Umeå universitet. Biomedicinska analytikerprogrammet. AAAA och BBBB. Årskull: BMA-08. Laborationsrapport i laboratoriemedicin 2, termin 6

Transkript

1 Umeå universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Jämförelse av proliferation, stimulerad med fytohemagglutinin, purified protein derivate och enterotoxin B från Staphylococcus aureus efter fyra respektive sex dygn. Kommentar [K1]: I en labrapport får man inte anv Univeristetsloggan (den blå bilden)men väl i exarbetet AAAA och BBBB Årskull: BMA-08 Laborationsrapport i laboratoriemedicin 2, termin 6 Inlämnad: Godkänd: XX Lärare: Karin Emanuelsson 1

2 Abstrakt Individer med hög infektionsbenägenhet kan utredas, detta görs genom att lymfocyternas benägenhet att proliferera mäts vid olika stimuli. Ett sådant stimuli kan vara antigen, ett ämne som aktiverar kroppens förvärvade immunsystem. Ett annat stimuli är mitogener som har förmåga att påverka cellerna att gå in i mitos. Exempel på stimuli som utlöser en särskilt stark reaktion är superantigener, detta genom att de korsbinder MHC klass II och TCR. Mätningen av lymfocyt proliferationen in vitro med antigen, mitogen och superantigen stimulering kan utföras med kolorimetrisk BrdU ELISA. Syftet med denna laboration var att jämföra lymfocyt proliferationen stimulerad av det konventionella antigenet purified protein derivative (PPD), mitogenet phytohemagglutinin (PHA), superantigenet Streptokock pyrogena exotoxiner (SEB) samt utan tillsats av antigen efter fyra respektive sex dygn med kolorimetrisk BrdU- ELISA. Mononuklära celler renades fram och fick tillväxa tillsammans med tillsats av respektive antigen i fyra respektive sex dygn. Cellerna märktes in med BrdU lösning och en BrdU- ELISA utfördes, därefter lästes absorbansen i en spektofotometer. Lymfocyter stimulerade fyra dygn med mitogen erhöll högst absorbans av all mätdat, därefter hade superantigen stimulerade (fyra dygn) lymfocyter högst uppmätt absorbans. Detta då de aktiverar lymfocyter polyklonalt, vilket inte konventionellt antigen gör. Vid jämförelse mellan de olika parametrarna skådades störst signifikant skillnad i medelvärde mellan mitogen och kontroll. Kommentar [K2]: Funderar på meningen ska det vara för ett visst stimuli Kommentar [K3]: Av vad? Kommentar [K4]: Förklara först och skriv förkortningen (PPD) inom parentes Kommentar [MSOffice5]: nvad menar du? Medel ligger över 1? Kommentar [K6]: Kolla 2

3 Nyckelord Lymfocyt proliferation, Mitogen, Konventionellt antigen, Superantigen, Kolorimetrisk BrdU- ELISA Introduktion Människans immunförsvar är uppbyggt i tre olika nivåer där den första består av hud och slemhinnor. Nivå två (medfödda immunförsvaret) som agerar ospecifikt utgörs av exempelvis fagocyterande celler och komplement. Den sista nivån (förvärvade immunförsvaret) är specifikt och adaptivt samt omfattar aktiverade T- samt B- lymfocyter (1). Individer med hög infektionsbenägenhet kan utredas för exempelvis kända immunbrist sjukdomar, humant immunbristvirus (HIV) och organtransplantationer (2). Där lymfocyternas benägenhet att proliferera vid ett visst stimuli mäts. Ett sådant stimuli kan vara antigen, ett ämne som kan aktivera kroppens förvärvade immunsystem(1). Detta sker genom att antigenpresenterande celler (APC) fagocyterar och bearbetar protein antigenerna genom att bryta ner dem. Dessa presenteras som peptider för inaktiverade T- lymfocyter via major histocompatibility (MHC) klass II molekyler. T-lymfocyterna blir då aktiverade och detta leder till proliferation. Ett användbart antigen är purified protein derivate (PPD) som är ett renat proteinextrakt från tuberkelbakterier (3). Ett annat exempel på stimuli är mitogener, vilka är växtlektiner. På lymfocyternas yta finns glykoproteiner dit mitogener har förmåga att binda, vilket leder till att cellerna går in i mitos. Då mitogener inte har någon specificitet binder de till en stor andel av lymfocyterna och det sker en polyklonal aktivering. En av de vanligaste mitogenerna är fytohemagglutinin (PHA) som stimulerar tillväxt av nästan alla T-celler (4). PHA är en kombination av fem tetrameriska glykoproteiner där vardera glykoprotein består av två subenheter (5). Är mitogensvaret lågt indikerar detta på en allvarlig immundefekt. Exempel på stimuli som utlöser en särskilt stark reaktion är superantigener, detta genom att de korsbinder MHC klass II och TCR (1,4). Superantigenet binder på utsidan av MHC II på APC och till lämpligt Vβ element på T-lymfocyternas receptor, detta gör att specifik peptid inte behöver vara presenterad. En av fem T-celler blir aktiverad av superantigen jämfört med antigen presenterad stimulering där det är 1 av (6). En variant av dessa är enterotoxin B från Staphylococcus aureus (SEB) som hos människor kan ge toxisk shock syndrom (TSS) och multi organ svikt (7). Mätningen av lymfocyt proliferationen in vitro med antigen, mitogen och superantigen stimulering kan utföras med kolorimetrisk BrdU ELISA. BrdU inkorporeras vid DNA syntes istället för tymin, då cellen lyseras kan en inmärkt (peroxidas, POD) BrdU specifik antikropp binda. Vid tillsats av substrat bildas en produkt och kvantiteten av lymfocyt proliferation kan mätas med spektrofotometer (8). Kommer både SEB och PHA att stimulera till en polyklonal tillväxt av lymfocyterna redan efter fyra dygn? Kommer den monoklonala proliferationen av PPD stimulerade lymfocyter inte hinna uttryckas dag fyra men dag sex? Sjunker proliferationen för SEB och PHA stimulerade lymfocyter till dag sex jämfört med dag fyra? Uppstår det någon proliferation hos lymfocyterna när inget antigen tillsätts? Syftet med denna laboration var att jämföra lymfocyt proliferationen stimulerad av antigen (PPD), mitogen (PHA), superantigen (SEB) samt utan tillsats av antigen efter fyra respektive sex dygn med kolorimetrisk BrdU- ELISA. Kommentar [K7]: förklara?? Kommentar [MSOffice8]: VVi tror inte de, varav att vi skrivit denna hypotesen. Kommentar [K9]: kan man förvänta sig att de ska hinna aktivera till dag 4??? 3

4 Material och metoder Inmärkning av celler och ELISA utfördes med reagenser från Cell proliferation ELISA, BrdU (colorimetric), Roche Diagnostics, GmbH, Germany. Kommentar [K10]: stryk Framrening av Lymfocyter Venprov från kvinna i 30års åldern taget i ett CPT-rör centrifugerades i en swing- out rotor (Hettich, Rotina 46) utan broms i 30 minuter vid relative centrifugal force (RCF). De mononukleära cellerna samt trombocyterna överfördes till ett sterilt centrifugrör och PBS tillsattes, slutvolym 15ml. Därefter centrifugerades röret 15 minuter i 300 RCF med broms. Supernatanten kasserades, pelleten resuspenderades med 10ml PBS och centrifugerades på 300 RCF i 10 minuter med broms. Pelleten resuspenderades med cellodlings medium (RPMI % fetalt kalv serum+ Penicillin/ Streptomycin (100 units/ml Penicillin och 100µg/ml Streptomycin)) till en slutkoncentration på 0,5 x 10 5 celler/ ml, vilket kontrollerades med Bürker kammare. Kommentar [K11]: har kön ålder betydelse? Tillväxt av lymfocyter med olika antigen Till en cellodlingsplatta pipetterades 50µl cellsuspension till vardera brunn, totalt 20 stycken. Av vardera antigen (SEB 10ng/ ml, PHA och PPD 10µg/ ml) tillsattes 50µl per brunn, totalt fem brunnar för respektive antigen. RPMI- odlingsmedium (50µl/brunn) pipetterades till de kvarvarande brunnarna innehållande cellsuspension. Till två brunnar tillsattes 100µl RPMIodlingsmedium/brunn, dessa benämndes blank. Till två brunnar som benämndes bakgrund pipetterades 100µl cellsuspension/brunn. Runt alla brunnar med prov tillsattes 200µl sterilt vatten. Detta gjordes på två cellodlingsplattor som inkuberades i 37 C med 5% CO 2 i fyra respektive sex dagar. Inmärkning av celler Inmärkning gjordes (efter fyra respektive sex dagar) med BrdU lösning, 10µl/brunn med undantag från bakgrunds kontroller. Därefter inkuberades cellodlingsplattan två timmar i 37 C. Cellerna resuspenderades och plattan centriguderades i 10minuter på 300g. Genom att vända plattan avlägsnades mediet och cellerna inkuberades under en timma i 60 C. Plattan förvarades i 2-8 C tills vidare. ELISA med BrdU Till vardera brunn tillsattes 200µl FixDenat till de båda plattorna som fick inkubera 30 minuter i C. FixDenatet avlägsnades och 100µl/ brunn anti-brdu-pod arbetslösning ( anti-brdu-pod stock och antikropps lösning, 1:100) tillfördes. Cellodlingsplattorna inkuberades 90 minuter i C. Antikropps konjugatet togs bort och fria antikroppar tvättades bort med tvättlösning (tvätt buffert koncentrat och destillerat vatten, 1:10), 3 x 200µl/brunn. Tvättlösningen avlägsnades och 100µl substratlösning pipetterades till vardera brunn. Plattorna inkuberades 5-30 minuter i C. Stopplösning (1 M Svavelsyra, H 2SO 4) pipetterades till varje brunn (25µl/brunn) och de båda cellodlingsplattorna skakades. Absorbansen avlästes i en spektrofotometer vid 450 nm. Kommentar [K12]: Mer exakt Kommentar [K13]: Konc? 4

5 Statistiska beräkningar För beräkning av beskrivande statistik användes Microsoft Office Excel. Beräkningar av skillnader i varianser och medelvärden mellan olika inkubationstider användes F-, t-, Mann-Whitney U- och kruskall-wallis test i det statistiska programmet SPSS. Skillnader i proliferation mellan de olika antigenen samt kontrollen beräknades med One Way Anova med Post Hoc (Bonferroni) i SPSS. Visualisering gjordes med en box- plot i SPSS. Kommentar [V-W14]: Det borde framkomma att med F-testet undersökte ni om det fanns någon signifikant skillnad i spridning mellan dag 4 och dag 6 för var och en av de olika antigenen. T-testet och Mann- Whitney U-testet undersökte om det fanns någon signifikant skillnad i medelvärde för var och en av de olika antigenen. Slutligen; Kruskall-Wallis och One Way Anova med Bonferroni undersökte om det fanns någon signifikant skillnad i medelvärde när man jämförde samtliga grupper med varandra samtidigt (och Bonferroni var man har störst/minst skillnader). Naturligtvis behöver man inte skriva lika detaljerat om man vänder sig till experter, men i detta fall har ni ännu inte hunnit bli det utan ska visa att ni förstått vad testen går ut på och att ni kan tolka resultaten. 5

6 Resultat Beskrivande statistik Högst beräknat absorbans medelvärde utifrån den uppmätta värden erhölls för PHA efter fyra dygn, därefter SEB efter samma inkubationstid. De två lägsta beräknade absorbans medelvärdena var för kontrollen (NOLL). Linkande mönster gällde även för den beräknade medianen och dessa värden låg nära respektive medelvärde. Variansen mellan de uppmätta absorbans värdena var störst hos SEB vid fyra dygns inkubation och lägst vid kontrollens båda mätningstillfällen (tabell I). Kommentar [V-W15]: uppmätta värden eller insamlade rådata. Skillnader i varians och medelvärde F-testen för de tre antigenen (PHA, PPD och SEB) visade att skillnaden i variansen mellan fyra respektive sex dygns inkubering var ej signifikant (> 0,05) medan kontrollen (NOLL) var signifikant (<0,05). T-testen resulterade i att skillnaden i medelvärde för fyra respektive sex dygns inkubering var signifikant (<0,05) för vardera antigen. Kontrollens t-värde blev ej signifikant (>0,05) (tabell I). Icke-parametriska test Vid antagande om icke normalfördelning visades med Mann-Whitney U test att skillnaderna i medelvärden för fyra respektive sex dygn var signifikant (<0,05). Kontrollens p-värde visade inte på någon signifikant skillnad (>0,05)(tabell I). One Way Anova med Post Hoc Skillnad mellan antigenernas medelvärde räknades ut med One Way Anova med Post Hoc (Bonferroni). Den största signifikanta skillnaden i medelvärde var mellan PHA och kontrollen (NOLL). Den minsta signifikanta skillnaden i medelvärde sågs mellan PHA och SEB (tabell II). Förhållande mellan absorbans och antigen Absorbansen var högre vid stimulering av PHA och SEB jämfört med PPD. Efter fyra dygns inkubering var absorbansen högre för PHA och SEB än vid sex dygns inkubering. För PPD sågs en höjning av absorbansen vid dag sex från dag fyra. Rådatan från SEB dag fyra innehöll en outlier som inte gick att stryka med Q-test. NOLL- absorbansen sänktes från dag fyra till dag sex men var lägre än någon av antigenens vid de båda mätningarna (figur 1). Kommentar [V-W16]: För samtliga gjorda hypotestest värdet 0,05 som ni utgår från för att se om det är någon signifikant skillnad i spridning eller medelvärden är inte det beräknade värdet på testet utan det är den gräns som man bestämmer att p-värdet för testet ska jämföras med. Om man får ett p-värde som är större än 0,05 är slutsatsen att risken för felaktig slutsats är större än 0,05 dvs större än 1/20-del. Denna kommentar gäller för hela dokumentet. 6

7 Diskussionen Medelvärdena för mitogen och superantigen stimulerade lymfocyter var högre dag fyra jämfört med medelvärdet för konventionellt stimulerade. Detta innebär att mitogen och superantigen aktiverar fler lymfocyter än vad det konventionella antigenet gör. Medianvärdena för respektive antigen samt mätningstillfälle låg nära de respektive medelvärdena, vilket tyder på att rådatan är jämtfördelat. Då jämförelse mellan de båda inkubationstidernas mätdata gjordes sågs ingen signifikant skillnad i variansen medan signifikant skillnad förelåg mellan medelvärdena för respektive antigen. Vid användandet av Mann- Whitney U (icke- parametriskt) test erhölls värden som styrkte tidigare resultat om signifikant skillnad i medelvärde mellan inkubationstiderna. För kontrollen som inte stimulerades med något antigen sågs en viss proliferation, detta kan bero på att provmaterialet innehöll nyaktiverade lymfocyter samt interleukin-2. För att kunna jämföra fyra grupper med varandra samt för att se mellan vilka antigen den signifikanta skillnaden i medelvärde var användes One Way Anova med Post Hoc. Den största signifikant skillnaden i medelvärde sågs mellan mitogen och kontroll. Detta styrker att mitogenet har en polyklonal stimulering som inte är specifik. Den signifikanta skillnaden var lägst mellan mitogenet och superantigenet, vilket tyder på att dessa antigen har liknande egenskaper. Vid visualisering med box- plot av erhållna resultat sågs en minskning av proliferationen hos mitogenet och superantigenet vid dag sex jämfört med dag fyra. Detta kan bero på att lymfocyterna har gått i apoptos eller att tillväxtfaktorerna förbrukats. Konventionellt antigen visade sig inte stimulera lymfocyterna märkbart förrän dag sex. Förklaring till detta är att dessa antigen är monoklonala och specifika. Dess stimulering uppnådde dock aldrig mitogen- och superantigenernas effekt. Outliern som erhölls vid mätning av superantigen stimuleringen vid fyra dygn kunde inte strykas med Q-test. Detta på grund av att rådatan endast bestod av ett fåtal mätvärden. Skillnaden mellan medelvärdena för kontrollen dag fyra och dag sex var ej signifikant, detta då det inte förekom någon antigen stimulering. Kolorimetrisk BrdU- ELISA var en bra metod vid användande av en celllinje och då analysen gjordes under en kort tidsperiod. 7

8 Referenser 1. Ericson Elsy, Ericson Thomas. (2009) Klinisk mikrobiologi 4e upplagan. Liber AB, ISBN: , 64-65, Analysportalen. Lymfocyter/ CD markörer. [Elektronisk]. Tillgänglig< [ ]. 3. Danielsson Dan, (2002) Medicinsk mikrobiologi 6e upplagan. Liber AB, ISBN: , 93, Agger Ralf, Andersen Vagn, Leslie Graham, Aasted Bent. (2006) Immunologi 1a upplagan. Studentlitteratur, ISBN: , Geppert Tom, (1998) Encyclopedia of Immunology 2a upplagan. Elsevier Ltd, ISBN: , Baron Samuel, (1996) Medical microbiology 4e upplagan. Galveston (TX), ISBN: , kapitel Mulualem E. Tilahun et. Alt, Potent Neutralization of Staphylococcal Enterotoxin B by Synergistic Action of Chimeric Antibodies, Infection and immunity, 2010;78(6): Roche. Cell Proliferation ELISA BrdU (colorimetric). [Elektronisk]. Tillgänglig< [ ]. 8

9 Tabeller Tabell I. Observerad proliferation av lymfocyter stimulerade med olika antigen samt noll efter fyra respektive sex dygn, detta genom absorbans mätning vid 450nm. Beskrivande statistik, signifikanta skillnader i varians och medelvärde samt icke-parametriska tester. Antigen Dygn Medel Median Std F-test t-test Mann-Whitney U PHA 4 1,020 0,997 0,115 PHA 6 0,798 0,823 0,085 0,599 0,008 0,009 PPD 4 0,203 0,198 0,087 PPD 6 0,375 0,394 0,053 1,258 0,005 0,016 SEB 4 0,819 0,849 0,179 SEB 6 0,527 0,534 0,101 0,555 0,013 0,047 NOLL 4 a 0,058 0,059 0,010 NOLL 6 0,043 0,044 0,010 0,002 0,138 0,176 a) Uträkningar gjorda på fyra mätdata, ett värde ströks med Q-test. Tabell II. Signifikant skillnad mellan antigenernas medelvärde beräknat med One Way Anova med Post Hoc (Bonferroni). Antigen p-värde PHA PPD 9,232x10-11 SEB 4,113x10-3 NOLL 2,343x10-14 PPD PHA 9,232x10-11 SEB 4,003x10-6 NOLL 4,821x10-3 SEB PHA 4,113x10-3 PPD 4,003x10-6 NOLL 1,647x10-10 Kommentar [K17]: Skriv ev (Noll) Kommentar [V-W18]: Det framgår inte om de värden ni har i tabellen är testfunktionernas beräknade värden eller p-värden. Detta borde naturligtvis framkomma. Att F-test PPD inte kan vara p-värde inser jag, men resten skulle jag inte inse. Det borde vara p- värden som redovisas på samtliga test, för det är dessa som är av intresse. Kommentar [V-W19]: Här skulle ni däremot ha använt Kruskal-Wallis. t- test och Mann-Whitney hör ihop med medelvärdestest på två grupper, OneWay Anova och Kruskal-Wallis hör ihop med medelvärdesjämförelser mellan tre eller flera grupper. Kommentar [V-W20]: Varför använder man Bonferroni? Hur ser resultatet ut om ni inte gör ett Post Hoc-test? Ni har ju redan använt er av resultatet inlindat i ord under rubriken Resultat (One Way Anova ) men motivera också era slutsatser med utgångspunkt i tabellen. NOLL PHA 2,343x10-14 PPD 4,821x10-3 SEB 1,647x

10 Figurer Figur 1. Boxplot av förhållande mellan absorbans och antigen. Antigenstimulerade lymfocyters proliferation med det konventionella antigenet PPD, mitogenet PHA och superantigenet SEB samt kontroll (NOLL). Absorbans mätning(450nm) utfört på två cellodlingsplattor som stimulerats fyra respektive sex dygn. Kommentar [K21]: Figurtext nedanför figur Kommentar [K22]: Kan ange vilka Kommentar [K23]: Stämmer det? Blir det syftningsfel har ni mätt abs fefter 4 och sen 6 dar? 10