Lymfocytstimulering. 7,5 hp Laboratoriemedicin 2 BMA 08 Vt 11. Biomedicinsk laboratorievetenskap

Transkript

1 Biomedicinsk laboratorievetenskap Kursansvarig: Karin Emanuelsson Lymfocytstimulering 7,5 hp Laboratoriemedicin 2 BMA 08 Vt 11

2 Inledning. Lymfocytstimulering (lymphocyte proliferation assay) är en metod som mäter förmågan hos lymfocyter i en korttidscellodling att genomgå klonal proliferation när lymfocyterna stimuleras in vitro av främmande antigen eller mitogen. Antigena peptider associerade till MHC klass II molekyler på antigen presenterade celler (APC) leder till en prolifering av CD4 + lymfocyter. Antigen specifik T cell prolifiering är en viktig metod för att uppskatta CD4 + lymfocyters kapacitet att svara på olika stimuli. Utredning av lymfocyter kan ha medicinsk betydelse vid undersökning av olika sjukdomstillstånd. Såsom ökad infektionsbenägenhet som orsakas av tex immundefekt, immunbristsjukdomar, HIV, organtransplantation eller autoimmuna sjukdomar. Även immunosuppresiv behandling tex vid transplantationer kan leda till ökad benägenhet för infektioner. Praktiskt taget kan varje individs lymfocyter stimuleras till en ospecifik prolifiering genom att lymfocyterna stimuleras in vitro med ett mitogen som tex phytohemagglutinin (PHA). Mitogener verkar som ett stark stimuli som inte är antigen specifik. Antigen specifik T cell proliferation kan stimuleras in vitro genom antigen såsom PPD (purified protein derivative), ett vanligt förekommande antigen vid lymfocytstimulering. (PPD används som tuberkulintest). Ett superantigen har en mycket stark förmåga att prolifiera CD4 + celler. Till skillnad från konventionella antigen kräver inte superantigenerna att proteinet tas upp av antigenpresenterade celler och processas till peptider för att kunna presenteras på cellytan tillsammans med MHC klass II. Superantigener binder till MHC klass II och korsbinder med T cells receptorer (TCR) variabla del Vβ på T cellerna vilket skickar en stark proliferation signal till T cellerna som börjar tillväxa. Staphylococcus aureus bildar olika enterotoxiner (minst nio olika serologiska typer) där enterotoxin B (SEB) är en av dem. Dessa stafylokocktoxiner fungerar som superantigener. En annan bakterie som bildar superantigener är Streptococcus pyogenes som utsöndrar flera pyrogena exotoxiner (Spe) med superantigen aktivitet. En blandning av Spe kan framrenas från en S. pyogenes bakteriekultur som odlats över natt. Genom centrifugering pelleteras cellerna och supernatet innehållande Spe kan precipiteras med etanol. De utfällda proteinerna löses i H 2 O och detta proteinextrakt betecknas extracellulärt extrakt (EC) och har superantigenaktivitet. Laborationen omfattar fraktionering och rening av mononukleära celler från perifert blod med hjälp av CPT rör (cell preparation tube). De renade mononukleära cellerna utodlas i cellodlingsbrunnar med cirka 0, celler/brunn med eller utan olika stimuli. Cellerna får prolifiera under 4 respektive 6 dagar vid 37 C i CO 2 inkubator. Andelen T lymfocyter som har prolifierat bestäms med hjälp av BrdU Elisa (5 bromo 2 deoxyuridine dvs BrdU). För att mäta lymfocyt proliferationen tillsätts BrdU, vilket inkorporeas i DNA hos växande celler. BrdU ersätter tymidin vid DNA replikation och fungerar som en markör.

3 I denna laboration skall tre olika antigen, PHA, PPD och S. aureus SEB, stimuleringseffekt på lymfocyter studeras. Antigenernas maximala stimulering kan jämföras både sett till nivån av T cellernas tillväxt och när i tid effekten är störst. Efter avläsning bearbetas resultaten och presenteras i en laborationsrapport. Vid redovisning av laborationen ska även statistika beräkningar ingå. Varje grupp beräknar för var och en av PHA, Noll, SEB och PPD: 1. Median, medelvärde och standardavvikelse. Dra slutsats av eventuell skillnad mellan median och medelvärde. 2. Inom var och en av dessa görs Q test för eventuell uteslutning av extremvärde. Om Q testet styrker uteslutning upprepas förfarande enligt punkt 1 efter uteslutning. 3. Gör t test (efter att ha bestämt eventuell signifikant skillnad i varians med hjälp av F test) och Mann Whitneys U test mellan fyra respektive sex inkubationsdygn för var och en av PHA, Noll, SEB och PPD. Dra slutsatser av testen. 4. Presentera resultatet, gärna som box plot. Materiel till Lymfocytstimulering Lösningar (Sterila) Material (Sterilt) RPMI 1640+GlutarMax TM 1 1x Centrifugrör 15 ml, sterila GIBCO (61870) Ref NaCl (0,9 %) CPT rör 10 ml Sterilt avjonat vatten Kanyler Humant blod Stas Penicillin/streptomycin Tvättsprit (70 %) PBS Plåster FCS 100% Cellodlingsplattor 96 håls 1M H 2 SO 4 (ej sterilt) Bürkerkammare Antigen Mikroskop PHA (1mg/ml) Sterila pasteurpipetter PPD (1mg/ml) 1 10, l pipetter SEB (500ng/ml) Slaskbägare Kit Cell proliferation ELISA, BrdU (colorimetric). Roche applied science Provtagning BD Vacutainer CPT rör NH:~130IU Ficoll 2,0 ml 8ml (16x125mm) Penicillin/Streptomycin (konc units/ml PcG och μg/ml Streptomycin) GIBCO RPMI innehåller en ph indikator, om färgen på RPMI:n börjar bli lila aktig så är det för högt ph. Skruva upp korken några varv och ställ in flaskan i CO 2 inkubatorn tills ph blir bra

4 Utförande: OBS! Använd handskar och tempererade lösningar. Arbeta i sterilbänk vid preparation av celler och vid tillsats av ämnen till cellodlingen. Framrening av mononukleära celler och utsådd med olika antigener i cellodlingsplattor Dag 0 En i gruppen får lämna blod genom venprovtagning med CPT rör. 1. Förbered för venprovtagning. Låt armen hänga nedåt och sätt en stas. Tag 1 CPT rör och fyll det med minst 6 ml per rör, kom ihåg släpp stasen när blodet rinner ner i röret. Vänd röret 8 10 gånger direkt efter provtagningen för att blodet ska blandas väl med antikoagulantia, men skaka inte. Ställ rören i provrörsställ. 2. Vänd rören 8 10 gånger just innan centrifugeringen. Centrifugera vid rumstemperatur (RT) i en swing out rotor, 30 min vid RCF (relative centrifugal force) utan broms. 3. Efter centrifugeringen återfinns de mononukleära cellerna och trombocyterna i det vitaktiga lagret just under plasmalagret. Sug upp det vitaktiga lagret med en pasteurpipett och överför det till ett 15 ml sterilt koniskt centrifugrör. Ett centrifugrör per CPT rör. Överför lagret direkt efter centrifugeringen, det ger bättre utbyte. Figur 1. Fördelningen av celler i ett CPT rör före och efter centrifugering. 4. Tvätta cellerna genom att tillsätta steril PBS upptill 15 ml. Korka röret och vänd det 5 gånger. 5. Centrifugera 15 min, 300 RCF med broms. Sug av det mesta av supernatanten utan att röra upp cellerna. 6. Resuspendera cellerna försiktigt med vortex alternativt knacka med fingret. Tillsätt 10 ml PBS och vänd röret 5 gånger.

5 7. Centrifugera 10 min, 300 RCF. Sug av det mesta av supernatanten utan att röra upp cellerna. 8. Resuspendera pelleten upptill ~5 ml med RPMI medium (räcker till två plattor). RPMI medium består av RPMI % FCS (fetal calf serum) + Penicillin/Streptomycin (100 units/ml penicillin och 100μg/ml av Streptomycin). 300 ml RPMI medium blandas till hela gruppen (beräkna hur mycket som åtgår). 9. Tag av 10μl till Bürker kammare och räkna antalet mononukleära celler. Har man få celler är det bättre att koncentrera provet genom att centrifugera det en gång till och späda det i mindre volym RPMI medium. 10. Späd ev cellerna i RPMI medium till en slutkoncentration på 0,5 1 x 10 5 celler/ml. 11. Märk två cellodlingsplattor dag 4 respektive dag Tillsätt 50μl celler/brunn i båda plattorna (se figur 2) vilket ger en slutkoncentration på ca 0,5 1x 10 4 celler/brunn. 13. Späd SEB till 10 ng/ml (alternativt 20ng/ml) och PHA och PPD till 10 g/ml i RPMIodlingsmedium. Tillsätt 50μl av vardera antigen till respektive brunn, enligt figur 2 (slutkoncentration 5 10 ng/ml SEB och 5 g/ml PPD samt PHA). 14. Tillsätt 50 l/brunn RPMI odlingsmedium till noll brunnarna. 15. Gör två Blank och Bakgrundsprover. Blankt innehåller 100μl odlingsmedium/brunn men inga celler. Bakgrund innehåller 100μl celler/brunn 16. Tillsätt 200 μl sterilt vatten till alla brunnar runt provbrunnarna enligt blå markering. Se figur 2. Vattnet fungerar som fuktkammare. 17. Inkubera i 37 C i 5% CO 2 inkubator. Ena plattan inkuberas under 4 dagar och den andra under 6 dagar A B PHA PHA PHA PHA PHA Noll Noll Noll Noll Noll C SEB SEB SEB SEB SEB PPD PPD PPD PPD PPD D E Blank Blank Bakgr Bakgr F G H Figur 2. Förslag till utodling i cellodlingsplattor. Fem brunnar vardera av antigenerna PHA, PPD och SEB samt noll kontroll. Två brunnar blank och bakgrundskontroll. Tillsätt sterilt vatten till de blå brunnarna.

6 Dag 4 /Dag 6 och Följ beskrivningen för BrdU Elisa och märk in cellerna, observera vilken tillsats det ska vara i blank samt bakgrundskontrollerna. Cellerna i plattan dag 4 märks in med BrdU under 4 5 tim. Skörda cellerna genom centrifugering och intorkning vid 60 C spar plattan i kyl till dag 7. Observera risk för cluster formation sida 15 i manualen. Platta dag 6 märks in med BrdU och skördas på liknande sätt. Dag 7 utförs enligt manualen för Elisa BrdU, se länk nedan. 2. Kom ihåg avläs absorbansen först vid 405 nm innan stopplösning tillsätts och avläses sedan vid 450nm. Manualen till kitet finns som en pdf fil på Cambro. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. FOR IN VITRO USE ONLY. Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Colorimetric immunoassay for the quantification of cell proliferation, based on the measurement of BrdU incorporation during DNA synthesis: A non radioactive alternative to the [3H] thymidine incorporation assay Cat. No kit (1000 tests) Store at 2 8 C Instruction Manual Version November applied science.com/pack insert/ a.pdf Skriv en laborationsrapport enligt Anvisningarna, kom ihåg formulera en hypotes.