Det nya blodgruppsystemet FORS

Transkript

1 Equalis användarmöte, Transfusionsmedicin Det nya blodgruppsystemet FORS Annika Hult 1,2 BMA, PhD Lola Svensson 3, Robert Stamps 4, Jill R Storry 1,2, René Jørgensen 5, Lennart Rydberg 3, Stephen M Henry 6 och Martin L Olsson 1,2 1. Dept. of Laboratory Medicine, Lund University, Lund, Sweden. 2. Dept. of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, University and Regional Laboratories of Region Skåne, Lund, Sweden. 3. Dept. of Clinical Chemistry and Transfusion Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden. 4. Red Cell Immunohaematology Laboratory, NHS Blood and Transplant, Sheffield, United Kingdom. 5. Carlsberg Laboratories, Copenhagen, Denmark. 6. Auckland University of Technology, Auckland, New Zealand.

2 Transfusionsmedicin, den moderna erans början Karl Landsteiner ( ) Upptäckten av ABO-blodgruppsystemet Blandade blod från kollegor i labbet och såg ett mönster A, B, O (och senare även AB) Fick Nobelpriset 1930 för denna upptäckt Landsteiner K. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe. Zbl Bakt. 1900;27: Landsteiner K. über Agglutinationserscheinungen normalen Menschlichen Blutes. Wiener Klinische Wochenschrift. 1901;14:

3 Vad är ett kriterierna för ett blodgruppssystem? Antigenet ska finnas på erytrocyter Någon ska ha gjort en antikropp mot antigenet (human alloantikropp) Ärftlighet ska vara visad Genetiska bakgrunden ska vara definierad controlled at a single gene locus, or by two or more very closely linked homologous genes Godkänns av ISBT (International Society of Blood Transfusion)

4 Hur många blodgrupper finns det? Idag finns 33 blodgruppssystem, t.ex. ABO, Rh, Kell, Duffy (vilket totalt inkluderar 297 antigen) Dessutom finns 42 antigen som inte uppfyller kriterierna för blodgruppssystem och därför hamnar i. Blood group collection 700 serien (lågfrekvensantigen, <1%) 901 serien (högfrekvensantigen, >90%)

5 Blodgrupper Enzymes Host defence/ innate immunity ABO P1Pk Lewis GLOB FORS H I Glycoproteins of structural or unknown function Transporters and channels LW Xg Duffy Lutheran Indian Scianna Raph JMH Ok a Adhesion molecules Complement regulation Figur lånad av Jill Storry

6 Kolhydratantigen, fyra nivåer Genen Genetisk nivå Glycosyltransferas (GT) Enzymnivå Kolhydratantigen Glykokonjugatnivå Antikroppar Immunologisk nivå

7 Varför är kolhydratblodgrupper viktiga? Antikropparna är inblandade i Hemolytiska transfusionsreaktioner Hemolytisk sjukdom hos nyfödda Upprepade missfall Antigenen kan vara Receptorer för olika patogener Förändrat uttryck vid malignitet Förändrat uttryck under graviditet Blodgrupp/ antigen Microorganism Sjukdom ABO, MNS Plasmodium falciparum Malaria P1, P k Escherichia coli UTI P Escherichia coli UTI Le b Helicobacter pylori Gastritis H, Le b Burkholderia ambifaria Lung infection ABO, LE Vibrio cholerae Cholera P Parvovirus B19 Fifth disease P k HIV AIDS H/Le b Norovirus Gastroenteritis ABO LE H Rotavirus Infantile gastroenteritis

8 Serologin en paradox Pab (anti-a, anti-a,b) pos/neg Applied Blood Group Serology P. Issit & D. Anstee Mab (anti-a) neg Helix Pomatia pos Anti-A detekterbart i plasma

9 ABO-genotypning av A pae -individer A pae #1 A pae #2 O 1 O 1 O 1 O 1v Borde inte A-subgrupper vara heterozygota för en A-allel.? Första ABO-subgruppen utan ett funktionellt ABO transferas?! Njaaee Vår hypotes var att detta skulle kunna vara en A-lik men unik glykolipid-struktur.

10 Tunnskiktskromatografi Avsaknad av A-specifika band när man testar med anti-a Band motsvarande Forssman (Fs) glycolipiden när man testar med Helix pomatia Fs-glycolipiden verifierad med Mab anti-fs Strukturanalys av glycolipider med MS/MS och NMR identifierar Forssmanstrukturen som A pae -antigenet

11 Vad är Forssman i jämförelse med ABO? Forssman ABO P Prekursor H Forssmansyntas α3galnac Donator socker α3galnac A glykosyltransferas Fs Antigen A Däggdjur (ej primater) På erytrocyter Människa/ Apor GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer

12 Flödescytometrisk karaktärisering av erytrocyter från A pae -individer Fs-antigen finns på A pae -erytrocyter Anti-Fs i plasma från icke-a pae -givare a A 1 O MAb Anti-Fs Hund A pae #2 A pae #1 Får b O X-test Grupp B plasma A pae #2 A pae #1 Korstest med eluat från A pae #2 O A 2 A 1 A pae #1 Hund Får

13 Fylogenetiskt dendrogram av ABO (GT6) gen-superfamiljen Turcot-Dubois A-L et al. Glycobiology, 2007;17(5): ABO-kluster FS-kluster ABO Homo sapiens Homo sapiens Canine

14 , en förmodad pseudogen, ändras till hundvarianten i A pae -individer! Human konsensus 887G* Gorilla konsensus 887G** Arginin = human + primat konsensus Glutamin = hund konsensus Human A pae #1 887G>A (Arg296Gln) PCR-ASP 887G>A A pae #1 pos neg H 2 O M * >250 givare med normal ABO-grupp **fem andra primater var också negativa *** hittad i 7 av 104 givare

15 I A A A 1 O 1 887G/G II O A pae O 1 O 1 887G/A A pae #1 O 1 O 1 887G/A A A A 1 O 1 887G/G nt A pae #1- familjen III O O 1 O 1 887G/G? O 1 O 1 887G/A A A 1 O 1 887G/G A A 1 O 1 887G/G nt 887G>A detekterades i olika alleler hos dessa två familjer! I A pae O II O O 1 O 1v 887G/G O O 1 O 1v 887G/G A pae #2 O 1 O 1v 887G/A nt O O 1v O 1v 887G/G A pae #2- familjen III A pae O 1 O 1v 887G/A O O 1 O 2 887G/G

16 % % -mrna uttrycks i blod och benmärg -mrna från benmärg vs. perifert blod % of highest expression % of highest expression BM n=1 Blood n=4 -mrna från perifert blod i vanliga vs. A pae -fenotyper Blood n=4 Apae#1 Apae#2

17 3D-modell av Forssman-syntaset baserat på kristallstrukturen av ABO-transferaset ABO hfs Acceptor ABO: His301 Donator socker

18 Fs-bindande E.Coli agglutinerar får- och A pae -erytrocyter Fs-positiv Parent Strain, K12 (HB101) P-fimbriated strain, papg (HB101.AD110) A 1 A 2 O O A pae #1 A pae #2 Sheep Neg kont. Pos kont. Fs-binding strain, prsg (HB101.JFK102) Negativ Positiv

19 Vidare studier. Expressionsstudier - Kan (887G>A) Arg296Gln aminosyraskiftet göra enzymet aktivt? Hemolysintest - Är anti-fs en kliniskt signifikant antikropp?

20 Transfektion av MEG-01 + DNA Mutation introducerad via mutagenes VEKTOR VEKTOR MED INSERT B3GALNT1 vildtyp 887G mutant 887A P-transferas

21 ELEKTROPORERING Transfektion av MEG-01 P Fs + P Fs Odlar cellerna i ytterligare 48h

22 Transfektion av MEG-01 Fs-antigenet P-antigenet Pk-antigenet β3 α3 β3 P-antigenet Pk-antigenet Fs Fs P P 887G vildtyp 887A mutant Glc Gal GalNAc Nomenklatur enligt Consortium for Functional Glycomics

23 Resultat av transfektion av MEG-01 - Tre experiment - Trippelprover i varje experiment *** 887A 887G inget

24 Forssman-negativitet i människa

25 Hemolysintest Anti-Forssman, en naturligt förekommande antikropp Metod modifierad från Mollison (Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10 th edition 1997) - Färskt serum från blodgrupp O och B givare med starkt anti-fs - A pae erytrocyter - ABO-kompatibla och icke-kompatibla erytrocyter - Både nativa och papainiserade erytrocyter användes - Hemoglobin-nivåer lästa på HemoCue Low

26 Hemoglobin g/l Hemoglobin g/l Hemolysintest - Resultat Hemolysin test; group O serum A pae #1 A pae #2 O O A 1 B Hemolysin test; group B serum A pae #1 A pae #2 O O A 1 B Apae #1 Apae #2 O O A1 B Apae #1 Apae #2 O O A1 B A pae #1 A pae #2 O O A 1 B A pae #1 A pae #2 O O A 1 B

27 Konklusion Hemolysintest - Indikerar att anti-fs kan binda komplement - Vilket potentiellt kan orsaka intravaskulär hemolys av Fs-positiva erytrocyter Bör dessa individer vara blodgivare? BAS-test? MG-test? Expressionsstudier - Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av vildtyp och mutant - Detta indikerar att bytet 887G>A (Arg296Gln) ger upphov till aktivering av Forssman-syntaset

28 Lactosylceramide Lactotriaosylceramide 4-α-galactosyltransferase (A4GALT) P1 3-β-N-acetylglucosaminyltransferase 4-β-galactosyltransferase Paragloboside, nlc4 2-α-fucosyltransferase (FUT1) H 3-β-N-acetylgalactosaminyltransferase (?) PX2 4-α-galactosyltransferase (A4GALT) P k, Gb3 (CD77) 3-β-N-acetylgalactosaminyltransferase (B3GALNT1) NOR 1 P, Gb4 (globoside) 4-α-galactosyltransferase (A4GALT) 3-β-galactosyltransferase (B3GALT5) Forssman 3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase () Gb5 (SSEA-3) 3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase (ABO) 3-α-galactosyltransferase (ABO) 2-α-fucosyltransferase (FUT1) α-sialyltransferase (?) A B Globo-H LKE (SSEA-4) 2-α-fucosyltransferase (FUT1) 3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase (ABO) Globo-A 3-α-galactosyltransferase (ABO) Globo-B 3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase (ABO) A type 3

29 Vi föreslog att Forssman-antigenet blir godkänt av ISBT som ett nytt histo-blodgruppssystem, FORS (031). till ära av John Forssman ( ), som 1911 beskrev antigenet Professor i Mikrobiologi, Patologi och Allmän Medicin Lunds Universitet, Lund

30 Blodgruppsystem 031 Vid 32 nd International Congress of the ISBT, Cancun, Mexico godkändes Forssman som ett eget blodgruppsystem Nummer 031 Systemnamn FORS Systemsymbol FORS Antigen FORS1 Gen

31 Konklusion ABO-subgruppen A pae visades vara ABO-oberoende Forssman-antigen påvisades för första gången i normal hematopoetisk vävnad Strukturen av Forssman-antigenet konfirmerades med MS/MS och NMR I -genen hos alla A pae -individer påvisades en djur-associerad mutation som ej fanns hos icke-a pae familjemedlemmar, normala givare och sex andra primater. Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av vildtyp och mutant Den kliniska signifikansen av anti-fs är ej känd men A pae -givare kan bli korstestpositiva med patientplasma Hemolysintest indikerar att anti-fs kan binda komplement vilket potentiellt kan orsaka intravaskulär hemolys av Fs-positiva erytrocyter

32 Blodgruppsystem 031 VEL LAN JR FORS Fs, 1911 Transfusion cover, 2010

33 Tack till: Göteborgs Universitet, Göteborg Lola Svensson Lennart Rydberg Susann Teneberg Jonas Ångström Bo Samuelsson Michael Breimer Gunnar Hansson Göran Larsson Jonas Nilsson Auckland University of Technology, Auckland, New Zealand Steve Henry Lunds Universitet, Lund Martin L Olsson Jill R Storry Britt Thuresson Maj-Lis Svensson Catharina Svanborg NHSBT, Sheffield, UK Robert Stamps Carlsberg Research Laboratory, Copenhagen, Denmark René Jørgensen Och naturligtvis A pae -familjerna!