Laboration 1 BLADCO. Intracellulär signalering. Inledning. Venös provtagning. Neutrofilpreparation. Dag 1. Stimulering av neutrofiler

Transkript

1 Laboration 1 BLADCO Intracellulär signalering Inledning Neutrofiler är kroppens primära försvar mot bakterieinfektioner. Genom fagocytos isolerar neutrofilen bakterien från omgivningen för att sedan med hjälp av proteolytiska enzymer som lagras i granula och fria syreradikaler döda och bryta ned den. Ibland läcker dock fria syreradikaler ut ur cellen och skadar intilliggande vävnad, något som kopplats samman med uppkomsten av flera allvarliga sjukdomar t.ex. magsår och magcancer. Det är därför viktigt med en strikt kontroll av denna effektorfunktion och att få ökad kunskap om hur signalvägen från stimulering av neutrofilen till ökad fri syreradikalbildning ser ut för att i framtiden kunna utveckla mediciner med de rätta egenskaperna. I den här laborationen studeras huruvida neutrofiler stimulerade med två olika stimuli, PMA och fmlp, induceras till en ökad produktion av fria syreradikaler. Dessutom undersöks, med hjälp av de tre kinashämmarna, PD98059, SB och wortmannin om de tre kinaserna ERK, p38 respektive PI3K aktiveras och därmed möjligen är involverade i signalvägen. Principer för de metoder som används inleder laborationshandledningen och efter dessa finns mer detaljerade beskrivningar för utförandet av metoderna. Fig 1 är en översikt över laborationen. Venös provtagning Neutrofilpreparation Dag 1 Stimulering av neutrofiler Analys av superoxidjonsproduktion Flödescytometri Analys av kinasaktivitet SDS-PAGE Immunoblot Dag 2 3 Fig 1. Översikt över laboration 2

2 Granulocyt preparation Antikoagulationsbehandlat perifert venöst blod späds med lika stor volym fysiologisk koksaltlösning. Då Ficoll-Paque har en högre densitet än blod/koksaltlösningen, kan blod/koksaltlösningen skiktas ovanpå Ficoll-Paquen (fig 2). Vid kontakt med Ficoll-Paque påverkas densiteten hos blodets komponenter olika. Efter en kort centrifugering bildas flera skikt, där blodets komponenter finns i olika lager beroende på densitet (fig 3). Erytrocyter aggregeras av ficoll-paquen och sedimenterar till botten. Granulocyter erhåller, genom ficoll-paquens osmotiska tryck, en densitet som gör att de sedimentera genom Ficoll-Paque lagret och lägger sig i ett lager ovanpå erytrocyterna. Då lymfocyterna, trombocyterna och monocyterna har en lägre densitet än Ficoll-Paque men en högre densitet än plasma/koksalt så hamnar de i gränsen mellan plasma/koksalt lagret och Ficoll-Paque lagret. För att rena fram granulocyterna från erytrocyterna lyseras erytrocyterna i en hypoton lösning. De framrenade granulocyterna består till >95% av neutrofiler vilka har en viabilitet >95% (enligt cellräkning i bürknerkammare av trypanblå-färgade celler). Blod/koksaltlösning Plasma/koksalt-lösning Lymfocyter, Trombocyter Ficoll-Paque Ficoll-Paque Granulocyter Erytrocyter Fig 2. Blod/koksalt-lösningen skiktas ovanpå Ficoll-Paquen. Fig 3. Efter centrifugering har blodets komponenter delat upp sig efter densitet. SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) är en metod som går ut på att, ur en proteinblandning, separera denaturerade proteiner efter storlek. Genom att suspendera cellerna i Laemmlis provbuffert och sedan koka suspensionen lyseras cellerna och proteinerna denatureras. Laemmlis provbuffert innehåller -merkaptoetanol och ett överskott av SDS. -merkaptoetanol är en tiol som bryter upp proteinets disulfidbryggor medan SDS är en negativt laddad detergent som binder till proteinet i ett konstant viktförhållande på ca 1,4 g SDS per 1 g protein. Det gör att de negativa laddningarna på SDSmolekylen vida överträffar laddningen hos proteinet. Alla proteiner får därför i stort sett lika laddning. Genom att applicera proteinblandningen på en polyakrylamidgel med önskad porstorlek och sedan lägga en spänning över den, kan proteinerna därmed separeras enbart efter storlek. Det gör att inte bara proteinblandningens uppsättning av polypeptider kan bestämmas utan även polypeptidernas molekylvikt i förhållande till polypeptider av känd molekylvikt, som får vandra under samma elektroforetiska betingelser. Fig 4 visar en Mini-PROTEAN 3 Cell som kommer att användas i laborationen. Bananplugg Anod (röd) Gummilager Gel sandwich Tryckplatta Kammar Fig 4. Mini-PROTEAN 3 Cell Lock Katod (svart) Elektrodram Tvingram Minitank 3

3 Western blot ECL -Wsternblotting är en icke-radioaktiv teknik som går ut på att, genom förstärkt kemiluminescence, synliggöra proteiner som separerats, efter storlek, med hjälp av SDS-PAGE. Metoden fungerar på så sätt att proteinet förs över från SDS-gelen till ett membran där proteinet immobiliseras. Efter en blockering av icke-specifika bindningssäten på membranet fästs en primär specifik antikropp till proteinet av intresse. En sekundär antikropp med en etikett (oftast ett enzym) binds till den primära antikroppen varpå etiketten detekteras genom en lämplig enzymatisk reaktion. I den här laborationen används ett PVDFmembran som matrix för immunoblottingen. Blockeringen görs med 3% gelatin. De primära antikropparna som används är specifika mot de fosforylerade formerna av de två mitogenaktiverade protein kinaserna (MAPK) ERK och p38. Den sekundära antikroppen är konjugerad med horseradish peroxidase (HRP). HRP katalyserar oxidationen av luminol till en mer exciterad nivå, som då den återgår till grundnivån, emitterar ljus med emissionsmaximum vid 425 nm. Det emitterade ljuset kan sedan detekteras på en blåljus-känslig film. Närvaron av fosforylerade proteiner framträder som mörka band på filmen. I laborationen kommer BIO RAD Mini Trans- Blot Electrophoretic cell användas för att föra över proteinet från SDS-gelen till PVDF-membranet (fig 5). Elektrodmodul Lock Fiberkudde Filterpapper Membran Gel Filterpapper Fiberkudde Kassett Bio-Ice-kylkloss Behållare Fig 5. BIO RAD Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell. Flödescytometri Flödescytometri är en metod som går ut på att på optisk väg bestämma enskilda cellers beståndsdelar och strukturella egenskaper. Varje cells storlek och komplexitet kan beräknas genom att mäta hur ljuset sprids då cellen belyses med laserljus. Dessutom kan intracellulära förändringar studeras genom att, vid olika våglängder, mäta det fluorescerande ljus som emitteras då lasern exciterar vissa molekyler i cellen. I den här laborationen används fluorokromen Hydroethidine för att mäta den intracellulära produktionen av fria syreradikaler vid stimulering med PMA och fmlp samt vid behandling av cellerna med de specifika kinasinhibitorerna PD98059, SB och wortmannin. Hydroethidine (dihydroetidiumbromid) är ett ämne som fluorescerar med blått ljus och som oxideras till etidiumbromid av framförallt superoxidjoner. Etidiumbromid exciteras av blått ljus med excitationsmaximum vid 473 nm och fluoroscerar med rött ljus med emissionsmaximum vid 593 nm. Genom att, med blått ljus, belysa celler laddade med Hydroethidine kan därför produktionen av fria syreradikaler mätas som en ökning av fluorescensintensiteten av rött ljus. Flödescytometern har en 15 mw argonjonslaser med en excitationsvåglängd på 488 nm. Fluoroscensen mäts i intervallet nm. 4

4 Metod Granulocytpreparation Notera: Granulocyter kan adherera till glas. Allt material som kommer i kontakt med granulocyterna bör därför bestå av plast. 1. Poola 7 citratrör (ger ca 24 ml) med blod i ett Falconrör (50 ml). 2. Tillsätt lika stor volym fysikalisk koksaltlösning (0.9%) till Falconröret. 3. Sätt 10 ml ficoll-paque lösning vardera till två Falconrör. 4. Tag 24 ml blod-koksaltlösning och för mycket försiktigt över till var och ett av Falconrören med ficoll-paque. (Blodet ska skikta sig ovanpå ficoll-paque-lösningen). 5. Centrifugera vid 400g (1600 rpm) i 40 minuter. Använd låg broms (= 1). 6. Ta av plasma/koksalt-lösningen (8ml/rör) och spara. Lämna ca 1 cm plasma ovanför lymfocytfraktionen. 7. Ta av lymfocytfraktionen och kasta. 8. Sug bort resten av plasma/koksaltlösningen. 9. Ta av ficoll-paque-lösningen till ca 1 mm ovanför erytrocytfraktionen och kasta. 10. Tillsätt 20 ml speciell PBS med glukos (PBSg). 11. Centrifugera vid 500g i 10 minuter. 12. Sug upp och kasta bort supernatanten. 13. Tillsätt 8ml plasma-/koksaltlösning (från punkt 6) och 2,4 ml 6% dextran-lösning. 14. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned några gånger. 15. Låt sedimentera i minuter. 16. Sug upp den granulocytrika buffy-coaten från båda rören och för över till ett nytt falconrör. 17. Centrifugera vid 400g i 8 minuter. 18. Kasta supernatanten och tillsätt 24 ml avjonat vatten. Pipettera upp och ned i 24 sekunder. 19. Tillsätt 8 ml koksalt-lösning (3,5%) och pipettera upp och ned i 15 sekunder. 20. Fyll upp till 50 ml med spec. PBSg. 21. Centrifugera vid 400g i 8 minuter. 22. Kasta supernatanten och resuspendera pelleten i 15 ml spec PBSg. Förvara cellerna på is. Stimulering av neutrofiler Kinasaktivitet Prov Tid 1. För över 1 ml cellsuspension till var och ett av 6 st eppendorfrör med skruvlock. Späd den kvarvarande cellsuspensionen i Falconröret (50 ml) till 10 ml med PBSg och förvara på is för senare användning. 2. Förvärm rören med cellsuspension i 5 minuter vid 37ºC i ett vattenbad. 3. Stimulera cellerna enligt: 0 min 10min μl PMA μl fmlp 4 1 μl Wortmannin μl Wortmannin 1 μl PMA 6 1 μl Wortmannin 1 μl fmlp Dvs. Efter förvärmningen sätts 1 μl wortmannin (150 um) till prov 4 6. Tio minuter senare sätts 1 μl PMA (150 um) till prov 2 och 5, och 1 μl fmlp (2,3 mm) till prov 3 och 6, inkubera i ytterligare 5 minuter. Notera: Alla prov inkuberas lika länge (20 minuter), men stimuleras med olika stimuli under olika tider. 4. Avbryt stimuleringen genom centrifugering vid 3000 rpm i 3 minuter på en mikrocentrifug. 5

5 5. Sug bort supernatanten med en automatpipett (1 ml). 6. Resuspendera cellerna i 80 μl Laemmlies provbuffert. 7. Koka proverna i 5 minuter. Viktigt! Proverna måste koka i minst 5 minuter 8. Låt proverna kylas till rumstemperatur. 9. Centrifugera proverna vid 3000 rpm i 3 minuter. 10. Frys proverna, för att använda dag 2. Superoxidjonsproduktion 11. Sätt 1 ml cellsuspension vardera till 9 st flödescytometeranpassade Falconrör. 12. Sätt 1 l Hydroethidine (1mg/ml) till varje rör. 13. Inkubera i vattenbad vid 37 C i 10 minuter. 14. Stimulera cellerna enligt: Prov Tid 0 min 10 min μl PMA (150 um) μl fmlp (2,3 mm) 4 1 μl Wortmannin (150 um) 1 μl PMA 5 1 μl Wortmannin 1 μl fmlp 6 1 μl PD98059 (50 mm) 1 μl PMA 7 1 μl PD μl fmlp 8 1 μl SB (10 mm) 1 μl PMA 9 1 μl SB μl fmlp Dvs. Efter inkubationen i steg 13 sätts 1 μl Wortmannin till prov 4 5, 1 μl PD98059 till prov 6 7 och 1 μl SB till prov 8 9. Proverna inkuberas i 10 minuter varpå 1 μl PMA sätts till prov 2, 4, 6 och 8 och 1 μl fmlp sätts till prov 3, 5, 7 och 9. Inkubera i ytterligare 5 minuter. Notera: Alla prov inkuberas lika länge (20 minuter), men stimuleras med olika stimuli under olika tider. 15. Analysera proverna direkt på flödescytometern. 6

6 SDS-PAGE 1. Sätt ihop gelkassetten enligt fig Placera en kam i gelkassetten och märk glaset en centimeter under kammens nedre kant. a. Placera den korta plattan mot upphöjningen på den långa plattan. b. Sätt ned de två plattorna i gjutramen med den lilla plattan mot dig. c. Lås tryckkammarna. d. Sätt fast gjutramen i gjutstället. Fig 6. Montering av Mini-protean 3 gelkasset 7

7 3. Förbered separationsgelmonomeren och häll lösningen försiktigt i gelkassetten. 4. Täck försiktigt lösningen med avjonat vatten. (häll up till kanten av gelkassetten). 5. Låt gelen polymeriseras i ca 1 timme. 6. Sug bort vattnet helt med filterpapper. 7. Förbered staplingsgelmonomeren och häll den mellan glasplattorna upp till kanten av den korta plattan. 8. Placera en kam av önskad storlek mellan glasplattorna och rätta den efter den korta plattan. 9. Låt staplingsgelen polymeriseras i 45 minuter. 10. Tag försiktigt bort kammen och tvätta brunnarna ett par gånger med avjonat vatten. Sug bort vattnet med filterpapper klippt i smala strimlor. 11. Förbered den inre kammaren enligt fig 7. a. Ta loss gelkassetten från gjutramen. b. Placera gelkassetten i elektrodramen med den korta plattan inåt. c. Sätt ned elektrodramen med gelkassetten i tvingramen. d. Tryck ned elektrodramen samtidigt som de två kammarna trycks in. e. Sänk ned den inre kammaren i Minitanken. Fig 7. Montering av Mini-PROTEAN 3 Cell 12. Fyll den inre kammaren med ca 125 ml elektrodbuffert tills nivån når halvvägs mellan den höga och låga plattan. 8

8 13. Häll ca 300 ml elektrodbuffert till minitanken. 14. Placera Bio Rads provladdningsguide mellan de två gelerna. 15. Ladda 20 l prov på varje brunn med hjälp av gelladdningsspetsar. 16. Ta bort provladdningsguiden och sätt på locket. (Var noga med att matcha färgerna på locket med färgerna på bananpluggarna. 17. Plugga i kontakten i spänningsaggregatet och kör gelelktroforesen enligt: 100 V genom staplingsgelen. 200 V genom separationsgelen. SDS-PAGE tar ca 1 timme att köra på det här viset. Under tiden SDS-PAGE går förbered för transfer enligt steg 1 3 i protokollet för western blot nedan. 18. Stäng av spänningsaggregatet efter att elektroforesen är klar. 19. Tag bort locket och lyft ut den inre kammaren. 20. Häll bort elektrodbufferten inuti den inre kammaren. 21. Öppna ramen och tag ut elektrod assemblyn. 22. Tag loss gelkassetten och separera de två glasplattorna försiktigt. 23. Tag bort staplingsgelen. 24. Lossa separationsgelen från glasplattan genom att sänka ned den i transferbuffert och skaka försiktigt. Western blotting Notera: Använd alltid handskar då membranen hanteras. 1. Klipp membranen och filterpapperen till rätt storlek. (Använd en Fiberkudde som mall och gör filterpapperen och membranen en halv centimeter mindre runtom.) 2. Lägg membranen i metanol i 15 sek. 3. Blötlägg membranen, filterpapperen och fiberkuddarna i transferbuffert under 1 timme. 4. Lägg gelen i transferbuffert under 15 minuter. 5. Förbered gelsandwichen (fig 8). Placera kassetten, med den grå sidan nedåt, på en ren yta. Lägg en fiberkudde på den grå ytan. Lägg ett lager av fyra filterpapper på fiberkudden. Placera gelen på filterpapperet. Lägg membranet ovanpå gelen. Avsluta sandwichen med att placera ett lager av fyra filterpapper ovanpå membranet och en fiberkudde ovanpå filterpaperen. Fig 8. Preparation av en gelsandwich Viktigt: Avlägsna eventuella luftbubblor I sandwichen genom att försiktigt rulla ett plaströr över sandwichen. Fiberkudde Filterpapper Membran Gel Filterpapper Fiberkudde 6. Stäng kassetten varsamt. (var noga med att inte röra på gel- och filterpappers-sandwichen. 7. Placera kassetten i modulen. Upprepa för den andra kassetten. 8. Lägg en magnetomrörare i behållaren för att kunna behålla en jämn temperatur och jonkoncentration i lösningen. 9

9 9. Placera modulen i behållaren. 10. Placera Bio-Ice kylklossen i behållaren. 11. Fyll behållaren helt med transferbuffert. 12. Sätt på locket och plugga in kablarna i spänningsaggregatet. Ställ in aggregatet på: 100V 350mA 60 min. med konstant spänning. 13. Kör blotten. 14. Då körningen är klar, plocka isär sandwichen och ta loss membranet för framkallning (OBS! Från och med nu och fram till steg 22 nedan är det viktigt att membranet inte torkar ) 15. Tvätta cellen, fiberkuddarna och kassetten noggrant med diskmedel och skölj med avjonat vatten. Framkallning av resultat Blockering 1. Lägg membranen i varsitt hybridiseringsrör med 30 ml 3% gelatin (löst i TTBS) 2. Blockera i 1 timme vid rumstemp. i hybridiseringsugn 3. Skölj membranen snabbt i 30 ml TTBS. Inkubation med primärantikropp 4. Häll 10 ml primärantikroppslösning (spädning 1:3000) i hybridiseringsrören ( antifosfo-erk antikropp i ett rör och antifosfo-p38 antikropp i det andra). 5. Inkubera över natt. 6. Häll av antikroppslösningen och spara (frys). 7. Häll 30 ml TTBS i varje rör. 8. Tvätta i 10 minuter. 9. Häll bort TTBS. 10. Upprepa steg 7 9 fyra gånger. Inkubation med sekundärantikropp 11. Häll 10 ml sekundärantikroppslösning (spädning 1:3000) i varje rör. 12. Inkubera i 1 timme. 13. häll bort antikroppslösningen (kastas). 14. Häll 30 ml TTBS i varje rör. 15. Tvätta i 10 minuter. 16. Häll bort TTBS. 17. Upprepa steg fyra gånger. Inkubation med ECL-reagens 18. Spänn upp plastfolie på en bänk. 19. Lägg membranen på plastfolien. 20. Häll 5 ml ECL-reagens över varje membran. (Vätskan ska täcka membranet helt, men får inte rinna utanför) 21. inkubera under 4 minuter. 22. Häll av lösningen genom att hålla membranen med ena sidan mot en pappershanduk. 23. Lägg plastfolie runt membranen. 24. Tejpa upp de plastfolieinslagna membranen i exponeringsboxen. Exponering och framkallning 10

10 OBS! Jobba i mörkerrum under steg (Rött ljus kan användas) 25. Lägg en röntgenfilm i exponeringsboxen. 26. Exponera i sekunder. 27. Lägg filmen i framkallningsvätska. (Band kommer att framträda efter ca en halv minut) 28. Flytta över filmerna till fixeringsvätska. Låt ligga i ett par minuter. 29. Flytta över filmerna till ett vattenbad. 30. Häng upp filmerna för torkning. Flödescytometri Kontrollpanel Optiklucka På/avstängningsknapp Provinsprutningsport Vätskeutrymme Fig 9. Becton Dickinson Flödescytometer. Flödeskontrollpanel Notera, Protokoll för daglig uppstart och avstängning av flödescytometern finns vid instrumentet 1. Starta flödescytometern och datorn enligt protokoll. För att samla in och analysera data om cellerna använder vi oss av programmet Cellquest. 2. För att starta Cellquest: klicka på äpplet längst upp till vänster på skärmen. Välj Cellquest. Då Cellquest startas öppnas ett nytt experiment dokument. För att kunna samla in data krävs att en plot skapas. Enklast är att skapa en dot plot där side scatter (cellens granularitet/komplexitet) plottas mot forward scatter (cellens storlek). 3. Klicka på dot plot i verktygsfältet (fig 10). 4. Klicka på en tom yta i experiment dokumentet och (med knappen intryckt) drag diagonalt tills konturen för dotploten har önskad storlek. Histogram plot Density plot Dot plot Fig 10. De plottar som kan väljas i Cellquests verktygsfält. 11

11 Då knappen släpps visas en plot dialog -ruta. 5. I plot dialog -rutan, välj Acquisition från plot source-pop up menyn. 6. Klicka på OK. En Acquisition dot plot visas i experiment dokumentet. Innan insamling av data kan startas måste de parametrar som ska analyseras och det antal celler som skall analyseras definieras. Dessutom måste destinationen där data skall sparas anges. För att välja vilken mapp era resultat skall sparas i: 7. Klicka på Acquire i menyn högst upp på skärmen. 8. Välj Parameter description. Parameter description -fönstret visas. 9. I parameter description fönstret klicka på folder. 10. Klicka på pop up menyn under texten Chose destination folder. 11. Välj Facscan. 12. Välj Användare. 13. Välj Student. 14. Välj BILD Välj den grupp ni tillhör (¼ av klassen tillhör grupp 1, ¼ tillhör grupp 2 etc.). 16. I mappen med er grupptillhörighet, Skapa en ny personlig mapp. Klicka på new. Döp mappen. Klicka på Create. 17. Tryck på Select ert mappnamn från steg 16. För att döpa era resultat: 18. Välj file. 19. Döp era filer till något personligt genom att skriva in något passande i fältet bakom Custom prefix. 20. Se till att File count är ettstäld vid analysen av ert första prov (den räknar sedan upp automatiskt). 21. Tryck OK. 22. Flytta Parameter description -fönstret längst till höger på skärmen. Genom att ta fram en räknare kan ni följa insamlandet av er data. 23. Klicka på Acquire. 24. Välj Counters. Counters -fönstret visas. 25. Behåll counters -fönstret öppet och flytta det ned till botten av skärmen. För att kunna analysera proverna krävs att datorn kopplas upp mot flödescytometern och att de inställningar som cytometern får vid kalibrering ställs in. 26. Klicka på Acquire. 27. Välj Connect to cytometer. Ett fönster med namnet Acquisition control visas. 28. Klicka i den kryssade rutan till vänster om Setup. Rutan skall inte vara kryssad. Behåll fönstret öppet och flytta det längst ned på skärmen. 29. Klicka på Cytometer på menyn högst upp på skärmen. 30. Välj Instrument settings. Instrument settings -fönstret visas. 31. Klicka på open. 32. I pop up menyn som nu förmodligen har samma namn som er personliga mapp, 33. välj FACScan. 34. Välj BDfiles. 35. Välj Instrument settings files. 36. Välj calib file. 12

12 37. Klicka på Set följt av Done. Instrumentets senaste kalibreringsvärden är nu inställda och instrumentet är klart att använda. 38. Se till att flödescytometerns flödeskontrollpanel står i run-läge. 39. För armen vid prov insprutningsporten åt sidan och sätt dit det första provet. 40. För tillbaka armen. 41. Klicka på Acquire i Acquisition control -fönstret. Provet analyseras nu (det bör ta mellan 15 och 30 sekunder). 42. Upprepa steg för alla proverna. 43. Då alla prover analyserats: Sätt tillbaka provröret med facs flow till provinsprutningsporten. Sätt flödescytometern i standby. Resultaten sparas nu i de filer och i den katalog som angavs i steg Viktigt, Flödescytometern ska alltid vara i standby-läge då inga prover analyseras. För att analysera resultaten: 44. Klicka på ert experiment dokument (för tillfället döpt till untiteled ). 45. Klicka på edit i menyn längst upp på skärmen. 46. Välj Clear. 47. Klicka på histogram i verktygsfältet. 48. Klicka på en tom yta i experiment dokumentet och (med knappen intryckt) drag diagonalt tills konturen för dotploten har önskad storlek. Då knappen släpps visas en plot dialog -ruta. 49. I plot dialog -rutan, välj Analysis från plot source -pop up menyn. 50. Klicka på select file. 51. Välj Facscan. 52. Välj Användare. 53. Välj Student. 54. Välj BILD Välj er grupptillhörighet. 56. Välj er mapp (som ni skapade i steg 18 21). 57. Markera den fil ni vill analysera. 58. Klicka Open. 59. Välj FL2 som parameter. 60. Klicka på OK. Ploten visas i experiment dokumentet. 61. Konstruera ett histogram för varje prov som körts. Till varje histogram kan statistik visas. 62. Markera ett histogram genom att klicka på det. 63. Klicka på stats på menyn högst upp på skärmen. 64. Välj Histogram stats. En statistikruta visas. För att göra statistiken mer överskådlig kan den mesta informationen i statistikrutan tas bort. 65. Klicka på Stats. 66. Välj edit histogram stats. Den information som kommer att visas i statistikrutan är markerad med ett kryss. 67. Välj bort all information utom File name, Acquisition date, total events, median, peak och peak channel. 13

13 68. Anpassa ramen omkring statistikrutan genom att klicka i ett av hörnen och drag med musknappen intryckt till önskad storlek. 69. Lägg varje statistik ruta intill motsvarande histogram (alla histogram med statistik bör få plats på en A4- sida). 70. Skriv ut resultaten på papper. Markera experiment dokumentet genom att klicka på det. Klicka på File i menyn högst upp på skärmen. Välj Print one. Papper med era resultat skrivs ut. 14

14 Karlstads universitet Kemiinstitutionen KBK420/BILD01 Lösningar: Granulocytpreparation: Fysiologisk koksaltlösning (0,9%) Åtgång ca 150 ml/grupp. 9 g NaCl löses i avjonat vatten. Sterilfiltreras. Speciell PBS med glukos (PBSg) Åtgång ca 100 ml/grupp. Brukslösning: 10 ml Stamlösning A 10 ml Stamlösning B Späd till 100 ml med NaCl (0,9%) Stamlösning A (100ml) 15 mm KH 2 PO mm Na 2 HPO 4 Korrigera ph till 7,4 Sterilfiltreras Stamlösning B (100ml) 27 mm KCl 4,9 mm MgCl 2 9 mm CaCl 2 0,125% glukos Sterilfiltreras Dextranlösning (6%) Åtgång ca 5 ml/grupp. Till 10 ml: 0,6 g dextran T500 löses i 10 ml fysiologisk koksaltlösning. SDS-PAGE Elektrodbuffert Åtgång ca 500 ml/elektroforeskörning. Till 1 L: 3.03 g Tris 14,4 g Glycin 1 g SDS 15

15 Karlstads universitet Kemiinstitutionen KBK420/BILD01 0,5 M Tris-HCl, PH 6,8 6 g Tris 60 ml avjonat vatten Ställ PH till 6,8. Späd upp till 100 ml med avjonat vatten. 1,5 M Tris-HCl, PH 8,8 27,23 g Tris 80 ml avjonat vatten Ställ ph till 8,8. Späd till 150 ml. 10 % SDS Lös 10 g SDS i 90 ml avjonat vatten. Späd upp till 100 g. 10% APS (Görs ny varje dag) 100 mg Ammoniumpersulfat. Löses i 1 ml avjonat vatten. Separationsgel-monomer Åtgång ca 10 ml/grupp (ger ca 9% ig gel) 4,4 ml dest. vatten 3,0 ml Bis/Akrylamid 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 0,1 ml 10% SDS 5 l TEMED 50 l 10%-ig APS Staplingsgel-monomer Åtgång ca 5 ml/grupp 3,05 ml dest. vatten 0,65 ml Bis/Akrylamid 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 0,05 ml 10% SDS 5 l TEMED 25 l 10%-ig APS 16

16 Karlstads universitet Kemiinstitutionen KBK420/BILD01 Laemmlies provbuffert med proteashämmare Åtgång ca 1 ml/grupp. Till 1 ml: 3,55 ml avjonat vatten 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl, PH 6,8 2,5 ml glycerol 2,0 ml 10% (w/v) SDS 0,2 ml 0,5% (w/v) bromfenolblått Tillsätt följande precis innan användning: 50 l -Mercaptoetanol (6 l Vanadat (100 mm)) 4 l PMSF (500 mm) (1 l Aprotinin (10 mg/ml)) 1 l Leupeptin (10 mg/ml) Immunoblotting Transferbuffert Åtgång ca 500 ml/transfercell 25 mm Tris 192 mm glycin 20% v/v methanol Metanol (100%) Åtgång ca 10 ml/transfer (kan återanvändas) Antikroppslösning Åtgång ca 10 ml/grupp och antikropp. Primärantikroppar 3 l antifosfo-erk-antikropp i 10 ml TTBS. 3 l antifosfo-p38-antikropp i 10 ml TTBS. Sekundärantikropp 3 l HRP-konjugerad IgG-antikropp i 10 ml TTBS. Trisbuffrad saltlösning med 0,1% Tween (TTBS) Åtgång ca 1 liter/grupp. 17

17 Karlstads universitet Kemiinstitutionen KBK420/BILD01 Till en liter: 2,42 g Tris 8,0 g NaCl Ställ ph till 7,6 med HCl 1 g Tween 20 ECL-reagens (Prepareras precis innan användning) Åtgång ca 10 ml/grupp. Blanda 2,5 ml peroxidlösning med 2,5 ml Luminol/enhancer-lösning. 18