olika antigengrupperna. Post-hoc-testet visade mellan vilka specifika antigen det finns en signifikant skillnad. Testet visade att det finns en signifikant skillnad mellan alla individuella antigen då p< 0,05. 8

9 Referenser 1. Immunologisk metodik. Lymfocytstimulering. [Elektronisk]. Tillgänglig < 232/forum/showThread.asp%3Fparent%3D142%26groupId%3D2%26pageId%3D1%26fil eid%3d phytohemagglutinin&cd=4&hl=sv&ct=clnk&gl=se&lr=lang_sv >. [ ]. 2. Lymfocytstimulering. Laborationsasnvisnnigar, Biomedicinska analytikerprogrammet, Biomedicinsk laboratorievetenskap, Umeå Universitet. 3. Superantigener. Föreläsningskompendium, Biomedicinska analytikerprogrammet, Biomedicinsk laboratorievetenskap, Umeå Universitet. 4. Cell Proliferation ELISA, BrdU ( colorimetric) Roche. Laborationsanvisningar, Biomedicinska analytikerprogrammet, Biomedicinsk laboratorievetenskap, Umeå Universitet. 9

10 Tabeller Tabell 1. Erhållna absorbansvärden från ett annat laborationsförsök för PHA, PPD, SEB och nollprov, samt beräknat medelvärde, standardavvikelse och median för dag 4 och dag 6. Antigen Dygn Absorbans 450 nm Medelvärde Std Median PHA 4 1,265 1,279 1,285 1,257 1,246 1,266 0,016 1, ,823 0,797 0,813 0,809 0,792 0,807 0,012 0,809 PPD 4 0,124 0,111 0,229* 0,117 0,125 0,119 0,007 0, ,427 0,394 0,477 0,412 0,421 0,426 0,031 0,427 SEB 4 0,849 0,898 0,923 0,906 0,89 0,893 0,028 0, ,502 0,527 0,548 0,541 0,534 0,530 0,018 0,534 Noll 4 0,065 0,05 0,068 0,055 0,052 0,058 0,008 0, ,048 0,039 0,049 0,04 0,032 0,042 0,007 0,040 *PPD dag 4 0,229 kan strykas. Q-test: p= 0,881 (p för n=5 ska vara 0,642) Tabell 2. Erhållna egna absorbansvärden för PHA, PPD, SEB samt nollprov för dag 4 och dag 6. Antigen Dygn Absorbans 450 nm PHA 4 0,228 0,235 0,238 0,276 0, ,27 0,24 0,282 0,278 0,279 PPD 4 0,26 0,27 0,28 0,252 0, ,26 0,241 0,268 0,238 0,268 SEB 4 0,271 0,263 0,253 0,235 0, ,282 0,267 0,297 0,242 0,249 Noll 4 0,258 0,285 0,259 0,257 0, ,231 0,239 0,233 0,252 0,235 Tabell 3. Erhållna p-värden efter F-test, Mann-Whitney U-test, One-Way Anova samt Post hoc för antigenen PHA, PPD, SEB samt nollprov Antigen Post F-test Mann-Whitney U-test One-Way Anova hoc PHA >0,05 p-värde PPD <0,05 SEB >0,05 >0,05 <0,05 <0,05 Noll >0,05 10

11 Figurer Figur 1. Box-plot över skillnad mellan absorbansvärden dag 4 och 6 för antigen PHA PPD, SEB samt nollprov. 11