Examensarbete Jämförelse och utvärdering av tre kromogena medier för detektion av Extended-spectrum β-lactamase hos Enterobacteriaceae Författare: Ida Svensson Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2016:BL8 1
Jämförelse och utvärdering av tre kromogena medier för detektion av Extended-spectrum β-lactamase hos Enterobacteriaceae Ida Svensson Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Filosofie Kandidatexamen Handledare: Medicinsk chef, Annika Wistedt, Klinisk mikrobiologi och vårdhygien, Hus 17 Länssjukhuset 391 85 Kalmar Forskarassistent, Karin Holmfeldt, Institutionen för Biologi och Miljö, Linnéuniversitetet 392 31 Kalmar Examinator: Universitetslektor, Britt-Inger Marklund, Institutionen för Kemi och Biomedicin, Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 hp Sammanfattning Kliniska användandet av antibiotika är under ett allt större hot då bakterier har utvecklat resistens mot många klasser av antibiotika som används i sjukvården. Resistensgener hos bakterier finns kromosomalt eller burna av plasmider som kan förvärvas från andra bakterier. Spridning av resistens mot β-laktamantibiotika är oroande hos Enterobacteriaceae där inte många antibiotikaalternativ finns. Några plasmidburna β-laktamaser med ett utökat spektrum (ESBL) har blivit vanligare. Syftet med studien var jämförelse och utvärdering av tre kommersiella kromogena medier (CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba ) selektiva för ESBL-producenter och jämföra dessa mot nuvarande metod (selektivt medium för gramnegativa bakterier och antibiotikadiskar). Kända stammar (11 st) med ESBLA / ESBLM tillväxte på C3G R och ESBL+AmpC men tendens till starkare tillväxt fanns på ESBL+AmpC. msupercarba detekterade samtliga (14 st) karbapenemresistenta stammar. Vid jämförelse av 85 kliniska prov som analyserades med nuvarande metod för detektion av ESBL-producerande bakterier, och kromogena medier detekterades alla nio positiva för ESBLA på C3G R och ESBL+AmpC. Två ESBLM-producenter detekterades med säkerhet på ESBL+AmpC men ej på C3G R. Bland de negativa proverna gav 11växt på C3G R och sju på ESBL+AmpC, dessa innehöll bakterier som hade minskad cefalosporin-känslighet men ej klassificerades som ESBL-producerande. msupercarba detekterade
ESBLCARBA-producenter bättre än nuvarande metod som missade vissa. Slutsats från studien blev att ESBL+AmpC gav bättre tillväxt och selekterade bort fler arter och isolat som bar på minskad känslighet mot cefalosporiner men ej klassificerades som ESBL-producerande. Användning av medierna ESBL+AmpC och msupercarba i kombination som ersättning för nuvarande metod innebär ökad känslighet och förenklad avläsning. Abstract The clinical use of antibiotics is becoming less successful as bacteria have developed resistance to many antibiotics used in health care. Resistance genes in bacteria are chromosomal or carried by plasmids that can be acquired from other bacteria. The resistance to β-lactam antibiotics is particularly worrying in Enterobacteriaceae where there are few options available for treatment. Some plasmid-encoded β-lactamases with extended spectrum (ESBLs) have become common. The aim of the study was to compare and evaluate three commercial chromogenic media (CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC and CHROMagar msupercarba ) selective for ESBL-producing bacteria and comparing them to the current method using selective medium for gram negative bacteria and antibiotic disks. All known ESBL-producing strains tested (11) with ESBLA or ESBLM grew on C3G R and ESBL+AmpC but there was a tendency towards stronger growth on ESBL+AmpC. msupercarba detected all tested (14) carbapenem-resistant strains. In an analysis of 85 clinical samples, the chromogenic media detected all positive ESBLA producers, both C3G R and ESBL+AmpC. Two positive ESBLM producers were detected by ESBL+AmpC with certainty but not on C3G R. Among the negative samples 11 gave growth on C3G R and seven on ESBL+AmpC. These bacteria had a slightly decreased cephalosporin sensitivity but were not classified as ESBL producers. msupercarba detected ESBLCARBA producers better than the current method. The conclusion was that ESBL+AmpC gave better growth and was more selective against species and isolates carrying reduced susceptibility to cephalosporines, without being ESBL producing. ESBL+AmpC and msupercarba could be used together for detecting the ESBL producing bacteria to increase sensibility. Nyckelord β-laktamas, β-laktamantibiotikaresistens, ESBL, selektiva medier, kromogena medier.
Förkortningar AmpC= Class C cephalosporinases CAZ= Ceftazidim CMY= Cephamycinase CPE= Carbapenem-producing Enterobacteriaceae CTX= Cefotaxim CTX-M= Cefotaximase-München DDT= Double disk diffusion test ESBL= Extended-spectrum β-lactamase IMP= Imipenemase KPC= Klebsiella pneumoniae carbapenemase MER= Meropenem NDM= New Delhi Metallo-β-lactamase OXA= Oxacillin SHV= Sulfhydril variabel TEM= Temoniera VIM= Verona imipenemase
Innehållsförteckning Introduktion - 1 - Enterobacteriaceae - 1 - β-laktamantibiotika - 1 - Resistens mot β-laktamantibiotika - 2 - Resistensläget i Sverige av ESBL-producerande bakterier - 6 - Detektion av ESBL-stammar och konfirmation av resistensmekanismer - 6 - Syfte - 7 - Material och metod - 8 - Kontrollstammar och kliniska stammar - 8 - Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna - 10 - Parallell utodling av kliniska prover - 11 - Resultat - 11 - Kontrollstammar och kliniska stammar - 11 - Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna - 15 - Parallell utodling av kliniska prover - 17 - Diskussion - 18 - Slutsats - 20 - Tack - 21 - Referenser - 22 -
Introduktion Det kliniska användandet av antibiotika, för effektiv behandling av infektioner orsakade av bakterier, är under ett allt större hot då bakterier har utvecklat resistens mot många klasser av antibiotika som används dagligen i sjukvården (1). Det är bakterier som tidigare har varit mottagliga för antibiotika men som har förvärvat gener från andra bakterier genom horisontell överföring av plasmider, där genen finns lokaliserad, eller genom spontana mutationer av gener som finns kromosomalt (1, 2). De gener som finns kromosomalt hos bakterien kan överföras till andra bakterier inom samma art genom vertikal överföring när bakterien replikerar sig medan de plasmidmedierade generna kan överföras mellan bakterier inom samma art eller mellan olika arter (1, 2). Plasmider kan samtidigt bära på resistensgener mot många olika antibiotikaklasser som β-laktamantibiotika, aminoglykosider, makrolider, tetracyklin och kinoloner och leder då till multiresistens (2). Gramnegativa bakterier har en naturlig resistens mot många antibiotika som är effektiva mot grampositiva bakterier då yttermembranet är impermeabelt mot flera antibiotika (3). Infektioner orsakade av gramnegativa bakterier är svåra att behandla på grund av att det inte finns så många antibotikaalternativ (1, 2). Särskilt spridningen av resistens mot β-laktamantibiotika hos Enterobacteriacae är oroväckande då det kan innebära att till exempel urinvägsinfektioner, postoperativa infektioner och infektioner i samband med immunosuppression kan bli svåra att behandla (4). Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae är en stor grupp av gramnegativa bakterier och dessa är fakultativt anaeroba stavar med hög tillväxthastighet och omfattar > 150 bakteriearter som ingår i den normala tarmfloran hos människor (3). Cirka 25 av dessa bakteriearter är medicinskt betydelsefulla som bland annat Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae och Enterobacter cloacae. Dessa är också de vanligaste bakterierna som orsakar urinvägsinfektion, intra-abdominala infektioner, vårdrelaterade infektioner och infektioner i blodet (3, 5, 6). β-laktamantibiotika β-laktamantibiotika är en bred klass av antibiotika som innehåller en β-laktamring i den molekylära strukturen och som fungerar som inhibitor vid cellväggssyntes hos bakterier. Denna klass av antibiotika är den mest använda på grund av sin effektivitet och - 1 -
gynsamma biverkningsprofil och inkluderar penicilliner, cefalosporiner, monobaktamer och karbapenemer (7). Penicillin (bensylpenicillin) upptäcktes 1928 och utvanns från mögelsvampen Penicillium notatum och var effektiv mot grampositiva bakterier men inte gramnegativa bakterier på grund av deras yttermembran (3). Dock var denna penicillin olämplig att tas oralt då den snabbt bröts ned av magsyran och kan därför bara ges intravenöst. En modifikation gjordes för att få fram ett medel som kunde tas oralt och detta resulterade i den syrastabila formen fenoximetylpenicillin. Ampicillin är en vidareutvecklad syrastabil penicillin som är aktiv mot många gramnegativa bakterier. Piperacillin är en vidareutveckling av ampicillin med en ökad effekt och används ofta i kombination med β-laktamashämmaren tazobaktam (3). Cefalosporiner är antibiotika med ett bredare antibakteriellt spektrum och fungerar mot gramnegativa bakterier och kan klassificeras i olika generationer där cefadroxil (CDR) är en första generationens cefalosporin medan cefotaxim (CTX) och ceftazidim (CAZ) ingår i tredje generationens cefalosporiner och kallas även för oxyiminocefalosporiner (8). Karbapenemer används ofta mot multiresistenta gramnegativa bakterier och har ett bredare spektrum än penicilliner och cefalosporiner (3). Meropenem (MER) är en karbapenem som är mycket resistent mot β-laktamaser och cefalosporinaser (9). Resistens mot β-laktamantibiotika Hos gramnegativa bakterier är produktion av β-laktam-nedbrytande enzymer, β- laktamas, den största bidragande orsaken till resistens mot β-laktamantibiotika och inaktiverar den typen av antibiotika genom hydrolys (10). Infektioner med multiresistenta Enterobacteriaceae är inte behandlingsbara med de antibiotika som rutinmässigt används. Det är därför viktigt att se hur resistensmönster ser ut för de bakterier som orsakar infektioner, speciellt för de som bär på multiresistensgener samt att förebygga spridningen på sjukhus för dessa bakterier (11). Klassificering av β-laktamaser β-laktamaser klassificeras enligt två traditionella system; Ambler molecular classification och Bush-Jacoby-Medieros functional classification. Klassificering enligt Ambler delar in β-laktamaser i fyra huvudklasser (A till D) med avseende på likheter mellan aminosyrasekvenser hos enzymerna (Tabell I) (8, 12). De β-laktamaser som tillhör klass A, C och D är serin β-laktamaser vilket innebär att dessa enzymer med serin i aktivt site hydrolyserar β-laktamantibiotika (8, 12, 13). Klass B enzymer är - 2 -
metallo-β-laktamaser som behöver divalenta zinkjoner för hydrolys (8, 12, 13). Klassificering av β-laktamaser enligt Bush-Jacoby-Medeiros delar in enzymerna med avseende på funktionella likheter och det finns fyra huvudgrupper (1 till 4) och flera subgrupper i detta system (Tabell I) (12). Systemet är mer användbart för mikrobiologiska laboratorier då det beaktar de inhibitorer och substrat för β-laktamas som är kliniskt relevanta (12). Tabell I. Översikt och jämförelse mellan olika sätt att klassificera β-laktamaser samt deras aktivitet och exempel på specifika resistensgener inom varje klass. Svensk Bush-Jacoby-Medeiros Ambler Inhiberas av Gener Aktiv mot klassificering klavulansyra ESBLM (endast plasmidburen) Grupp 1: Cefalosporinaser Klass C Nej AmpC, CMY Cefalosporiner, cefamyciner ESBL A Grupp 2a: Penicillinaser Klass A Ja PC1 Benzylpenicillin+ derivat av penicilliner Grupp 2b: Bred-spektrum β-laktamaser Grupp 2be: Extendedspectrum β-lactamase Klass A Ja TEM, SHV Penicilliner och tidiga generationer cefalosporiner Klass A Ja TEM, SHV, CTX Penicilliner och cefalosporiner Grupp 2br: Inhibitorresistenta enzymer Grupp 2c: Karbenicillinaser Klass A Nej TEM, SHV Klavulansyra, tazobaktam, sulbaktam. Klass A Ja PSE, CARB Carbenicillin ESBLM eller ESBLCARBA Grupp 2d: Cloxacillinaser/oxacillinas er Klass A och D Varierad OXA Cloxacillin/ oxacillin Grupp 2e: Cefalosporinaser ESBLCARBA Grupp 2f: Karbapenemaser (serinbaserad) Klass A Ja CepA Extended-spektrum cefalosporiner Klass A Varierad KPC, IMI Karbapenemer ESBLCARBA Grupp 3: Metallo-βlaktamaser (zink-baserad) Klass B Nej IMP, VIM, NDM Karbapenemer Grupp 4: Penicillinaser (inhiberas inte av klavulansyra) Ingen klassifikat ion Penicilliner De bakterier som bär på multiresistens mot β-laktamantibiotika bär oftast på β- laktamaser som klassificeras som/i grupp 2 och 3 (A, B och D). Grupp 2 enligt Bush-Jacoby-Medeiros som inkluderar klass A och D enligt Ambler är den största gruppen av β-laktamaser. Att grupp 2 är den största gruppen beror primärt på spridningen av det nyidentifierade Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) som pågått under de senaste 20 åren (13). - 3 -
Subgrupp 2a innehåller penicillinaser som utgör en liten grupp inom β-laktamaserna med ett smalt spektrum av hydrolysaktivitet och finns främst hos grampositiva kocker och enterokocker. Dessa enzymer hydrolyserar benzylpenicillin och andra derivat av penicilliner medan de har sämre hydrolysaktivitet mot cefalosporiner, karbapenemer och monobaktamer. β-laktamaserna i denna subgrupp är huvudsakligen kromosomala och inhiberas av klavulansyra och tazobaktam (8, 13). Subgrupp 2b innehåller β-laktamaser som hydrolyserar penicilliner och tidiga generationer av cefalosporiner och inhiberas starkt av klavulansyra och tazobaktam. De flesta av dessa enzymer hör till den plasmidmedierade enzymfamiljen Temoniera (TEM) och sulfhydril variabel (SHV) speciellt TEM-1 och TEM-2 samt SHV-1 (8, 13). TEM-1 är det mest vanligt förekommande β-laktamaset för ampicillinresistens hos gramnegativa bakterier, exempelvis E. coli. SHV-1 produceras till största delen av K. pneumoniae (12). Subgruppen 2be innehåller enzymer med hydrolysaktivitet liknande den hos enzymerna i subgrupp 2b men med utökad hydrolys av tredje generationens cefalosporiner som CTX, CAZ och aztreonam. De flesta enzymerna inom subgrupp 2be härstammar från TEM-1, TEM-2 och SHV-1 men aminosyrasubstitutioner har gjort att dessa enzymer ökat sitt substratspektrum mot flertalet β-laktamantibiotika (13). Förekomst av en annan familj av ESBL, CTX-M, som är släkt med kromosomala β-laktamaser som finns hos Kluyvera, har ökat snabbt runt om i världen (8, 12, 13). Namnet härstammar från enzymets resistens mot CTX samt att det upptäcktes i München, varav bokstaven M (14). Denna familj av ESBL är den snabbast växande runt om i världen och nu den vanligaste som upptäcks i kliniska isolat (10, 12, 14). Subgrupp 2d innehåller cloxacillinaser som har förmåga att hydrolysera cloxacillin eller oxacillin och kallas för oxacillin (OXA)-enzymer. Bland dessa β-laktamaser har det upptäckts OXA-enzymer som har karbapenem-hydrolysaktivitet och produceras av gener som finns kromosomalt. Dock finns plasmidmedierade OXA-enzymer som OXA- 23 och OXA-48 som har identifierats hos Enterobacteriacae (13). - 4 -
Subgrupp 2f innehåller karbapenemaser som har förmåga att hydrolysera karbapenemer med serin i aktivt site. Den plasmidmedierade familjen K. pneumoniae- carbapenemase (KPC)-enzymer har blivit associerad med stora utbrott av multiresistenta gramnegativa infektioner på sjukhus runt om i världen (9, 12, 13). Grupp 3 innehåller metallo-β-laktamaser (Ambler klass B) med zinkjoner som kofaktor som hydrolyserar karbapenemer. Dessa enzymer produceras ofta i kombination med ett andra eller tredje β-laktamas hos kliniska isolat. Till skillnad från serin-baserade karbapenemaser har dessa enzymer sämre hydrolytisk kapacitet för monobaktamer och inhiberas inte av klavulansyra eller tazobaktam. En stor familj av plasmidmedierade metallo-β-laktamaser är imipenemase- (IMP) och verona imipenemase (VIM)- enzymer som förekommer runt om i världen vanligast hos icke-fermenterade bakterier men även hos Enterobacteriacae (13). Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) ESBL-enzymerna har förmågan att hydrolysera de flesta β-laktamantibiotika som används i sjukvården idag och orsakar stora kliniska problem runt om i världen. Den ursprungliga definitionen för ESBL är enzym som ger hydrolys av 3:e generationens cefalosporiner (8), har ett serinbaserat aktivt site och inihiberas generellt av β- laktamasinhibitorer som klavulansyra, sulbaktam eller tazobaktam (8). ESBL kodas till största delen av stora plasmider som har storleken 100 kb eller större och som kan överföras mellan olika bakteriestammar och även mellan olika bakteriearter. Enzymernas ursprung är TEM-, SHV- eller OXA- penicillinaser som genom evolution genomgått aminosyraförändringar som lett till strukturella förändringar i det aktiva sitet av enzymet. Dessa mutationer förändrade aktiviteten hos β-laktamaserna så att dessa blev effektiva mot tredje generationens cefalosporiner (8). ESBL-producerande bakterier upptäcktes för första gången 1983 och sedan dess har dessa snabbt spridit sig runt om i världen och varit orsaken till flertal infektionsutbrott. De senaste 10 åren har frekvensen av ESBL-producerande isolat ökat och är nu ett stort problem vid sjukvård, till exempel vid intensivvårdsavdelningar i stora delar av världen (8). Klassificering av ESBL i Sverige Sverige har en anpassad definition av ESBL som använts sedan 2009 för att underlätta rapportering, där ESBL klassificeras under tre huvudgrupper; ESBLA, ESBLM och - 5 -
ESBLCARBA (15). I den första gruppen, ESBLA, finns de klassiska enzymerna som bryter ned 3:e generationens cefalosporiner och inhiberas av klavulansyra och tazobaktam (6, 11). Den andra gruppen, ESBLM, innehåller de enzymer som inte inhiberas av klavulansyra och tazobaktam men kan ofta inhiberas av kloxacillin istället. Här ingår de β-laktamaser som hör till AmpC-gruppen. I den sista gruppen, ESBLCARBA, finns de enzymer som ger resistens mot karbapenemer, de finns hos carbapenemasproducing Enterobacteriaceae (CPE) och ger även resistens mot 3:e generationens cefalosporiner (6, 11, 15). Vid vissa fall kan bakterier som producerar ESBLA eller ESBLM vara resistenta mot karbapenemer utan att producera karbapenemaser. Detta kan bero på att bakterien har förvärvat andra resistensgener, till exempel impermeabilitet mot karbapenemer och dessa klassificeras inte som ESBLCARBA-producenter. De bakterier som producerar ESBLCARBA, OXA-48 enzymer, kan i vissa fall varken uttrycka intermediär känslighet eller resistens mot meropenem eller imipenem in vitro och enzymet har därmed inte lika stark karbapenem-hydrolys-aktivitet som andra karbapenemaser (11). Resistensläget i Sverige av ESBL-producerande bakterier Under 2014 anmäldes enligt Folkhälsomyndigheten 8 902 fall av Enterobacteriaceae med ESBL vilket var en ökning med 9% från året innan. Det var E. coli som var den dominerande bakteriearten (89%) och därefter kom K. pneumoniae (7%). De flesta fynden gjordes i urinprover. Under 2014 anmäldes även 46 fall med infektioner av ESBLCARBA-producerande bakterier med OXA-48 och NDM som de vanligaste enzymerna. Under 2014 var 5% av alla E. coli från kliniska prov ESBL-producerande (16). Detektion av ESBL-stammar och konfirmation av resistensmekanismer För att upptäcka ESBL-producerande bakterier används ofta en screeningmetod för att detektera nedsatt känslighet mot 3:e generationens cefalosporiner samt ett fenotypiskt konfirmationstest för att se en synergieffekt mellan en cefalosporin och en β- laktamasinhibitor (8). Vid avdelningen för Klinisk mikrobiologi och vårdhygien på Länssjukhuset i Kalmar används ett selektivt och differentierande odlingsmedium som tillåter växt av gramnegativa bakterier och förhindrar växt av grampositiva bakterier (17). På denna Juhlin32-platta appliceras en antibiotikadisk innehållande CAZ, en antibiotikadisk innehållande CTX samt en antibiotikadisk innehållande MER. Brytpunkterna är specifika för mediet och har utarbetats och innebär att vid - 6 -
inhibitionszon < 25 mm för CAZ, <29 mm för CTX och/eller <33mm för MER eller inväxt av enstaka kolonier i zon så undersöks isolaten närmare. För misstänkta isolat utförs resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCAST och dessutom double disk diffusion test (DDT). Detta är ett fenotypiskt konfirmationstest med amoxicillinklavulansyra som β-laktamasinhibitor och appliceras i mitten på en Mueller-Hinton platta och cefalosporiner som CTX, CAZ, cefepim och cefoxitin appliceras runt amoxicillin-klavulansyran med 25 mm mellanrum för att kontrollera synergi mellan dessa (8, 18). Finns en synergi är detta en indikation på att bakterien producerar ESBLA (8, 18). Observeras ingen synergi utförs ett nytt DDT med kloxacillin som β- laktamasinhibitor. Observeras nu en synergi indikerar detta på att bakterien producerar ESBLM eller kromosomal AmpC (18). Denna screeningmetod som för närvarande används på laboratoriet har svårt att upptäcka ESBLCARBA-produktion med lågt uttryckt OXA-48 och även låga koncentrationer av bakterier som producerar ESBL kan vara svåra att upptäcka då zonerna runt antibiotikadiskarna kan bli större än de gränsvärden varje antibiotikadisk har. Materialkostnaden för screening av ESBL är 9 kr/prov. De kromogena medierna kombinerar upptäckt av ESBL-producerande bakterier med identifiering av organismen. Dessa medier innehåller kromogena substrat som färgar bakteriekolonierna då de hydrolyseras av specifika enzymer hos bakterierna. Mediet innehåller även selektiva kombinationer av antibiotika för växt av ESBL-producerande bakterier (4). CHROMagar (Paris, Frankrike) är två kromogena medier (C3G R och msupercarba ). C3G R detekterar gramnegativa bakterier som producerar β- laktamas och AmpC medan msupercarba detekterar bakterier som producerar karbapenemaser (19, 20). Liofilchem (Roseto degli Abruzzi, Italien) har utvecklat ett kromogent medium (Chromatic ESBL+AmpC) för detektion av ESBL-producerande Enterobacteriacae och AmpC-producerande bakterier (21). Dessa tre kromogena medier valdes för detektion med hög känslighet av ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA (framförallt OXA-enzymer). Medierna kan produceras på laboratoriet. Materialkostnaden för plattorna är cirka 15 kr/platta. Syfte Syftet med denna studie var att hitta en känsligare detektionsmetod för bakterier som producerar ESBL och karbapenemas än nuvarande metod samt att jämföra och utvärdera tre olika kromogena medier mot nuvarande metod. - 7 -
Material och metod Allt laborativt arbete utfördes med sterilteknik. Kontrollstammar och kliniska stammar Som känsliga kontrollstammar användes E. coli CCUG 17620, Enterococcus faecalis CCUG 9997 och P. aeruginosa CCUG 17619. De positiva (resistenta) kontrollstammarna var K. pneumoniae CCUG 45421 som producerar ESBLA, E. coli (Isolat 13 från CPE-studie) som producerar ESBLM och K. pneumoniae CCUG 64452 som producerar ESBLCARBA. Dessa kontrollstammar odlades på blodagarplattor och förvarades i kyl. Kliniska stammar förvarades frysta (-70 C). Dessa var E. coli, K. pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii och E. cloacae (Tabell II). Både de negativa och positiva kontrollstammarna och de utvalda kliniska stammarna som producerar ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA (Tabell II) samt isolat från en CPEstudie, som är en pågående nordisk metodstudie för diagnostik av ESBLCARBA-isolat med genetiskt väldefinierade stammar som hade utförts på det kliniska laboratoriet tidigare under året, spreds på blodagarplattor med steril 1 µl platinös. Blodagarplattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37 C) i ca 20 timmar. Blodagarplattorna avlästes för att kontrollera växt på samtliga plattor. - 8 -
Tabell II. De kontrollstammar och utvalda kliniska stammar som använts i studien. Under provtyp finns information om var ifrån bakterien isolerades och mekanism innebär vilken typ av enzym bakterien producerar. Vid de tre högra kolumnerna markerar X vilka kromogena medier som bakterien odlats ut på, CHROMagar C3G R (C3G R ), Chromatic ESBL+AmpC (ESBL+) och CHROMagar msupercarba (sc). Kontrollstam Art (isolat) Provtyp Resistensmekanism C3G R ESBL+ Neg. ESBL E. coli (CCUG 17620) X X X Neg. ESBL E. faecalis (CCUG 9997) X X X Neg. ESBL P. aeruginosa (CCUG X X X 17619) ESBLA K. pneumoniae (CCUG X X X 45421) ESBLM E. coli (Isolat 13 CPEstudie) CMY X X X ESBLCARBA K. pneumoniae (CCUG 64452) X X X ESBLA 880 E. coli Blod X X X 8040 E. coli Urin X X 816 K. pneumoniae Urin X X 976 P. mirabilis Urin X X 716 E. coli Urin X X sc ESBLM 397 E. coli Blod AmpC-plasmid X X X 442 C. freundii Blod Kromosomal X X X AmpC 2073 E. coli Blod AmpC-plasmid X X X ESBLCARBA 957 E. cloacae Urin X 831 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X 660 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X X X 539 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X 540 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X 651 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X 466 E. coli Rectumfaeces OXA-48 X 196 E. cloacae Buksekr X X X et 673 K. pneumoniae Urin NDM X X X CPE-studien Isolat 3 E. cloacae IMI-9 X Isolat 4 K. pneumoniae KPC-2 X Isolat 11 Citrobacter NDM-1 X Isolat 23 E. coli OXA-181 X Isolat 24 E. coli IMP-26 X Isolat 27 K. pneumoniae VIM-1 X - 9 -
Kontrollstammar och de utvalda kliniska stammarna odlades ut på CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba enligt Tabell II och inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37 C) i 18-24 timmar (19-21). Isolat från fyra kliniska prov från allmän avdelning (Tabell III) som hade resistensbestämts och visade känslighet mot cefalosporiner valdes ut som negativa kontroller och odlades ut på CHROMagar msupercarba, CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC. Plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37 C) i 18-24 timmar. Tabell III. Utvalda kliniska isolat från daglig produktion från allmän avdelning som var negativa för ESBL efter resistensbestämning. Negativa ESBL Art Provtyp C3G R ESBL+ sc 6621 E. coli Sårsekret X X X 7264 E. coli Rectum-faeces X X X 7270 E. coli Urin X X X 7272 E. coli Rectum-faeces X X X Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna Spädning av bakteriestammar För varje bakteriestam från Tabell II gjordes en spädningsserie (1:10 1, 1:10 2, 1:10 3, 1:10 4 och 1:10 5 ). Detta utfördes genom att från blodagarplattor ta bakteriekolonier med sterila bomullspinnar och suspendera i plaströr innehållande 1000 µl 0,9% NaCllösning så att bakteriesuspensionen fick en grumlighet på McFarland 0,5 ± 0,1 som kontrollerades med en kalibrerad DensiCHEK plus (Biomérieux, Marcy l'etoile, Frankrike). Från bakteriesuspensionerna överfördes 100 µl till nya plaströr innehållande 900 µl NaCl-lösning så varje bakteriestam späddes 1:10 och fick spädningen 1:10 1. Detta upprepades så att en spädningsserie för varje bakteriestam erhölls. Från bakteriesuspensioner med spädningen 1:10 4 och 1:10 5 togs 10 µl upp med en automatpipett och applicerades på blodagarplattor och spreds ut med 1 µl platinös för beräkning av colony forming units/ml (CFU/mL) och kontroll av spädningarna. Tillsats och detektion av kända ESBL-stammar i faecesprov (spikade prover) Faecesprover användes som grundmaterial till de spikade proverna. Faeces togs upp med sterila bomullspinnar och suspenderades i plaströr innehållande 1000 µl NaCllösning. Från denna faeceslösning togs 10 µl upp med en automatpipett och - 10 -
applicerades på blodagarplattor och Juhlin32-plattor och spreds ut på hela plattan med 1µL platinös för kontroll av faecesprovet. På Juhlin32-plattorna applicerades antibiotikadiskarna CTX (5 µg), CAZ (10 µg) och MER (10 µg) (Biomérieux, Marcy l'etoile, Frankrike). Från faeceslösningen togs 90 µl upp med automatpipett och tillsattes till två nya plaströr per bakteriestam. Till dessa 90 µl faeceslösning tillsattes 10 µl av bakteriesuspensionerna med spädning 1:10 3 och 1:10 4 så de spikade proverna fick en slutgiltig spädning av stam på 1:10 4 och 1:10 5. Från varje spädning togs 10 µl upp med automatpipett och applicerades på en blodagarplatta, Juhlin32-platta, CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba och spreds ut med 1 µl platinös över hela plattan. Till Juhlin32- plattan applicerades antibiotikadiskarna CTX, CAZ och MER. Alla plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37 C) i 18-24 timmar (19-21). Parallell utodling av kliniska prover Kliniska prover, 85 stycken faeces-rectumprover, som kom in till laboratoriet under veckorna 16-19 med begäran om screening för ESBL-producerande bakterier odlades ut på Juhlin32-plattor enligt nuvarande screeningmetod med antibiotikadiskarna CTX, CAZ och MER. Alla dessa prover odlades även ut på CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba där proverna ströks ut tätt och en spridning gjordes från det täta stryket. Alla plattorna inkuberades i en termostat (aerob miljö 35-37 C) i 18-24 timmar (19-21). Avläsning skedde tillsammans med tjänstgörande biomedicinsk analytiker på laboratoriet och svar rapporterades enligt ordinarie rutiner. Resultat Kontrollstammar och kliniska stammar Från de positiva kontrollstammarna (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) som odlades ut på CHROMagar C3G R (Figur 1A) och Chromatic ESBL+AmpC (Figur 1B) observerades växt av mörkblåa/grönblåa kolonier av K. pneumoniae som producerade ESBLA och rosa/ljusrosa kolonier av E. coli som producerade ESBLM medan K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA växte svagt med mörkblåa/grönblåa kolonier och med ett rosa färgomslag på CHROMagar C3G R (Figur 1A). På Chromatic ESBL+AmpC växte alla tre även K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA rikligt med ett rosa färgomslag (Figur 1B). För de negativa kontrollstammarna observerades ingen växt på CHROMagar C3G R (Figur 2A) eller Chromatic ESBL+AmpC (Figur - 11 -
2B) av E. coli och E. faecalis men det förekom färgomslag på de kromogena medierna (Figur 2). P. aeruginosa växte sparsamt på CHROMagar C3G R (Figur 2A) och rikligt på Chromatic ESBL+AmpC (Figur 2B) med ett gult färgomslag på de kromogena medierna. Figur 1. Utodling av de positiva kontrollstammarna (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) på (A) CHROMagar C3G R och (B) Chromatic ESBL+AmpC. Figur 2. Utodlade negativa kontrollstammar på (A) CHROMagar C3G R och (B) Chromatic ESBL+AmpC. - 12 -
De positiva kontrollstammarna för ESBL som odlades ut på CHROMagar msupercarba gav växt av rosa kolonier av E. coli som producerade ESBLM och mörkblåa kolonier av K. pneumoniae som producerade ESBLCARBA. Ingen växt av K. pneumoniae som producerade ESBLA observerades men ett färgomslag i mediet förekom (Figur 3A). Av de negativa kontrollerna observerades ingen växt på CHROMagar msupercarba av E. coli och E. faecalis men det förekom färgomslag i mediet. P. aeruginosa växte sparsamt på CHROMagar msupercarba med ett färgomslag i mediet (Figur 3B). Figur 3. Positiva kontrollstammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCarba) utodlade på CHROMagar msupercarba (A) samt negativa kontroller för ESBL utodlade på CHROMagar msupercarba (B). Vid utodling på CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC observerades växt av samtliga kliniska stammar som producerade ESBLA, ESBLM och de två stammarna som producerade ESBLCARBA och karbapenemas (Tabell IV) (se exempel i Figur 4A och B). Vid utodling på CHROMagar msupercarba observerades växt av samtliga stammar som producerade ESBLCARBA och isolat från CPE-studie (Figur 4C). Ingen växt av stammar som producerade ESBLA och stammar som producerade ESBLM observerades. - 13 -
Figur 4. Utvalda stammar bärande på karbapenemresistens utodlade på CHROMagar C3G R (A), Chromatic ESBL+AmpC (B) och CHROMagar msupercarba (C). Av de utvalda kliniska isolaten som visade känslighet mot cefalosporiner (Tabell III) och odlades ut på CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba observerades ingen växt på någon av plattorna, bara färgomslag av det kromogena mediet (Figur 5). Figur 5. Kliniska isolat negativa för ESBL som är utodlade på (A) CHROMagar C3G R, (B) Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba (C). Tabell IV. Sammanställning av resultaten från utodling på de kromogena medierna av kontrollstammar och kliniska stammar som producerar ESBLA, ESBLM och karbapenemresistens samt isolat från CPEstudie. - 14 -
CHROMagar C3G R Chromatic ESBL+AmpC CHROMagar msupercarba Kontrollstammar Neg. ESBL Växt av P. aeruginosa Växt av P. aeruginosa Växt av P. aeruginosa ESBLA Växt Växt Ingen växt ESBLM Växt Växt Växt ESBLCARBA Växt Växt Växt Kliniska stammar ESBLA Växt av samtliga 5 stammar ESBLM Växt av samtliga 3 stammar ESBLCARBA Växt av stam 660 och 196 som utodlades. Växt av samtliga 5 stammar Växt av samtliga 3 stammar Växt av stam 660 och 196 som utodlades Ingen växt Ingen växt Växt av samtliga 9 stammar CPE-studien Inga data Inga data Växt av samtliga 6 stammar Kliniska isolat neg. ESBL Ingen växt Ingen växt Ingen växt Kontroll av känslighet hos de kromogena medierna Vid kontroll av spädningarna 1:10 4 och 1:10 5 av bakteriesuspensionerna där 10 µl ströks ut på hela blodagarplattor observerades växt mellan 75-170 kolonier (7,5x10 7 1,7x10 8 CFU/mL) av alla bakteriestammar vid spädningen 1:10 4 och 5-20 kolonier (5x10 7 2x10 8 CFU/mL) vid spädningen 1:10 5 (Bilaga II, Tabell VII och VIII). Vid kontroll av faecesproverna som odlades ut på blodagarplatta och Juhlin32-platta med antibiotikadiskar observerades riklig växt på blodagarplattan och Juhlin32-plattan med stora zoner runt antibiotikadiskarna. De spikade proverna som innehöll faeces som grundmaterial och kliniska stammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) som var spädda 1:10 4 och 1:10 5 odlades ut på Juhlin32-plattor, CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba. För stammar som producerade ESBLA och ESBLM observerades generellt en bättre tillväxt på Chromatic ESBL+AmpC än på CHROMagar C3G R (Figur 6) och ingen växt på CHROMagar msupercarba förutom för den positiva kontrollstammen för ESBLM (Isolat 13) som växte på msupercarba beräknad halt 3,7x10 7 CFU/mL från spädningen 1:10 4 och 1,1x10 8 CFU/mL från spädningen 1:10 5 (Bilaga II, Tabell VII och VIII). CHROMagar C3G R detekterade inte två kliniska stammar som producerade ESBLA (880 och 8040) vid spädningen 1:10 5. - 15 -
CFU/mL ESBL-A och ESBL-M 1,80E+08 1,60E+08 1,40E+08 1,20E+08 1,00E+08 8,00E+07 6,00E+07 4,00E+07 2,00E+07 0,00E+00 Blodagar C3GR ESBL+ sc Figur 6. Stapeldiagram som visar CFU/mL, beräknat från spädning 1:10 4, hos samtliga stammar som producerade ESBLA och ESBLM som var utodlade på blodagar, CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba. För stammar som producerade ESBLCARBA samt isolaten från CPE-studien observerades oftast en bättre tillväxt på Chromatic ESBL+AmpC för de stammar som växte på alla tre kromogena medier (Figur 7). För stammar som producerade ESBLCARBA observerades växt av samtliga stammar på CHROMagar msupercarba medan det bland isolat från CPE-studien inte observerades tillväxt på msupercarba av isolat 3 och isolat 24 (Figur 7). CFU/mL 1,80E+08 1,60E+08 1,40E+08 1,20E+08 1,00E+08 8,00E+07 6,00E+07 4,00E+07 2,00E+07 0,00E+00 ESBL-CARBA/isolat från CPE-studie Blodagar C3GR ESBL+ sc Figur 7. Stapeldiagram som visar CFU/mL, beräknat från spädning 1:10 4, av samtliga stammar bärare på karbapenemresistens och isolat från CPE-studie som var utodlade på blodagar, CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba. - 16 -
Vid utodling på Juhlin32 med antibiotikadiskar observerades ofta en riklig växt av både bakgrundsbakterier från faeceslösningen och de tillsatta kliniska stammarna som producerade ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA. Hos stammar som producerade på ESBLA och ESBLM observerades växt intill antibiotikadiskarna CTX och/eller CAZ av samtliga stammar vid spädningen 1:10 4. För stammar som producerade ESBLCARBA och isolat från CPE-studien observerades växt mot CTX och/eller CAZ vid spädningen 1:10 4 av samtliga förutom isolat 3 och kontrollstammen för ESBLCARBA (Bilaga II, Tabell VI) då dessa bedömdes som känsliga från zondiametern. Generellt var zondiametern kring MER på gränsvärdet eller större hos samtliga stammar som producerade ESBLCARBA. För fyra av åtta stammar låg zondiametern kring MER på 28-30 mm vid spädningen 1:10 4, resterande fyra hade en zondiameter över 33 mm. Vid spädningen 1:10 5 var det bara en av åtta stammar som hade en zondiameter < 33 mm kring MER. Av isolat från CPE-studien var det tre av sex isolat som hade en zondiameter <33 mm vid spädningen 1:10 4. Vid 1:10 5 var det ingen som hade en zondiameter <33 mm (Bilaga II, Tabell VI). Parallell utodling av kliniska prover Av de 85 kliniska prover som kom in under vecka 16-19 var 74 prov negativa för ESBL-producerande bakterier. Av dessa 74 negativa prover observerades växt på CHROMagar C3G R från 11 prover och sju växte på Chromatic ESBL+AmpC (Tabell V). Ingen av de negativa proverna gav växt på CHROMagar msupercarba. Bakteriearterna som växte från de 11 proverna var icke-esblbärande E. coli, C. freundii, P. aeruginosa, E. cloacae, Serratia fonticola, Klebsiella oxytoca och Morganella morganii (Bilaga II, Tabell IX). Flera av dessa stammar uppvisade lätt sänkt cefalosporin-känslighet som ej var ESBL-relaterad. Av de 85 kliniska proverna var 11 positiva för ESBL-producerande bakterier varav nio var ESBLA- och två ESBLM-producerande. CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC detekterade alla 11 positiva proverna. I ett prov med både ESBLA- och ESBLM-producenter (E. coli) kunde inte ESBLM säkert detekteras från CHROMagar C3G R. På Chromatic ESBL+AmpC hade dessa stammar tydligt olika koloniutseende. CHROMagar msupercarba detekterade ingen av de ESBLA/ESBLM-positiva proverna. Inga ESBLCARBA detekterades under perioden. - 17 -
Tabell V. Sammanställning av resultat från den parallella utodlingen av kliniska prover på CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba. Antal C3G R ESBL+ sc Negativa ESBL 74 prover 11 prover 7 prover 0 prover Positiva ESBL 11 prover (9 ESBLA, 2 ESBLM) 10 prover ( 9 ESBLA, 1 ESBLM) 11 prover (9 ESBLA, 2 ESBLM) 0 prover Diskussion Syftet med studien var att jämföra och utvärdera tre kromogena medier, CHROMagar C3G R, Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba, för detektion av ESBL- och karbapenemas-producerande bakterier med högre känslighet jämfört med nuvarande metod. Den nuvarande metoden använder sig av ett odlingsmedium, Juhlin 32, som är selektivt för gramnegativa bakterier och förhindrar växt av grampositiva bakterier och applicering av antibiotikadiskarna CTX och CAZ, som är oxyiminocefalosporiner, samt MER som är en karbapenem screenar för ESBLproducerande bakterier. De tre kromogena medierna i denna studie innehöll alla kromogena ämnen för differentiering av olika bakteriearter samt selektiva ämnen för växt av bakterier som producerar ESBL och AmpC eller karbapenemaser (19-21). CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC detekterade alla tre positiva kontrollstammar (ESBLA, ESBLM och ESBLCARBA) vilket var som förväntat då alla tre bär på β-laktamaser mot cefalosporiner. CHROMagar msupercarba detekterade bara den positiva kontrollen för ESBLCARBA vilket var som förväntat då denna bar på resistens mot karbapenemer vilket de andra två positiva kontrollerna ej gjorde. Ingen av de två känsliga kontrollstammarna CCUG 17620 (E. coli) och CCUG 9997 (E. faecalis) tillväxte på dessa tre medier vilket var som förväntat då de ska vara känsliga mot β- laktamantibiotika. Dock tillväxte den känsliga kontrollstammen CCUG 17619 (P. aeruginosa) vilket beror på att P. aeruginosa har kromosomal AmpC β-laktamasproduktion och ofta har en naturlig resistens mot vissa β-laktamantibiotika vilket kan vara orsaken till att isolatet växer på de kromogena medierna (22). Denna resistensgen induceras till produktion av stora mängder β-laktamas i närvaro av cefalosporiner (3). Detta medförde att detta isolat inte lämpade sig som känslig kontroll på någon av de tre kromogena medierna. - 18 -
CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC detekterade samtliga kliniska stammar som producerade ESBLA (5 st), ESBLM (3 st) och ESBLCARBA (2 st) som odlades ut på dessa två medier. Ingen tillväxt av känsliga kliniska isolat detekterades vilket var som förväntat. CHROMagar msupercarba detekterade samtliga kliniska stammar som producerade ESBLCARBA (9 st) samt de kliniska isolaten från CPE-studien (6 st). Inga kliniska stammar som producerade ESBLA (1st) eller ESBLM (3 st) samt de känsliga kliniska isolaten (4 st) detekterades av mediet vilket var förväntat då ingen av dessa bär på resistens mot karbapenemer. Hos alla bakteriestammar som odlades ut på de tre kromogena medierna observerades färgomslag på medierna oavsett om de tillväxte eller ej. Detta kan bero på att enzymer hos bakterier reagerar med det kromogena mediet så att ett färgomslag bildas. Färgomslaget på det kromogena mediet stämde överens med bakterieartens kolonifärg som uppkom vid tillväxt, vid utodling av till exempel E. coli bildades ett rosa färgomslag, E. faecalis gav ett grönblått färgomslag och vid utodling av P. aeruginosa sågs ett gult färgomslag. Vid kontroll av känsligheten hos de kromogena medierna kunde det observeras att tillväxten var generellt högre vid utodling på Chromatic ESBL+AmpC än på CHROMagar C3G R för de stammar som producerade ESBLA och ESBLM, både från spädningen 1:10 4 och 1:10 5. På CHROMagar C3G R var det lite svårare att detektera de stammar som producerade ESBLA från spädningen 1:10 5 då två av sju stammar inte växte alls vid denna spädning även om de växte vid 1:10 4. Dock behövs detta test utföras flera gånger med samma kliniska stammar för att detta resultat ska vara tillförlitligt. För de stammar som bar på ESBLCARBA var tillväxten högre på Chromatic ESBL+AmpC än på både CHROMagar C3G R och CHROMagar msupercarba dock detekterade msupercarba alla de kliniska stammar som producerade karbapenemresistens samt den positiva kontrollstammen vid både spädningen 1:10 4 och 1:10 5. Isolat från CPE-studien växte generellt bättre på CHROMagar msupercarba jämfört med de kliniska stammarna som producerade ESBLCARBA vilket är rimligt då de flesta av de kliniska stammarna som producerade OXA-48 enzymer som inte har lika stark karbapenem-hydrolyseringsaktivitet som till exempel KPC och VIM (13, 23). Dock växte inte isolat 3 (IMI-9) och isolat 24 (IMP-26) på CHROMagar msupercarba från någon av spädningarna - 19 -
fast de växte vid utodling av ren bakteriekultur. Isolat 3 växte inte heller på CHROMagar C3G R eller Chromatic ESBL+AmpC vilket kan bero på att det enzym som bakterien producerade inte är aktivt mot oxyiminocefalosporiner. Enzymet som isolat 24 producerade var istället aktivt mot dessa cefalosporiner och bakterien växte också på de båda kromogena medierna (24). Vid utodling på Juhlin32 detekterades bara hälften av de kliniska stammarna som producerade ESBLCARBA och isolaten från CPE-studien utifrån zondiametern kring MER vilket betyder att den nuvarande metoden inte är tillräckligt känslig för att detektera karbapenemaser vid låga bakteriehalter. Från den parallella utodlingen av 85 kliniska prover som kom in till laboratoriet under tre veckor så observerades att med den nuvarande metoden så detekterades ESBLproducerande bakterier i 11 av dessa 85 prover varav nio var ESBLA och två ESBLM. CHROMagar C3G R och Chromatic ESBL+AmpC kunde detektera alla 11 positiva prover. I ett av proverna fanns både ESBLA och ESBLM-producerande bakterier. Där kunde bakterien som producerade ESBLM inte säkert detekteras av CHROMagar C3G R medan den kunde med säkerhet detekteras med Chromatic ESBL+AmpC då dessa två ESBL-producerande E. coli hade tydligt olika koloniutseende. CHROMagar msupercarba detekterade ingen av de 11 proverna vilket var förväntat då dessa bakterier inte bar på någon karbapenemresistens. Av de 74 prover som var negativa för ESBL-producerande bakterier gav 11 växt på CHROMagar C3G R och sju på Chromatic ESBL+AmpC medan inget växte på CHROMagar msupercarba. Bakterierna som visade på någon typ av resistens mot cefalosporiner var av arterna E. coli, C. freundii, P. aeruginosa, E. cloacae, Serratia fonticola, Klebsiella oxytoca och Morganella morganii. Detta observerades även vid utodling på Juhlin32 med antibiotikadiskar och dessa bakterier bar därmed på β-laktamaser men dessa klassificerades inte som ESBL. Slutsats Slutsatsen från denna studie blev att Chromatic ESBL+AmpC gav bättre tillväxt och selekterade bort fler bakteriearter/isolat, med en lätt minskad känslighet mot cefalosporiner men som inte klassificerades som ESBL-producerande, än CHROMagar C3G R. CHROMagar msupercarba detekterade de stammar som - 20 -
bar på karbapenemresistens, även OXA-48 som inte har lika stark karbapenemhydrolys-aktivitet. Detta är något som den nuvarande metoden hade svårare för. Tidsåtgång och arbetsinsats var lika stora för både den nuvarande metoden och de kromogena medierna. Kostnaden för medierna skiljde sig åt med 9 kr/prov för nuvarande metod med Juhlin32 och antibiotikadiskar och 15 kr/platta för de kromogena medierna. Chromatic ESBL+AmpC och CHROMagar msupercarba kan med fördel användas tillsammans för att detektera de ESBL-producerande bakterierna och kostnaden för varje prov skulle då bli 30 kr. Om istället en delad platta skulle användas där båda medierna kunde gjutas med en vägg mellan medierna skulle kostnaden minska till 15 kr/prov. Detta skulle innebära att färre odlingsplattor behövde läsas av vid laboratoriet. Tack Ett stort tack till all personal på Klinisk mikrobiologi och vårdhygien på Länssjukhuset i Kalmar för all hjälp under tiden på laboratoriet. Jag vill även tacka mina handledare på laboratoriet, Annika Wistedt och Jorge Hernandez och min handledare på Linnéuniversitetet Karin Holmfeldt för att hjälp med skrivandet. - 21 -
Referenser 1. Cox G, Wright GD. Intrinsic antibiotic resistance: mechanisms, origins, challenges and solutions. Int J Med Microbiol. 2013 Aug;303(6-7):287-92. 2. Carattoli A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 2013 Aug;303(6-7):298-304. 3. Brauner A. Medicinsk mikrobiologi & immunologi. 1. uppl. ed. Lund: Studentlitteratur; 2015. 824 s. p. 4. Gazin M, Paasch F, Goossens H, Malhotra-Kumar S, Teams MWaSWS. Current trends in culture-based and molecular detection of extended-spectrum-βlactamase-harboring and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2012 Apr;50(4):1140-6. 5. Martirosov DM, Lodise TP. Emerging trends in epidemiology and management of infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Diagn Microbiol Infect Dis. 2015 Oct: 265-275. 6. Folkhälsomyndigheten. ESBL-producerande tarmbakterier. Kunskapsunderlag med förslag till handläggning för att begränsa spridningen av Enterobacteriaceae med ESBL. 2 ed. Stockholm: Folkhälsomyndigheten; 2014. 7. Holten KB, Onusko EM. Appropriate prescribing of oral beta-lactam antibiotics. Am Fam Physician. 2000 Aug;62(3):611-20. 8. Stürenburg E, Mack D. Extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect. 2003 Nov;47(4):273-95. 9. Nordmann P, Cuzon G, Naas T. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect Dis. 2009 Apr;9(4):228-36. 10. Pitout JD, Laupland KB. Extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern. Lancet Infect Dis. 2008 Mar;8(3):159-66. 11. Giske C, Tängdén T. ESBL-producerande tarmbakterier - en kunskapsöversikt [Internet]. Läkartidningen; 2008. 28: Hämtad från: http://www.lakartidningen.se/functions/oldarticleview.aspx?articleid=9809. [2015-05-03] 12. Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev. 2005 Oct;18(4):657-86. 13. Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Mar;54(3):969-76. - 22 -
14. D'Andrea MM, Arena F, Pallecchi L, Rossolini GM. CTX-M-type β-lactamases: a successful story of antibiotic resistance. Int J Med Microbiol. 2013 Aug;303(6-7):305-17. 15. Giske CG, Sundsfjord AS, Kahlmeter G, Woodford N, Nordmann P, Paterson DL, et al. Redefining extended-spectrum beta-lactamases: balancing science and clinical need. J Antimicrob Chemother. 2009 Jan;63(1):1-4. 16. Folkhälsomyndigheten. Consumption of antibiotics and occurrence of antibiotic resistence in Sweden. Solna: Public Health Agency of Sweden and National Veterinary Institute; 2015. 17. Melhus Å. Juhlin's medium, a selective and differential medium for gramnegative rods [Internet]. MEDICAL MICROBIOLOGY LETTERS; 1996. Hämtad från: https://www.researchgate.net/publication/283838509_juhlin's_medium_a_select ive_and_differential_medium_for_gram-negative_rods. [2015-05-10] 18. Eucast. Antimicrobial susceptibility testing EUCAST disk diffusion method [Internet]. Eucast; 2015. Hämtad från: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/disk_test_doc uments/manual_v_5.0_eucast_disk_test.pdf. [2015-05-10] 19. CHROMagar. CHROMagar C3GR. For overnight detection of Gram-negative bacteria producing Beta-lactamase. Frankrike: CHROMagar; 2014. 20. CHROMagar. CHROMagar msupercarba. For detection of gram-negative bacteria with areduced susceptibility to most of the carbapenem agents. Frankrike: CHROMagar; 2016. 21. Liofilchem. Chromatic ESBL+AmpC. Chromogenic media for detection of ESBLs and AmpC in Enterobacteriacae directly from clinical specimens. Italien: Liofilchem; 2014. 22. Hancock RE, Speert DP. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and impact on treatment. Drug Resist Updat. 2000 Aug;3(4):247-55. 23. Poirel L, Potron A, Nordmann P. OXA-48-like carbapenemases: the phantom menace. J Antimicrob Chemother. 2012 Jul;67(7):1597-606. 24. Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin Microbiol Rev. 2007 Jul;20(3):440-58. - 23 -
Bilagor Bilaga I Material Innehåll i de medier som använts i studien samt innehållet i NaCl-lösningen som produceras på laboratoriet. CHROMagar C3G R Powder Base Total 33 g/l (CHROMagar Agar 15 g/l Orientation) Peptone and yeast 17,0 g/l extract Chromogenic mix 1,0 g/l CHROMagar C3GR Supplement Selective mix 0,37 g/l Chromatic ESBL+AmpC Typical Formula Peptone mix Chromogenic mix Agar Selective mix 43,2 g/l 1,0 g/l 15,0 g/l 0,5 g/l CHROMagar msupercarba Powder Base Total 42,5 g/l Agar 15,0 g/l Peptones 20,0 g/l Salt 5,0 g/l Chromogenic and 1,7 g/l selective mix 2 supplements 1 st liquid form 2mL/L 2 nd powder form 0,25 g/l