Keywords: Immunoturbidimetric, Serum-concentration, Canine, Inflammatory, Acutephaseprotein.

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp Våren 2012 MEASUREMENT OF C-REACTIVE PROTEIN IN CANINE SERUM ON KONELAB AUTOANALYZER 20 Christina Sahlén Abstract: An inflammatory reaction is induced after release of proinflammatory mediators such as interleukin 1 and 6 and tumour necrosis factor α. These mediators stimulate the liver to suppress the syntheses of albumin and endure the syntheses of acute phase protein for instance C-reactive protein. The aim of this paper was to perform a method validation on an immune turbidimetric assay to quantify C-reactive protein in canine serum at the laboratory at Skara Animals Hospital, Skara, Sweden. The validation involved evaluation of the assay linearity, precision, stability and recovery. The method was proved to be linear for both TruLab control and Medinor control. The TruLab control is based on human C-reactive protein while the Medinor control is based on canine C-reactive protein. The precision of the method had a CV of 2.26 % (n=40). The method is considered stable and has good precision, under the circumstance that the TruLab control is used. It was concluded that a Canine CRP-control is required and should be included in routine analysis. Keywords: Immunoturbidimetric, Serum-concentration, Canine, Inflammatory, Acutephaseprotein. Handledare Kerstin Thorén Tolling. Skara Djursjukhus laboratoriet. Klinisk kemi. 1

2 Introduktion En inflammatorisk process initieras alltid lokalt och karaktäriseras av 5 kardinaltecken; tumor, rubor, calor, dolor och functio laesa det vill säga svullnad, rodnad, värme, smärta och funktionsnedsättning [1]. Är dessa tillräckligt omfattande kommer proinflammatoriska mediatorer frisättas i kroppens cirkulation [1,2]. Inflammationen blir då systemisk. De proinflammatoriska mediatorerna kommer att i sin tur leda till ett akutfassvar. Akutfasproteiner (APP) är proteiner som kan påvisas i en individs serum från det akuta skedet av en inflammation till dess att den är bekämpad av immunförsvaret och inflammationen avstannat [1,2]. Akutfassvaret är responsen av de proinflammatoriska cytokiner som frisätts vid en infektion eller ett vävnadstrauma vanligen från stimulerade monocyter och makrofager i inflammationsområdet [1,2,3]. Cytokinerna är bland annat interleukin 1 och 6 (IL1, IL6) och tumour necrosis factor α (TNFα) [1,2]. Cytokinerna i sin tur påverkar levern att antingen öka eller minska produktionen av APP. Exempel på proteiner som hämmas är albumin och transferrin. Dessa nedprioriteras i förmån till de dominerande, kraftigt ökande APP. Detta gäller framför allt C-reaktivt protein (CRP), serumamyloid A (SAA) och haptoglobulin [1,2]. CRP och SAA räknas som två lämpliga akuta markörer för inflammation eftersom de båda ökar mycket snabbt i koncentration redan inom några timmar efter inflammationens början [1]. CRP kan fästa vid bakteriens kapsel och tillkalla makrofager för att destruera bakterien. Därför måste den öka snabbt vid ett akut inflammationssvar [1]. På grund av sin korta halveringstid kommer dessa även att försvinna ungefär i takt med inflammationen avslutas [1,2]. På den humana sidan upptäcktes CRP år 1930 och då hos patienter med pneumoni där den fanns bunden till C-polysackariden på pneumokockerna [5], 1947 karaktäriserades det som ett akutfasprotein och 1950 användes markören för första gången inom diagnostiken och då för övervakning av reumatiska patienter [1]. Inom veterinärmedicinen har kunskap om CRP länge funnits men intresset för proteinet som en diagnostisk inflammationsmarkör initierades först under 1980-talet [1]. Kunskapen kring biomarkörer och klinisk kemi hos veterinärer är överlag relativt låg i Sverige idag men man vill främja vikten av dessa och således öka användandet av dessa inom diagnostiken. Hundens CRP-respons liknar i många avseenden människans, vid homeostas är serumkoncentrationerna låga, man ser en snabb ökning och maximala koncentrationer redan efter 24 timmar efter inflammatorisk stimulans [1,4]. Hundar drabbas, som människor av systemiska inflammatoriska sjukdomar och sjukdomar som visat sig förhöja CRP-nivåerna hos hundar är bland annat parvovirusinfektion, pyometrios akut pancreatit, immunmedierad hemolytisk anemi, reumatisk artrit och glomerulonefrit [5]. Andra autoimmuna sjukdomar och bakteriella infektioner så som lunginflammationer har också visat sig ge upphov till förhöjda koncentrationer av CRP [1,4,5,6]. För att monitorera hundens skov vid kronisk inflammatorisk sjukdom har CRP visat sig vara till stor hjälp [1,7]. Hos hundar med postoperativa infektioner används CRP för att ställa diagnos och följa upp verkningsgraden av behandling med antibiotika [1]. Det ska dock sägas att det har utförts sparsamt med undersökningar och studier för att utreda sjukdomarnas individuella påverkning på CRP-värdena hos hunden. Det som mestadels 2

3 utförts är fåtalet undersökningar med avseende leukocyter, neutrofiler och CRP i förhållande till varandra vid det uttalade sjukdomsfallet [5]. Med ökad förståelse för klinisk kemi hos veterinärer förväntas också ökat antal publicerade undersökningar kring CRP och hundars inflammationssjukdomar. Huruvida CRP skulle fungera som cancermarkör och användningen har diskuterats inom human- såväl som veterinärmedicinen. På djursidan och framförallt hos hundar har det visat sig att neoplastiska sjukdomar i sig inte påverkar CRP-nivåerna i blodet. Detta under förutsättning att cancern inte förorsakar nekros eller vävnadstrauma. Därmed blir ökningen av CRP endast en sekundärmarkör vid tumörsjukdom [1,5,6,8]. Detta redskap används även i humandiagnostiken och då i syfte att avgöra överlevnadsprognosen vid neoplastiska sjukdomar då det visat sig att CRP-nivåerna är en betydande faktor i sjukdomsbild. Det finns en större risk att det finns en spridning av neoplastiska celler, malignitet, metastasering om en inflammation, blödning uppstått nära modertumören [9]. Den har visat sig vara en framgångsrik markör vad gäller övervakning av hundar med immunmedierad hemolytisk anemi. Markören kan dock inte tala om hur hundens överlevnadschanser ser ut [9]. Hundar såväl som människor kan ses med ökad CRP-nivå vid artheoskleros, hundar som verkar predisponerade för detta är av rasen minischnauzer [10] Patologiska nivåer av CRP kan ses hos hundar med en systemisk inflammationsbild. Hundar med lokala infektioner så som ytliga bölder eller dylikt har en moderat eller låg koncentration av CRP [1]. Den förhöjda CRP-koncentrationen kan inte indikera vilket agens som förorsakat inflammationen. Förhöjningen kan endast svara på att inflammationen föreligger och med hjälp av CRP-övervakning kan man följa inflammationens förlopp [1,5]. För bestämning av CRP finns ett antal metoder beskrivna i litteraturen [3,4,6,8,11,12,13]. Human CRP-bestämning grundar sig ibland på monoklonala antikroppar mot humant CRP [4]. Detektionsmetoderna som används är Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), immunoturbidimetri och en modernare metod som innefattar magnetiska nanopartiklar coatade med antikroppar [1,3,4,6,8,11,12,13,14]. De antikroppsklädda magnetiska nanopartiklarna reagerar sedan med CRP i patientprovet och kvantifieras med hjälp av en specifik nanopartikelmätare som mäter bindningsgraden mellan antikropp och CRP. Tidigare referensmetoder har baserat sig på ELISA-teknik [8,10]. Denna metod har varit svår att adoptera till automatiska kemiinstrument och kostnadseffektivt kunna konkurrera med till exempel turbidimteriska metoder. ELISA metoden är betydligt mer kostsam och krävande per prov. Laboratorier som använder sig av automatiserade kemiinstrument brukar därför använda sig av immunoturbidimetriska metoder för bestämning av bildat antikropp-antigenkomplex. Vid bestämning av CRP med immunoturbidimetrisk metod hos hund används polyklonala antikroppar mot humant CRP [2]. Korsreaktiviteten mellan human antikropp och hund-crp är oftast god och reagenset blir betydligt billigare än användandet av en monoklonal hund- CRP-antikropp och används därför i större utsträckning [2]. Det finns även nackdelar med monoklonala antikroppar och deras höga specificitet kan resultera i obalans i bindningen mellan antigen och antikropp som i sin tur ger en för låg aggregatbildning vilket ger en försvagad turbulens [2]. I dagsläget utarbetas metoder med polyklonala antikroppar mot hund- CRP för ökad specificitet och kvalitet då efterfrågan på detta sannolikt kommer att öka [2]. Syftet med projektet är att validera en kvantitativ bestämningsmetod för CRP-koncentration i hundserum för rutinanalys. Valideringen som kommer att köras in på kemiinstrumentet Konelab autoanalyzer 20 kommer att innefatta linearitet, repeterbarhet, hållbarhet hos prover och kontroll, och riktighet hos metoden genom analys av dubbelprover. Ett referensintervall för friska djur framarbetas för instrumentet. 3

4 Specificitet och sensitivitet hos CRP som inflammatorisk markör vid olika sjukdomstillstånd har utvärderats i olika studier och där framkommer att CRP är en markör med hög sensitivitet vid inflammatoriska sjukdomstillstånd [1,2,5,6]. Ålder, kön eller ras hos hunden saknar signifikans i enlighet med studier som tidigare publicerats [5]. Därför togs ingen hänsyn till detta i undersökningen Material och metoder Prover och provhantering: Venösa blodprover från hundar samlades in, efter medgivande av djurägare, från rutinprover vid djursjukhuset i Skara. Insamlat material fanns också att tillgå från BioVet, veterinärmedicinskt laboratorium i Stockholm, detta material bestod av blodprover tagna på hundar som var positiva för reumatoid faktor dvs. inflammatorisk sjukdom några under ett reumatiskt skov. Prover från en frisk djurgrupp samlades in från Skara djursjukhus personaldjur. Totalt samlades 39 prover från sjuka inskrivna hundar på Skaras djursjukhus, 18 prover från BioVet på hundar med känd reumatisk artrit och 12 prover på friska normala hundar. Rutinproverna var tagna i serumrör utan antikoagulantiatillsats av djursjukvårdare och veterinärer. Proverna centrifugerades och hälldes av i ellermanrör. Prover från externa enheter var frysta. Dessa tinades upp och blandades noggrant före analys. Proverna märktes med provnummer. Efter analys frystes proverna in i -20 frys. En mindre undersökning av leukocytnivån jämfört med koncentrationen av CRP gjordes med hjälp av manuell differentialräkning av blodutstryk på 15 av de under projektet körda proverna. Turbidimetrisk kvantifiering av CRP Reagens 1: Anti-human CRP antikroppar från get tillsammans med TRIS ph 8,0 och stabilisatorer (DiaSystem Scandinavia AB, Sverige). Reagens 2: Buffert innehållandes TRIS ph 7,5, polyethylenglykol (PEG), detergenter och stabilisatorer, dessa är ej närmare beskrivna i produktbeskrivning (DiaSystem Scandinavia AB, Sverige). Internkontroll med humanserum som innehöll CRP-koncentrationer på 130mg/L (TruLab CRP som tillhandahölls av av DiaSystem Scandinavia AB, Sverige) användes. Metoden kalibrerades med hjälp av kitets medföljande kalibrator Metoden som utvärderades var immunoturbidimetrisk och det innebar att antiserum från get innehållande antikroppar mot human-crp reagerade med CRP i provet (från hund). Detta gav upphov till en grumling av provet. Därefter mättes grumlingen, provets turbulens, med spektrofotometri vid 340 nanometer. Den uppmätta absorbansen är direkt proportionell mot mängden antikropp-antigenkomplex som bildats och därmed mängden CRP mätt i mg/l. Metodens linearitet och beräkning av metodfel En internkontroll med den kända koncentrationen 130mg/L späddes i sju steg; 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:25, 1:32 och 1:64. Ett nollprov kördes också. Alla prover kördes i duplikat. De beräknade, väntade koncentrationerna jämfördes med de faktiskt uppmätta värden som erhölls efter körning av standardkurvan. Värdena plottades i en graf och reaktionens linearitet kunde åskådliggöras. En överensstämmelse mellan beräknat och uppmätt värde på +/- 10 % bedömdes som acceptabelt för metoden. 4

5 Referensvärdet för metoden beräknades genom körningar på serum från en normalpopulation. Prover kördes dubbelt på ett annat djursjukhus för att åskådliggöra hur metoden ligger i förhållande till ett annat sjukhus metod och instrument. Metodens precision Proverna kördes i duplikat och därigenom erhölls metodens repeterbarhet och inomserieprecision via beräkning av variationskoefficieten (CV). Det användes 40 provresultat körda i duplikat för beräkningen. Metodens känslighet Metodens lägsta detektionsgräns beräknades genom att den kända kontrollen späddes i en serie på 5 steg. 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 och 1:32. Spädningarna kördes 2 gånger i triplikat med 2 timmars mellanrum. Detektionsgränserna hos analysmetoden är beroende av reagenset och det analysinstrument man valt att använda. Rent teoretiskt kan man använda leverantörens uppgifter om detektionsgränser, men i praktiken uppstår markanta skillnader mellan olika analysinstrument trots användning av samma reagens. Därför bör detektionsgränsernas riktighet på det aktuella analysinstrumentet alltid utvärderas. Detektionsintervallet på detta laboratorium bestäms till det högsta och lägsta värde som kunnat bestämmas inom metodens linjära mätintervall. Hållbarhet Stabiliteten hos prover och reagens testades genom att två eller tre kända prov, ett prov med hög CRP-koncentration ett med låg koncentration och den kända kontrollen analyserades upprepade gånger över den tidsperiod provet förvarats i kylskåp. Parallellt evaluerades även reagensets hållbarhet. Detta utvärderades med kontrollen som referens. Kontrollen utvärderades under en längre period än de utvalda proverna. Resultat Metodens linearitet och beräkning av metodfel Metoden visade god linearitet inom intervallet mg/l med Trulab kontroll på 130 mg/l figur 1A och med kalibrering figur 1B av instrumentet med DiaSystems kalibrator inkluderad i reagenskitet. En god linearitet kunde ses med Medinors kontroll på 60 mg/l analyserad i olika spädningar figur 1C. Samma reagens och samma kalibrator användes vid båda utvärderingarna. En förskjutning i koncentration sågs vid utvärdering av Medinors kontroll. Normalpopulationens värden låg alla under lägsta detektionsnivån. Ett referensområde för metoden bestämdes till 3 mg/l. Ett övre referensområde kan inte bestämmas på populationen. Sex prover skickades till Universitetsdjursjukhuset vid SLU i Uppsala för kontrollanalys. Prover under detektionsgränsen svarades ut som <5 mg/l. För 3 prover kunde resultat urskiljas. SLU har överlag något lägre analysvärden än Skara djursjukhus. 5

6 FIGUR 1 Linearitet för mätning av CRP i serum hos hund med metod från TruLab, R 2 0,9972 (A), DiaSystem R 2 0,9997 (B) och Medinor R 2 0,9996 (C). De sex prover som kördes dubbelt med SLU i Uppsala visade på en avvikelse som varierade mellan 7 till 11 procent. Skara djursjukus värden låg generellt högre än SLUs resultat. Antalet prover var inte tillräckligt många för en statistisk beräkning. Tre av sex prover hade värden över 5 respektive 6 mg/l vilket är metodens nedersta detektionsgräns. Metodens precision För beräkning av inomkörningsvariationen användes 40 provresultat av den totala mängden körda prover i duplikat. Variationskoefficienten (CV) beräknades till 2,26 %. För variation över tid uppmättes CV för TruLab kontrollen till 3,16 % Metodens känslighet Efter körning av kontrollen och spädningar av denna i triplikat 2 gånger med 2 timmars mellanrum och sammanställning av den totala mängd körda prover fastställdes metodens lägsta detekterbara nivå till 3 mg/l. Hållbarhet Koncentrationen hos ett serum innehållande CRP ökade långsamt med tiden figur 2. Resultatet på prov innehållande hög koncentration CRP varierade från 179 mg/l upp till 196 mg/l över 5 dagar. Kontrollen låg relativt stabilt med ett spann på 128,2 mg/l upp till 143,1 mg/l över 11 dagar. Kontrollen kunde utvärderas längre eftersom mer volym fanns att tillgå av denna. Resultatet för prov med låg koncentration CRP visade endast negativa värden. 6

7 FIGUR 2 Hållbarheten över tid räknat i dagar visar en ökning av koncentration hos provet. både högkoncentrationsprovet (blå) och kontrollprovet(röd) visar att CRP är stabilt men ökar något över tid. Diskussion CRP hos hund har i många publikationer visats ha goda förutsättningar för att kunna användas för diagnostik och monitorering av inflammatoriska sjukdomar [1,2,7]. Stegrade CRPkoncentrationer ses hos hundar med systemiska sjukdomar då en kronisk inflammatorisk process föreligger [1,10]. Markören indikerar huruvida en inflammation existerar och i vilken grad [1,10]. Resultaten som presenteras talar för att metoden är linjär och stabil från 3 mg/l till 200 mg/l. Det nedre detektionsvärdet grundar sig i en genomgång av körda prover och en spädning av TruLab-kontrollen och Medinor-kontrollen. Samtliga 12 värden för den friska populationen och även värden i populationen för inskrivna djur på Skara Djursjukhus föll under detektionsgränsen på 3 mg/l. Rent instrumentmässigt är ett nedre detektionsvärde på 6 förinställt. Värden under detta svaras ut som <6 automatiskt av instrumentet. Det övre gränsvärdet har bestämts till 200 mg/l dels eftersom för få prover med en CRP-koncentration över detta värde fanns att tillgå vid utvärderingen och dels eftersom högsta standardpunkten för kalibreringskurvan är 200 mg/l. Ett CRP-värde på 3 mg/l och därunder har samma kliniska relevans som ett värde på 5 mg/l [15]. En säkerhetsmarginal finns med förprogrammeringen i instrumentet. Rent biologiskt har hunden alltid en viss koncentration CRP i sitt blod. Därför kan inte analytiska resultat rent teoretiskt vara noll eller underskrida noll. Men eftersom instrumentet beräknar koncentrationen av CRP i provet rent matematiskt efter uppmätt absorbans är det i praktiken möjligt med negativa värden. Att man sedan reflekterat över hur fysiologiskt riktigt dessa värden är ses som relevant. Man kan anta att alla matematiskt beräknade negativa resultat har ett reellt värde på 0<x<6. Gruppen normala friska djur med en population på 12 djur låg alla under gränsvärdet med negativa resultat. Detta försvårade införandet av ett referensvärde för friska hundar. I samråd med ansvarig laboratorieveterinär Kerstin Thorén Tolling kommer koncentrationsnivåer under 6 att betraktas som normala. Detta är i likhet med hur man ofta hanterar låga CRP svar hos människa. Där använder man sig ofta av beslutsgränser på < 5 mg/l eller <10 mg/l även om ett sant referensvärde är <3 mg/l, beroende lite på ålder och sammansättning av referenspopulationen. Den övre gränsen för normala hundar har varit svår att arbeta fram. Medelvärde och standarddeviation för sjuka djur positiva för reumatoid faktor hjälpte till föga eftersom medelvärdet understeg standarddeviationen så det undre gränsvärdet, det vill säga det övre normalvärdet blev negativt. 7

8 Denna studie innefattade prover från hundar med positiv reumatoid faktor. Många av dessa hundar hade förhöjda CRP-koncentrationer. Förekomst av enstaka låga, normalvärden kunde ses men detta kan förklaras med att dessa hundar inte var mitt i en akut inflammationsperiod. Vid sjukhuset, inskrivna patienter med varierande anamnes hade också varierande koncentrationer av CRP. I och med detta gjordes en jämförelse med CRP kontra leukocyter. Inget signifikant samband kunde ses. Många värden av CRP var negativa eller normala samtidigt som antalet leukocyter kunde variera kraftigt. Valideringen har utförts med ett begränsat antal prover och därmed blir studiens tillförlitlighet svår att uttala sig om något som grundar sig på dessa resultat. Men utredningar har gjorts med avseende på detta och även där syns inget signifikant samband [3]. En god repeterbarhet uppvisades och de 40 prover körda i duplikat gav ett CV på <3,5 %. Använder man samma reagens och samma kontroll och utför alltsammans med samma kalibrering kan man se att metoden har en acceptabel repeterbarhet. Hållbarheten hos serum är god inom 5 dagar, därefter stiger koncentrationen av CRP. Det öppnar möjligheter för transport av prover. Transporter inom Sverige skall ej ta längre än 1-2 dygn varför man skall kunna ta emot skickade prover från hela Sverige. Serumproverna skall gärna vara avhällda om dessa skickas över helg för att undvika hemolys under transporten vilket kan störa analysen. Ett serumrör skall hällas av inom 48 timmar. Eftersom ingen hållbarhetsundersökning gjordes i avseende på frysta prover går man på laboratoriets riktlinjer. Proverna sparas i kylskåp en vecka efter ankomst och därefter en månad i frysen. Huruvida proverna går att analysera efter längre frystider återstår att utvärdera. I princip skall en månads frystid vara mer än tillräckligt för alla rutinprover. Ser man till internkontrollen är lineariten god. TruLabs kontroll distribueras av DiaSystem Scandinavia AB. Den externa kontrollen från Medinor visade på en god linearitet. Värdena var förskjutna och visade på en förhöjning av det observerade värdet kontra det beräknade förväntade värdet men eftersom Medinors kontroll är framtagen för magnetisk nanoteknik och inte immunoturbidimetri [10]. Variationer metoder emellan uppstår alltid. Den externa kontrollen visar på en förskjutning av analysresultaten. Skillnaden mellan Medinors kontroll och TruLab är också den att TruLab är humankontroll, Medinor är en kontroll baserad på hundserum. För initiering av metoden i rutinverksamhet bör laboratoriet överväga att använda sig av en internkontroll av framställd med hundserum alternativt använda två polade serum med kända koncentrationer, ett högkoncentrations- och ett lågkoncentrationsserum. Grundar sig kontrollen på humant CRP ökar risken för felaktiga analysresultat framförallt i samband med batchbyten. Eftersom reagenset är utvecklat mot humant CRP och man utnyttjar korsreaktiviteten mellan CRP från de två arterna så finns det en risk att batchbytet också innebär byte av antikroppar som använts för att producera reagenset. Det finns en risk att korsreaktiviteten varierar mellan antikroppsbatcher och det kan påverka analysresultatet. Har man en humankontroll så kommer man inte upptäcka skillnaden i korsreaktivitet och risken är att man bibehåller ett bra antikroppsvar mot humant CRP men att reaktiviteten mot hund CRP förändras. Det är därför viktigt att inkludera kontrollmaterial från hund för att upptäcka denna typ av förändringar. Hundkontrollmaterialet måste åtminstone analyseras vid batchbyten för att kontrollera ovanstående. Det finns också fördelar med att analysera kontrollmaterialet från hund regelbundet även mellan batchbytena. Problemet med hundkontrollmaterial är att de kan vara svårare att få tag på och de kan vara dyrare. En kompromiss kan därför vara att ha både ett humant och ett hundkontrollmaterial som man analyserar enligt förutbestämda schema. 8

9 Internkontrollens syfte är att se till metodens riktighet och om det går att applicera på de prover som skall analyseras under dagen. Ligger kontrollen mer än 2 SD förskjutet underkänns kontrollen och instrumentet kalibreras om. Prover kördes dubbelt med SLU Uppsala och dessa låg något under Skara Djursjukhus analyssvar. Detta kan förklaras med att SLU använder Randox human CRP immunoassay, det vill säga samma metod men ett annat reagens av en större fabrikör. Om instrumentet är detsamma framkommer ej. Därför bör man inte jämföra resultaten. Det finns heller ingen säkerställd vetskap om deras internkontroll eller huruvida denna är human- eller hundbaserad. Målet var att utföra en metodvalidering för att införa bestämning på CRP-koncentration i serum från hundar och konklusionen av detta projekt är att metoden är linjär. Kontrollen som valideringen är baserad på är av human basis därmed kan man endast avgöra om metoden ligger instrumentellt rätt, men huruvida proverna som körs i daglig rutin är riktiga går inte att svara på. En kontroll som körs dagligen bör tala om mer än bara om metoden i sig är stabil. Den borde fastställa hur riktiga värden man erhåller. I dagsläget saknas en kommersiell kontroll baserad på hundserum, därmed får man hålla tillgodo med humankontrollen. Eventuellt att man poolar ett eget serum med en känd koncentration för att se så att laboratoriets värden stämmer överens även med hundbaserade serum. Andra mindre djursjukhuslaboratorier använder snabbtester för CRP-mätning och om en kommersiell hundkontroll erhålls kommer det löna sig för mindre djursjukhus att skicka sina prover till större djursjukhus med stora kemiinstrument eftersom snabbtestinstrumenten både är osäkra och dyra [15]. Sammanfattningsvis visar valideringen av C-reaktivt protein på Konelab Autoanalyzer 20 ett tillförlitligt resultat och metoden kommer att introduceras för rutinanalys i framtiden. Acknowledgement Först och främst vill jag tacka Skara Djursjukhus för deras stöd och hjälpsamhet i detta projekt. Utan deras goda samarbetsvilja hade jag aldrig fått ihop alla prover som behövdes för att genomföra valideringen. Jag vill tacka Kerstin Thorén Tolling som hjälpt mig med sitt goda handledarskap, stöd och breda kunskap. Det har alltid funnits svar att få när jag har frågat. Ett varmt tack till Helena Skallström och Catharina Johansson som gjort mitt examensarbete till ett nöje, samt hjälpt mig med alla laborationsrelaterade frågor jag behövt få svar på. Referenser [1] Kjelgaard-Hansen M: Användning av C-reaktivt protein hos hund i klinisk praxis. Svensk Veterinärtidning, 14: [2] Eckersall PD, Conner JG and Harvie J: An Immunoturbidimetric Assay for Canine C-reactive Protein. Veterinary Research and Communications, 15: [3] Kjelgaard-Hansen M, Friis-Mikkelsen L, Kristensen AT and Lundorff-Jensen A: Study on biological variability of five acute-phase reactants in dogs. Compromiced Clinical Pathology, 12:

10 [4] Ridker PM, Hennekens CH, Buring JE and. Rifai N: C-reactive protein and other markers in the prevention of cardiovascular disease in women. The New England Journal of Medicine, 342: [5] Nakamura M, Takahashi M, Ohno K, Koshino A, Nakashima K, Setoguchi A, Fujino Y and Tsujimoto H: C-reactive protein Concentration in Dogs with Various Diseases. Journal of Veterinary Medical Science, 70: [6] Tecles F, Spiranelli E, Bonfanti U, Cero n JJ and Paltrinieri S: Preliminary Studies of Serum Acute-Phase Protein Concentrations in Hematologic and Neoplastic Disease of the Dog. Journal of Veterinary International Medicine, 19: [7] Bathen-Noethen A, Carlson R, Menzel D, Mischke R and. Tipold A: Concentration of Acute-Phase Proteins in Dogs with Steroid Responsive Meningitis-Artritis. Journal of Veterinary International Medicin, 22: [8] Kjelgaard-Hansen M, Kristensen AT and Lundorff Jensen A: Evaluation of a commercially available ELISA for the determination of CRP in Canine serum. Journal of Veterinary medicine. America, 50: [9] Griebsch C, Arndt G, Ralia J, Schweigert FJ and Kohn B: C-reactive protein concentration in dogs with primary immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Clinical Pathology, 38: [10] Wong VM, Kidney BA, Snead ECR, Myers SL and Jackson ML: Serum C-Reactive protein concentrations in healthy Miniature Schnauzer dogs. Veterinary Clinical Pathology, 40: [11] Fransson BA, Bergström A, Wirdrop KJ and Hagman R: Assessment of three automated assays for CRP determination in dogs, American Journal in Veterinary research, 68: [12] Klenner S, Bauer N and Moritz A: Evaluation of three automated human immunoturbidimetric assays for detection of C-reactive protein in dogs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 22: [13] Gan N, Hou J, Cao Y, Li T, Guo Z and Wang J: A renewable and ultrasensitive electrochemiluminescence immunosenor based on magnetic RuL@SiO2-Au~RuL-Ab2 sandwich-type nano-immunocomplexes. Sensors Basel, 11: [14] Kjelgaard-Hansen M, Lundorff Jensen A and Kristensen AT: Evaluation of a Commercially Available Human C-Reactive Protein (CRP) Turbidometric Immunoassay for 10

11 Determination of Canine Serum CRP Concentration. Veterinary Clinical Pathology, 32: [15] Pickert HD, Einspanier R, Arndt G, Brunnberg L and Kohn B: Evaluation of a point-ofcare test for canine C-reactive protein. Veterinary Clinical Pathology, 40: