T cells aktivering. Kursbok: The immune system Peter Parham Kapitel 6 Primary Immune response: First encounter of naive T cells with antigen on APC. This happens in the secondary lymphoid tissues. Priming = T cell aktivering Activation of naive T cells on initial encounter with antigen on the surface of an APC, which distinguish it from the responses of armed effector T cells to antigen on their target cells or the response of primed memory T cells. The co-stimulatory signal is an essential part of the priming process. Memory (Minne): Skapandet av minnesceller är inte riktigt förstått idag. Dessa celler skiljer sig från aktiverade celler genom att inte delta i försvaret vid första infektion. De kommer att likna naiva T celler och vara coola tills nästa infektion med samma patogen. Svaret kommer då att vara mycket mera effektiv och snabb. APC är nödvändiga för att aktivera minnesceller. 1
När de naiva T cellerna har fullföljt deras utveckling i tymus, går de vidare via blodet till de perifera lymforganerna. De recirkulerar mellan blodet och periferin tills de träffar på antigenet. För att kunna bekämpa patogen effektivt, måste naiva T celler proliferera och differentiera till mogna effektor celler (armed effector cells). Effektor celler kan antingen stanna kvar i lymfkörteln eller migrera till infektionen. Olika typer av effektor celler: 1) Peptider som kommer från patogen som förökar sig inom cytosolen kommer att presenteras på MHC klass I till CD8 T celler (cytotoxiska mördar celler), som dödar alla infekterade celler. 2) Peptider som kommer från patogen som förökar sig inom intravesikulära område, eller som kommer från fagocyterade bakterier eller toxiner, presenteras på MHC klass II till CD4 T celler som då differentieras till två olika typer av T hjälper celler. 2
Första mötet mellan de naiva T cellerna och antigen sker i de perifera lymforganerna. Infektion i periferin: lymfkörtlar Infektion i blodet: spleen (mjälte) Infektion i mukösa ytor: Peyer s patches Det viktigaste APC är DC (Dendritiska Celler). 3
Cell adhesion molecules: Möjliggör att T celler kommer in via HEV. Tillåter en bättre kontakt mellan T celler och APC. Stabiliserar kontakten mellan T-celler och target celler. 4
5
Aktivering av en T cell påverkar kraftfullt uttrycksnivåerna av olika molekyler på deras yta. LFA-1: Lymphocyte function associated antigen-1. ICAM: Intercellular adhesion molecule. 6
När lymfocytens TCR binder till APCs MHC, så förändras LFA-1 konformation, som får en starkare affinitet till sina ligander, ICAM-1 och ICAM-2. 7
T cells aktivering kräver 2 oberoende signaler 8
Varför 2 signaler?: Mest för att förminska riskerna för autoimmun igenkännande. Ifall en CD8 T cell blir primad av en APC för närvaro av ett virus, så kommer den att döda alla infekterade celler. Men ifall en CD8 T cell känner igen en MHC + self peptid utan att få en co-signal så kommer lymfocyten att bli ANERGISK. Den kan inte längre reagera till något och bli o-funktionell. Anergi innebär att lymfocyten inte kan producera IL-2. CTLA-4 s roll är att stänga av signalen för proliferation (efter en viss tid) 9
Signal Transduktion: Konversion från en form till den andra. Ytcells receptorer aktiverar intracellulära signaler. De översätter en extern signal till ett intracellulärt meddelande. Signalen är transformerad till en suite av biokemiska kontakter som delas ut i olika delar av cellen, underhålls och amplifieras tills det utmynnar i nukleus, där aktivering av olika transkriptionsfaktorer aktiverar genuttryck. Receptorer = transmembran proteiner eller protein komplex som länkar den yttre världen till den inre. Receptorn undergår en konformationsändring, den binder bättre eller sämre till molekyler inuti cellen. Konformationsändringen påverkar utseende på delar av den intracytoplasmiska delen av receptorn. Receptorn öppnar en kanal där olika joner kan glida igenom. Hur fungerar det egentligen för signal transduktion för sådana membran receptorer som BCR eller TCR? Den intracytoplasmiska delen av TCR eller BCR binds av receptor-associerade tyrosin kinaser. Src familjen spelar en central roll här. De blir aktiverade så fort som receptorn har bundit en ligand (MHC eller en patogen i B cellernas fall). Src molekylerna kommer att sätta igång en kaskad av intracellulära signaler hela vägen till nukleus. De två viktigaste medlemmar av Src familjen är SH2 och SH3 domäner (Src homology 2 eller 3 domains). Fosforylering är snabb och reversibel (proteinfosfataser plockar bort fosfatfrupperna). Fosforylering skapar ett nytt bindning område för andra proteiner som rekryteras från inuti cellen. Den första effekten är att alla kaskadens proteiner som binder på den fosforilerade delen av receptorn ansamlas på ett begränsat område: koncentration. 10
10 ITAMs Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif. Protein Tyrosin Kinaser (Fyn, ZAP-70). 11
Aktivering av signalen via TCR involverar många steg som måste stämma: 1) TCR-MHC kontakt 2) Protein Tyrosin kinaser fosforilerar 10 ITAMs på CD3 och speciellt ζ. 3) Protein tyrosin kinas ZAP-70 binder till den fosforilerade ζ. 4) Lck som är länkad till CD8 eller CD4 binder till ZAP-70, fosforilerar den och aktiverar den. 5) ZAP-70 aktiverar LAT (linker of activation in T-cells) och SLP-76. 12
Makrofager: del av första försvarslinje. Engulferar allt främmande och förhindrar på så viss att det skall ske någon skada. MHC klass II och B7 uttrycksnivåer ökar kraftfullt direkt efter intagningav ett patogen. Macrophage mannose & scavenger receptors: specifika för bakterie delar. Dessa receptorer spelar en viktig roll vid intagning av patogen men kan också agera som kostimulatoriska molekyler. Kupffer celler i levern & makrofager i spleen: Specialiserade på att äta upp döda celler. 13
DC: skapas i benmärgen varifrån de migrerar till blodet och till de perifera vävnaderna. Omogna DC har låg MHC uttryck,men är väldigt bra på att spontant eller via specialiserade receptorer (DEC 205) att fagocytera eller makropinocytera antigen. Vid infektion, ändrar de karaktär, slutar käka in saker och istället ökar betydligt MHC klass I & II presentation, adhesionsmolekyler och kostimulatoriska molekyler såsom B7. De uttrycker DC-CK, en kemokin som attraherar naiva T celler. Fagocytos Kemokin som attraherar T celler 14
Ingen ko-stimulatorisk signal behövs för den fullt utvecklade cytotoxiska effektor cell. Klonal expansion From immature to mature dendritic cells Mature DCs, lose capacity to take in antigen, express B7, high levels of adhesion molecules and MHC expression. Immature DCs Take in antigen very efficiently, and then migrate towards peripheral lymphatic system; low levels of MHC expression. 15
Aktiverade T celler sekreterar IL-2 och svarar till IL-2 Den ko-stimulatoriska signalen sätter igång IL-2 tillverkning som meddelar åt T cellen att den skall börja proliferera och differentiera. B-celler: Internaliserar patogen mycket specifikt och effektivt genom sina antikroppar. Delar av intagna bakterier inducerar högre uttryck av B7. 16
The differentiation of CD4 T cells into Th1 or Th2 cells determines whether humoral or cell-mediated immunity will predominate. IL-12 IFN-γ IL-4 IL-6 Cytokine environment IL-4 and IL-6 give Th2 predominance IFN-γ and IL-12 give Th1 predominance Different pathogens trigger different innate immunity mechanisms that favor one cytokine environment over the other. 17
The differential capacity of pathogens to interact with macrophages, NK cells and NK1.1 CD4 T cells influence the overall balance of cytokines present early in the immune response. This does determine whether Th1 and Th2 cells develop preferentially to bias the adaptive immune response towards a cellular (MØ) or humoral responses (B-cells). Macrophage activation Antibody production activation Th1 och Th2 producerar cytokiner som stänger av Th2 respektive Th1 svar. De regulerar varandra. När den ena subsets svar har blivit dominant, blir det mycket svårt (omöjligt) att skifta tillbaka till det andra subset. 18
Alteration in TCR CDR2 changes differentiation of CD4 T cells from Th1 to Th2 TCR (D10) Proliferation CDR2α CDR3α&ß CDR3ß H R G A I E W E G P1 P4 P6 P9 C P M Peptide (µm) D10 D10 (L51S) MHC II (I-A k ) Mutations in presented peptide influence CD4 T cell activation and differentiation Exp. Set-up: MHC II constant TCR constant Altered peptide ligand (APL) APL stim. APL stim. IL-4 production in Th2 clone, but not proliferation Th1 clone expresses IL-2R, cytotoxic function but not cytokine production APL of high affinity = Th1 APL of lower affinity = Th2 Evavold et al, Science 292:1991 & J. Immunol. 150:1993 19
Interactions MHC-peptide + TCR Longer duration of contact Full signal through TCR Partial signal through TCR Th1 Th2 The duration of contact is influenced by: High density of peptide-mhc ligand on APC The stability of the complex MHC-peptide Half-life of TCR-peptide-MHC complexes Peptid mängd och peptid kvalitet (sekvensen) påverkar CD4 Differentiering Stora mängder peptid = Th1 low density presentation = Th2 stark interaktion mellan MHC/peptid och TCR = Th1 Svag interaktion mellan MHC/peptid och TCR = Th2 20
Summary of factors influencing effector T cell subtype Ag presentation pathway MHCI / MHCII Dose of Antigen Interactions MHC-peptide + TCR Cytokine environment Lepra: Man får lepra av mycobacteria leprae som växer i makrofagernas vesiklar. Ett effektivt svar skulle vara ett Th1 påverkat svar där makrofagen skulle döda innehållet i sina vesiklar. Patienterna som svarar med ett Th1 svar brukar överleva med olika hud och nerv skador (Tuberculoid leprosis). Om patienterna råkar utveckla ett Th2 svar, så kan inte det humorala svaret hjälpa till eftersom antikropparna inte kommer åt. Patienten dör (Lepromatous leprosis). Allmänt sagt så är de flesta autoimmuna sjukdomar kopplade till Th1 medan allergier är kopplade till Th2. 21
DC är de enda APC kapabla till att ge en ko-stimulatorisk signal stark nog för att aktivera naiva CD8 T-celler. I vissa fall, kan en CD4 effektor cell hjälpa till att aktivera naiva CD8 då de t.ex. läser patogen närvaro i samma APC. En naiv CD4 T cell kan induceras till att producera IL-2. CD8 som har fått endast signal 1 producerar i IL2R och på så sätt bli aktiverad indirekt. 22
De olika typer av T celler är specialiserade på att identifiera och bekämpa patogen på olika sätt. En av de väsentligaste skillnaderna mellan effektor och naiva T celler är att de inte behöver co-stimulering längre. Olika kemotaktiska faktorer samt förändringar i adhesion molekyler attraherar CD8 T celler till inflammationen. Mängder av CD2 och LFA-1 uttrycks på ytan av CD8 T cellen; de möjliggör en stabil bindning till vanliga celler som inte har så många adhesionsmolekyler. Kontakten mellan CD8 och target cell är ganska kort, CD8 T cellen dödar och går vidare. CD4 T cellens kontakt med MØ eller B-celler är mycket mera långvarig. T-celler använder sig av cytokiner och cytotoxiner för att döda och för att kommunicera. Cytokiner produceras av alla T-celler och används för att kommunicera med target celler och förändra deras beteende. Cytotoxiner som produceras endast av CD8 T celler används för att döda på ett mycket specifikt sätt target celler. 23
Kontaktytan mellan en T-cell och en target cell. En antigen-specifik TCR kontrollerar hur effektor signaler kommer fram till target celler på 3 olika sätt: Stabil bindning till target cellen, samt skapande av en tight kontaktyta, där effektor molekylerna kan koncentreras. Omorientera hela produktion apparaten + cytoskeleton inom T-cellen så att hela produktionsenergin fokuserar på target cellen. Triggar produktion och utsöndring mot target cellen. 24
Cytokines are small soluble proteins secreted by one cell that can affect the behavior or properties of the cell itself or of another cell. CD8 T celler släpper ur IFNγ, som blockerar viral replication eller kan i vissa fall döda viruset. Th2 Th1 IL-4, IL-5 + B cells IL-10 - makrofager IFNγ + makrofager LTα + makrogager TNFβ - B cells Cytokiner tillhör tre stora strukturella familjer: Hematopoietin Receptor Familjen (IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, etc...). TNF-receptor Familjen (CD40, Fas, CD30, CD27...). Kemokine-receptor Familjen (CCR1-5, CXCR1-4). Cytokiner: 1) autocrine: påverkar de cellerna som tillverkar dem (t.ex. IL-2). 2) paracrine: påverkar celler inom den närmaste omgivningen (t.ex. IL-2). 3) endocrine: transporteras t.ex. via blodet till andra områden där andra celler påverkas. JAK: Janus Kinas familj STAT: Signal transducer and activator of transcription Många cytokiner som skapas av T-celler är interleukiner (IL). Viktiga membranbundna cytokiner: TNF-α CD40L FasL (messenger of death) 25
Vägen från cytokin/cytokin receptor bindning och aktivering till aktivering av transkription faktorer går relativt snabbt via kinaser. 26
Virus måste ta över cellens produktionsmekanismer för att själv kunna överleva genom att producera virioner. När de är väl inne i cellen, blir de omöjliga att nås av antikroppar. Det enda sättet att ta koll på dem är att förstöra hela den infekterade cellen. CD8 T celler försöker kontrollera infektioner som t.ex. virus, intracytoplasmiska bakterie invasioner och några specifika protozoa infektioner (Toxoplasma Gondii). CD8 T cellerna måste gå en balansgång mellan att döda infekterade celler och undvika att eliminera normala celler. De löser, oftast, detta genom en otrolig effektivitet samt en stark specificitet för det som skall dödas. CD 8 T celler släpper ut massor med cytokiner: t.ex. IFN-γ som inhiberar virus replication, ökar MHC klass I uttryck, aktiverar MØ... CD8 effektor cellen är en mycket specifik serial killer. CD8 T celler inducerar apoptos i target cellerna. apoptos = programmerad cell död. Den nukleära DNA fragmenteras i 200bp bitar av nukleaser. CD8 T celler dödar sina target celler genom att injicera dem med produkter som kan programmera apoptos inom 5 minuter. All DNA som finns i cellen inkluderat virusets tuggas sönder. 27
Lytic granules: börjar att fyllas med cytotoxiner så fort CD8 T cellen aktiverats. GA: Golgi apparatus. MTOC: Microtubule Organizing Center. CAM: Cell Adhesion Molecule. Perforiner + granzymer (serin proteaser som aktiverar apoptos). Fas/fas ligand triggar den programmerade cell döden (apoptos) 28
Det är Th1 celler som dirigerar makrofagernas destruktiva aktioner = kallas för makrofag aktivering. Mest av tiden, så kan makrofagerna ta hand om infektionen själva utan någon T cellsinblandning. Makrofager tillhör (med neutrofiler) det konstitutiva svaret, men också det adaptiva svaret genom deras kapacitet att processera och presentera patogen petider på MHC klass II till Th1. Vissa bakterier kan tyvärr överleva: Mycobakteria är riktig läskiga små saker som bär ansvaret för tuberkulos och lepra. De förökar sig i makrofagernas fagolysosomer, och undviker på detta sätt antikropp och T cells igenkännande. De överlever i den fientliga fagolysosom miljön genom att inhibera fusionen av lysosom vesiklar med fagolysosom vesiklar där de förökar sig. 29
Makrogafer (och neutrofiler) deltar i det konstitutiva svaret genom att vara närvarande. 1) Engulfering + direkt föstörelse genom användandet av egna granuler som innehåller olika enzymer, proteiner och peptider (toxic oxygen radicals, peroxider, NO, lipid mediatorer, platelet activating factors ). 2) Fagocyterna producerar cytokiner (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNFa ) som rekryterar andra celler till inflammationsområdet. 3) Receptorerna på makrofager (men inte neutrofiler) spelar en viktig roll för antigen intagning samt processering. En av Th1 viktigaste roller är att aktivera makrofager. Detta sker genom en dubbelsignal som består av 1) IFN-γ, 2) CD40L/CD40. CD8 kan i vissa fall också aktivera makrofager som fått en signal 1 från specifika bakteriedelar. CD8 utsöndrar IFN-γ som ger signal 2. 30
Th0 Th1 IL-4 Antimikrobiella molekyler. Macrophage Chemoattractant Protein. 31
Granuloma skapas när ett patogen är motståndskraftig mot makrofag aktivitet. I t.ex. Tuberculos kan stora friska cellulära område isoleras från all näring och förstöras. Antikroppen binder till patogen och skickar en intracellulär signal. Antikroppen internaliserar patogen som följs av antigen presentation på MHC II till Th2 celler som i sin tur ger en co-signal 1 (CD40/CD40L). Då börjar B-cellen att proliferera. Th2 utsöndrar också 3 olika cytokiner IL-4, IL-5 och IL-6 som driver på proliferationen. 32
33