SLUTRAPPORT. Projekttitel. Ny metod att styra målinriktad cancerbehandling med hjälp av robust provtagning av tumörceller från vanliga blodprover

Transkript

1 SLUTRAPPORT Projekttitel Ny metod att styra målinriktad cancerbehandling med hjälp av robust provtagning av tumörceller från vanliga blodprover Dnr Projektledare Christer Ericsson Innehåll: 1. Projektets syfte och bakgrund 2. Projektets genomförande 3. Uppnådda resultat 4. Genomförda insatser för att resultaten ska komma till praktisk användning 5. Publikationer, presentationer och annan spridning inom projektets ram Sammanfattning Två publicerade kliniska studier visar att det tidigt går att upptäcka tumörceller i blodprover innan några symptom visat sig, vilket är ett lovande steg på vägen mot screening för cancer. En prospektiv, observationell kohortstudie (klinisk prövning) undersöker det kliniska värdet av detaljerad information om mutationer för bättre behandlingsstyrning för svårdiagnosticerade cancersjuka. Resultaten kommer till praktisk användning m.h.a. företaget icellate Medical i Karolinska Institutets Science Park 1. Projektets syfte och bakgrund Syftet är att hitta de bästa förutsättningarna för provhantering för att dels kunna upptäcka tumörceller i blod tidigt och dels kunna använda detaljerad information om mutationer för bättre behandlingsstyrning för cancersjuka. Bakgrunden är utveckling av en andra generations mikrofluidisk cellseparationsteknik för cirkulerande tumörceller från perifera blodprover, där nyttiggörandet lagts i det nystartade, sedan 2011, bolaget icellate Medical i Karolinska Institutet:s Science Park, efter det att första generationens biomarkör/immunaffinitetsbaserad teknik CellSearch inte visade sig leva upp till förväntningarna. 2. Projektets genomförande (uppställt i enlighet med ansökan) a) Effekt av olika provstabiliseringslösningar på isolering av celler a. Stabiliseringslösningar för cellfritt DNA, såsom Cytomark Transfix, var inte praktiskt användbara för att bevara celler, och visade sig heller inte nödvändiga eftersom EDTA visade sig ha en tillräcklig stabiliserande effekt (se nedan). Stabiliseringen av cellfritt DNA är väl dokumenterad. Den goda erfarenheten från cell-fritt DNA gick dock inte att överföra på celler. b. Stabiliteten av i övrigt obehandlade, nativa, tumörceller i EDTA-försedda provtagningsrör för perifert blod i klinisk rutin visade sig god, i upp till 48 timmar. Det visade sig alltså att celler i dessa i vården vanligt förekommande blodrör har god stabilitet, så god stabilitet att ingen ytterligare provstabilisering

2 må vara nödvändig om snabba (<48 timmar från provtagning till laboratorium) transporter kan organiseras. c. Vi har också goda resultat med en ny frysbevarande process för blodceller. Dock kräver frysbevarandet en noggrann infrysningsprocess vid -80 C som många kliniker inte må ha, eller kunna sätta upp. I dagsläget medför alltså frysbevarande av celler en sådan komplikation att den inte kan motiveras om snabba transporter (<48 timmar) till laboratoriet är tillgängliga. d. Vi kunde visa att snabba transporter kan organiseras över stora avstånd, från t.ex. Filipinerna (men däremot inte från t.ex. Iran), som anländer i sådan god tid att cellerna kan processeras i icellate Medicals laboratorium i Solna utan annan provstabilisering än EDTA i blodrören. Det visade sig alltså onödigt med provbevarande i upp till 10 dagar, med frysbevarande eller på annat sätt. e. Av kemiskt korslänkande provstabiliseringslösningar visade sig protokollet för formaldehyd (FA), efter test med DNA sekvensering och bioinformatisk analys, vara funktionellt vid låga mängder formaldehyd, varför den mer komplicerade DSP (dithiobis[succinimidylpropionate]) baserade korslänkning visade sig onödig. f. Slutsatsen är att nativa tumörceller i EDTA rör är stabila i upp till 48 timmar pre-analytiskt och att det är tillräcklig stabilt så länge snabba transporter till laboratoriet kan organiseras. b) Immunfärgning av isolerade celler a. Utgångsläget med immun-färgning med anti-cytokeratin, anti-cd45 och DAPI visade sig otillräckligt. Särskilt sådana maligna celler som genomgått epitelialtill-mesenkymal transition (EMT) visade sig svagt färgade av den etablerade antikropps-cocktailen, varför provet inte blev representativt. Vi blev därför tvungna att utveckla en mer komplex cocktail av antikroppar som ger en mer representativ infärgning också av högmaligna celler med svag cytokeratin färgning. b. Den nya antikropps-cocktailen är nu föremål för bedömning av hur att på bästa sätt skyddas för intrång, m.h.a. patentering, som företagshemlighet, eller på annat sätt. c) Laser Capture Microdissection (LCM) av enskilda celler a. LCM visade sig inte vara en lämplig metod att isolera enskilda celler eftersom den visade sig svår att kombinera med den mikrofluidiska tekniken för cellseparation. b. En ny metod där enskilda celler istället aspireras med en mikropipett under mikroskop, och sedan överförs till PCR-rör under mikroskop-övervakning, visade sig överlägsen och har nu ersatt LCM för vidare analys på DNA nivå. d) DNA och RNA extraktion och kontrollmätning a. Extraktion av DNA visade sig överlägset RNA eftersom genomiskt DNA är mer stabilt än RNA, och en ny amplifieringsmetod, MDA, (se nedan) har utvecklats så väl att den tillräckligt väl motsvarar kraven på en första generationens genomisk DNA amplifieringsmetod. Extraktion av RNA visade sig därför sämre och onödig och används inte. DNA koncentration mäts med Qubit 3 fluorometer, en Molecular Devices QuickDrop eller m.h.a. Pico Green i en Tecan Infinite F Nano och DNA storlek uppskattas med Agilent Bioanalyzer. e) PCR amplifiering av isolerade DNA och RNA a. Amplifieringsmetoden Multiple Displacement Amplification (MDA) visade sig effektiv i att amplifiera direkt från genomiskt DNA, varför den ursprungligen planerade tekniken att amplifiera cdna från mrna, med dess fördelar med stora mängder av vissa gentranskript, men underrepresentation av andra, visade sig onödig och kom inte till användning. Projektet är därför nu

3 baserat på genomiskt DNA enbart, vilket är mer representativt av genomet i sin helhet vilket i sin tur är vad som är mest relevant för behandlingsstyrning av cancer. f) Konstruktion av DNA bibliotek, förberedelse och sekvensering a. Extraherat och amplifierat genomiskt DNA genomgår Targeted Single Primer Enrichment Sequencing with Single End Duplex-UMI, d.v.s. en amplikonbaserad metod för anrikning av de mest intressanta generna för behandlingsstyrning. Våra undersökningar med key opinion leaders visar att vården fr.a. är intresserad av sådana analys-resultat som direkt kan bidra till att styra behandlingen, snarare än att förstå tumörens naturliga förlopp, varför betydligt mindre genpaneler än ursprungligen förutsett behövs. Metoden är lämplig för de relativt små paneler om drygt 22 gener som är av direkt kliniskt intresse genom att vara behandlingsstyrande för riktade cancer-terapier. Den använder också molekylära streck-koder i form av Unique Molecular Identifiers (UMI) som medför att eventuella amplifierings- och sekvenserings-artefakter i efterhand kan reduceras m.h.a. bioinformatik. Sådana paneler kan sekvenseras till ett djup som tillsammans med fel-korrigering och brusreduceringen m.h.a. UMI, gör detektion av onkogena varianter möjliga ner till en Variant Allele Fraction (VAF) av 0,1%, vilket är bra både för sekvensering av homogena genom såsom från cirkulerande tumörceller, och som är kliniskt relevant för t.ex. detektion av den cirkulerande tumör-dna (ctdna) fraktionen av cellfritt cirkulerande DNA (ccfdna). Limit of Detection (LoD), känslighet och specificitet mäts med hjälp av speciella referens-genom med kända egenskaper. g) RNA Sequencing (RNA-Seq) a. DNA sekvensering har ersatt det tidigare planerade RNA-Seq som utretts ovan. Genomiskt DNA extraheras från enskilda isolerade celler, varefter det amplifieras, kontrolleras och genomgår Targeted Single Primer Enrichment Sequencing with Single End Duplex-UMI, varefter det genomgår kvalitetskontroller och f.n. sekvenseras vid den nationella core-faciliteten Science for Life Laboratory (SciLifeLab) i Solna. P.g.a. ibland långa och osäkra ledtider och oklarhet om kvalitetssäkringen kommer sekvenseringen flyttas in house genom införskaffande av en egen DNA sekvenator avsedd att motsvara kliniska kvalitetskrav, en Illumina NextSeq 550 Dx, under våren Genom att också introducera normal-dna som referens för sekvenseringen av tumör-dna ökar tillförlitligheten i DNA sekvenseringen av tumör-dna, antigen det är från CTC eller ccfdna. Rutiner för gdna preanalytisk provhantering, extraktion och rening introducerades därför utöver rutiner för CTC preanalytisk provhantering, och DNA extraktion och rening. h) Kopietalsförändringar hos kromosomer a. Eftersom projektet nu är baserat på genomiskt DNA enbart, och inte mrna; behövs inte längre en separat pipeline för kopietalsförändringar hos kromosomer. Kopietalsförändringar baseras istället på över- eller underrepresentation av segment av tumör-genomet i DNA sekvensresultaten, vilket är förenklande och sparar de värdefulla kliniska proven. i) Klinisk validering a. För a-symptomatiska individer som visar att tumörceller kan upptäckas hos ca1-3% av alla individer utan symptom av cancer 1,2 b. För redan symptomatiska patienter som en del av det standardiserade vårdförloppet (SVF) för dels cancer med okänd primärtumör (CUP) och dels Allvarliga Ospecifika Symptom som kan bero på cancer (AOS); de två kanske svåraste cancer-diagnoserna. I valideringen ingår jämförelser mellan DNA sekvenserna hos det genomiska DNAt (gdna), tumördna fraktionen

4 (ctdna) av cirkulerande cellfria DNA (ccfdna) och förekomst, antal och genomisk DNA sekvens hos cirkulerande tumörceller. De molekylära resultaten jämförs sedan med den kliniska diagnosen. Valideringen är ett samarbete med det Diagnostiska Centret (DC) vid Södertälje Sjukhus och de ansvariga för tidig upptäckt vid de Regionala Cancer Centret Stockholm Gotland. Se clinicaltrials.gov för detaljer ( j) Etiska överväganden a. Den kliniska valideringen har godkänts av Etikprövningsmyndigheten, Dnr: Uppnådda resultat a) En robust metod att bevara blodprover så de kan analyseras med avseende på genetiska mutationer i cirkulerande tumörceller för att bedöma bästa behandling eller om den valda behandlingen har haft effekt valideras genom: b) Provstabilisering av tumörceller i EDTA blodrör i upp till 48 timmar c) Transporter av nativa blodprover som når laboratoriet i Solna inom 48 timmar d) Cellseparation med låga koncentrationer av formaldehyd e) Isolering av ner till enskilda cirkulerande tumörceller från i vården vanliga EDTA blodprover med hjälp av en ny mikrofluidisk metod f) Representativ detektion av de isolerade tumörcellerna med en ny antikroppscocktail och immunofluorescens g) Dispensering av enskilda isolerade tumörceller med hjälp av mikroskop-kontrollerad aspiration h) Extraktion av de små mängder av genomiskt DNA, 6 pg, som finns i enskilda tumörceller. i) Amplifiering av genomiskt DNA till med Next Generation DNA Sequencing (NGS) analyserbara mängder m.h.a. Multiple Displacement Amplification (MDA). j) Anrikning av behandlingsstyrande gener och kontroll av eventuella amplifierings- och sekvenseringsartefakter m.h.a. Targeted Single Primer Enrichment Sequencing with Single End Duplex-UMI k) NGS vid SciLifeLab, men övergående till in-house med egen Illumina NextSeq 550Dx sekvenserings-utrustning. l) Fördelar med användning av Unique Molecular Identifier (UMI) märkning av det isolerade DNA:t och sekvensering av båda DNA strängar visade sig viktiga för att nå en Variant Allele Frequency (VAF) av ner till 0,1% vilket är viktigt för att kunna sekvensera tumördna som finns i liten andel i överskott av normalt DNA. m) Användning av UMI för sekvenseringen av genomiskt DNA leder till att den bioinformatiska pipelinen behöver utformas för att ta till vara UMI informationen för att normalisera DNA sekvenseringen. En egen-utvecklad och specialanpassad bioinformatisk pipeline utvecklades därför. n) Klinisk validering i form av vetenskaplig publicering av två prospektiva, observationella, kohortstudier av a-symptomatiska personer med och utan riskfaktorer för cancer 1,2 visar på möjligheten till screening för cancer o) Klinisk validering av den praktiska nyttan av detaljerad information om mutationer för bättre behandlingsstyrning för redan cancersjuka 4. Genomförda insatser för att resultaten ska komma till praktisk användning Nyttiggörandet sker m.h.a. företaget icellate Medical i Karolinska Institutets Science Park ( Företaget följer ISO för produktutveckling och ISO för medicinska laboratorietjänster och står under Inspektionen för Vård och Omsorgs (IVO) tillsyn.

5 Företaget använder ett nytt CE märkt instrument för separation av olika celltyper från blodprov, inklusive cirkulerande tumörceller. Företaget erbjuder följande tre medicinska laboratorietjänster, som bygger på resultaten i det nu rapporterade projektet: Genetisk cancerutredning, Nedärvd cancerrisk och Personlig cancerscreening. Vänligen se hemsidan för utförligare beskrivning av tjänsterna. 5. Publikationer, presentationer och annan spridning inom projektets ram 1 Castro, J., Sanchez, L., Alvarez Bedoya, P.H., Nunez, M.T., Lu, M., Castro, T., Sharifi, H.R and Christer Ericsson Screening Circulating Tumor Cells as a Non-invasive Cancer Test in 1,585 Asymptomatic Adults (ICELLATE1). J Integr Oncol 7, doi: / (2018). 2 Castro, J., Sanchez, L., Nunez, M.T., Lu, M., Castro, T., Sharifi, H.R. and Christer Ericsson Screening Circulating Tumor Cells as a Noninvasive Cancer Test in 3388 Individuals from High-Risk Groups (ICELLATE2). Disease markers 2018, 5, doi: /2018/ (2018). 3 Published clinical trial Molecular Analysis of Blood Samples in Standardized Cancer Care Referrals for SCAN and CUP at 4 Invited speaker with the title Metastasis and CTCs as Prognostic Factor at the 3rd Seminar on the Perspectives of CTCs in Clinical Oncology Mashhad University of Medical Sciences, Iran on 4 March, Invited speaker with the title Circulating Tumor Cells (CTC) and Metastases at the 3rd International Nastaran Center for Cancer Prevention (NCCP) Conference, Mashhad University of Medical Sciences, Iran on November, Invited speaker with the title Screening circulating tumor cells as a non-invasive cancer test in 3,388 individuals from high-risk groups (ICELLATE2) at the Single Cell Europe Conference, Prague, Czech Republic, September 19-21, Sävblom, C., Söderholm, R., Lindholm, J. and Christer Ericsson The value of molecular biological analysis of blood samples in standardized care procedures for serious nonspecific symptoms (AOS) that may be caused by cancer and cancer of unknown primary tumor (CUP) Poster presentation at the The Eighteenth Annual KICancer-StratCan Retreat, Djurönäset, Sweden, September 16-17, 2019.