Human Molekylärgenetik

Transkript

1 Human Molekylärgenetik Del 2 Identifiering av riskgener för komplexa sjukdomar ANDERS MÄLARSTIG, molekylärgenetiker på enheten för aterosklerosforskning, Centrum för Molekylärmedicin, Karolinska Institutet, Solna anders.malarstig@ki.se Monogen sjukdom Nära 100 % penetrans Låg incidens Miljöfaktorer mindre viktiga Exempel: huntingtons sjukdom, cystisk fibros, hyperkolesterolemi Fenotypen beror helt på vilken gen och i vilken position i genen variationen finns Kopplingsstudie Komplex sjukdom Låg penetrans Hög incidiens Miljöfaktorer lika viktiga som genetiska Exempel: hjärtinfarkt, stroke, benskörhet, reumatoid artrit, grön starr, Chrons sjukdom, manodepressivitet Patienter med sjukdomen är en heterogen grupp med olika bakomliggande orsaker till sjukdom Associationsstudie 1

2 Vetenskaplig frågeställning / hypotes Design av experimentell eller klinisk studie Bioinformatik Genotypning Statistisk analys replikering Funktionella studier Tillämpning Identifiering av riskgen Från känd biologi Genome wide association Kandidatgen Genotypning av ett stort antal SNPs spridda över genomet Genotypning av ett mindre antal tlsnps Statistisk analys Statistisk analys Funktionella studier och bekräftande kliniska studier 2

3 Kandidatgen Utgångspunkt i kända biologiska sjukdomsmekanismer Prövaren hypotes, men den ärbegränsad avbefintlig biologisk kunskap om sjukdomen Enkel epidemiologisk statistik kan användas Många SNPs inom en liten region kan bestämmas för att maximera genetisk information Associationsstudie helgenoms SNP Genome wide association prövar hypoteser som ännu inte formulerats Stora fall kontrollstudier Chip tekniker som Affymetrix och Illumina Helgenoms chip för mellan 100k SNPs och 1M SNPs Särskilda statistiska tekniker som beaktar att ett stort antal statistiska test görs 3

4 Helgenomsstudier har identifierat flera sjukdomslokus senaste 2 åren bl.a. TCF7L2 för typ 2 diabetes Kromosom 9 p21 förhjärtinfarkt och typ 2 diabetes Kromosom 6q23 och IRF5 genen för reumatoid artrit 10q26 i den okända genen LOC för grön starr FTO genen för ökat body mass index m.m. Venös trombos (blodpropp) Allvarligt tillstånd där blodflödet i en ven hindras, vid lungemboli livshotande Hög ålder, cancer, p piller och kirurgiska ingrepp är vanliga riskfaktorer Incidens cirka 175 fall / inv. och år Genetiska riskfaktorer i factor 5, protrombin, protein C och S generna, vilka ingår i reglering av koagulation SNPs i 5 andra gener har visat association till sjukdomen SNPs i 5 andra gener har visat association till sjukdomen Ärftlighet över 50 % 4

5 Urval av fall och kontroller Rekrytering av patientgrupp via klinik Rekrytering av matchade friska individer via populationsregister Venöst blodprov för att ta DNA och blodplasma Exkludering av patienter som inte uppfyller fördefinierade kriterier, Längd, vikt, ålder, livsstilsvanor dokumenteras Databas Bestämning av plasmaprotein i blodprover Upprättande av biobank Framrening av DNA från blod Genotypning av 300k SNPs med chip teknik Teknologier för SNP genotypning Pålitliga Snabba Kostnadseffektiva Robotiserade mindre manuellt arbete Flexibilitet vid design av metod 5

6 ATGCC TCGGG AAATG ATGCT TCATAT nom wide associat tion ATGCT 5000 Princip för ge TCATAT GCGCT

7 Illumina 7

8 8

9 CHR SNP POSITION GENE LOC MAF HWE_P A 1 A 2 CHISQ P_CMH OR_CMH X rs PCDH11X 5UTR 46.7% 0.79 T C E X rs PCDH11X flanking_3utr 20.3% 0.24 A G E X rs % 0.92 T C E rs PTGER4 flanking_5utr 36.4% 0.97 C T E rs PPP1R12B intron 36.7% 0.75 C T E rs PPP1R12B coding 35.9% 0.96 T C E rs PPP1R12B coding 36.3% 0.93 A G E rs PPP1R12B intron 36.8% 0.19 C T E rs F3 3' UTR 28.0% 0.94 C T E rs TPTE2 intron 48.5% 0.79 C G E X rs % 1.00 G T E rs ABL1 intron 2.2% 0.98 T C E X rs % 0.79 T C E rs CCND2 intron 33.9% 0.95 A C E X rs NLGN4X flanking_5utr 36.8% 0.18 T C E Hardy Weinberg equilibrium This model relies on the following assumptions: a. Infinite population size. b. Discrete generations. c. Random mating. d. No selection. e. No migration. f. No mutation. g. Equal initial genotype frequencies in the two sexes. 9

10 Hardy Weinberg equilibrium If we define the frequencies of the alleles as: p = P(A) = u + v/2 q = P(a) = v/2 + w then, the genotype frequencies are: P(A/A) = p 2 P(A/a) = 2pq P(a/a) = q 2 Second generation respects the same distribution: P(AA)= (p 2 + ½2 pq) 2 = [p(p+q)] 2 = p 2 P(Aa)= 2(p 2 + ½2pq) (½2pq +q 2 ) =2p(p+q)q(p+q)= 2pq P(aa) = (½2pq + q 2 ) 2 = [q(p + q)] 2 = q 2 p + q = 1 p2 + 2pq + q2 = 1 THE HARDY WEINBERG LAW p = frequency of the dominant allele in the population q = frequency of the recessive allele in the population p2 = percentage of homozygous dominant individuals q2 = percentage of homozygous recessive individuals 2pq = percentage of heterozygous individuals 10

11 Statistisk metodik 1, Hardy Weinberg Equilibrium (kvalitetskontroll av genotypning) Hardy Weinberg observed expected chi square p value (1 tailed) Controls AA ,238 0,0004 Aa ,523 0,0018 aa 28 28,238 0,0020 SUM 0, ,9485 check result Patients AA ,842 0,1707 Aa ,316 0,6438 aa 49 43,842 0,6069 SUM 1, , check result p-värde >0.05 ger att fördelningen av genotyper av vår SNP är inom Hardy-Weinberg equilibrium Statistisk metodik 2 Allele Frequency rs3354 count CT total frequency C Kontroller CC 182 CT 129 TT ,7% Fall CC 161 CT 155 TT ,3% 11

12 Statistisk metodik 3 homogenitetstest med chi två fördelningen Kontroller Fall Observed Exp Observed Exp Total rad C , , T , , Total Kolumn ChiTvåvärde 3,18 1,44 2,96 1,34 ChiTvåvärde 891 8,91 Kritiskt värde 3,841 p value (1 tailed) 0,0028 check result P-värde <0.05, alltså är fördelningen av allelerna är signifikant skilda i fall och kontroller. Högre frekvens av T allel i patientgruppen ger att: T allelen ökar risken för venös blodpropp. Vilka andra SNPs finns i tissue factor genen? rs rs rs Exon 3 rs rs Exon 1 Exon 2 rs Primary Transcript rs Exon 4 rs Exon 5 rs Exon 6 rs rs rs F3 Gene 12

13 Samvariation mellan SNPs ( D -måttet R 2 -måttet bäst 1 sämst 0 NCBI dbsnp refsnp ID: rs3354 Organism: human (Homo sapiens) Molecule Type: Genomic Created/Updated in build: 36/127 Map to Genome Build: 36.2 Allele SNP: Variation Class: single nucleotide polymorphism p Alleles: C/T Ancestral Allele: C GeneView via analysis of contig annotation: F3 coagulation factor III (thromboplastin, tissue factor) Click to see [all] [csnp] [has frequency] [double hit] [haplotype tagged] variations associated with this gene..gttaaaaatt AAAACTTGGA ATTGGTTGTA GTACCATT C/T GTTACATTTC AAAGTGACTA ATGCTGATGT CAAAACCAGA. 13

14 Allel och genotypfrekvenser Individual Chrom. ss# Population Source C/C C/T T/T HWP C T Sample Group Cnt. ss CEPH 184AF HapMap CEU European 120IG HapMap HCB Asian 90IG HapMap JPT Asian 88IG Sub Saharan HapMap YRI African 120IG CHMJ Asian 74IG Prediktion av vilka SNPs som kan påverka funktion PolyPhen Predikterar hur en aminosyraförändring påverkar proteinets hydrofobicitet, isolelektriska punkt och struktur Ensembl Sammanfogar information från ett hundratal databaser för regioner i genomet Fylogenetisk footprinting (ECR browser) undersöker om SNPn ligger i en region som är evolutionärt konserverad genom att jämföra ortologa sekvenser i andra arter Transfac undersöker vilka transkriptionsfaktorer som potentiellt kan binda i regionen där SNPn är positionerad ESEfinder söker potentiella splice sites 14

15 Splice sites The first 400 basepairs in the tissue factor promoter and potential transcription factor binding sites 15

16 Studiedesign för uppföljande studier Fall kontroll (enklast) Populationsbaserad prospektiv studie Prospektiv patientstudie Friska frivilliga för en kvantitativ fenotyp som är relaterad till sjukdomen exempelvis koncentration av tissue factor protein i blodet Gamla metoder RFLP Allelspecifik amplifiering Sangersekvensering Urval av genotypningsmetoder Moderna metoder för uppföljande studier Realtids PCR (Taqman och Lightcycler) ASO (allele specifik oligonukleotid) hybridisering OLA (oligonukleotid ligering) Single base extension techniques (Illumina+Affymetrix) Pyrosekvensering Massive parallell sequencing (Solexa, 454 sequencing) 16

17 RFLP Elektroforesbaserad detektion 17

18 Allelspecifik amplifiering Taqman probe 18

19 Realtids PCR Alleldiskriminering med realtids PCR CC CT TT 19

20 Protein Molekylärgenetisk funktionalitet mängd aktivitet aminosyrasekvens och struktur post translationella förändringar (tex fosforylering) interaktion med andra protein timing Exempel: Variationer IRF 5 genen 20

21 Detektion av mrna förändringar Studier i rätt typ av cell under förhållanden som efterliknar sjukdomen Long range PCR och elektrofores kan detektera förekomsten av flera transkript (splice varianter) Realtids PCR kan detektera hur mycket mrna som finns i ett prov Odling av celler, stopp av nysyntes av med Actinomycin D, detektion med realtids PCR (halveringstid för mrna) Jämföra exonsekvens i DNA med mrna sekvens för allelisk obalans Kloning av luciferas reporter gene i en gens promotor kan visa skillnader i transkriptionseffektivitet för ena eller andra allelen 21

22 Allelspecifikt mrna uttryck G/C Regulatory region C/A Coding region Obalans av alleluttryck i mrna G C mrna C A mrna Kaijzel et al Genes Immunity 2001;2: Kureeman et al Hum Mol Genetics 2004;13: Tillämpningar genetik Identifiering av biologiska signalvägar och mekanismer Identifiering avhelt nya läkemedel Farmakogenetik(effektivitet och biverkningar) Tidiga preventiva åtgärder för bärare av riskvarianter Genterapi 22

23 VISION OM GENETISKA TEST Sjukdomsrisk Träningsråd Kostråd Läkemedel GENETISKT TEST FÖR INVÄNDNINGAR Att tidigt kunna förutsäga sjukdomsrisk Kost och livsstil Lägga upp träning Effektivitet och biverkningsrisk av läkemedel Hjälp att ta emot informationen behövs! Effektiva sätt att förhindra att sjukdomen bryter ut måste hittas! Kliniska prövningar om kostrekommendationerna på genetisk basis är effektivt behövs. Mer kunskap behövs. Kan användas begränsat idag för tex VKORC1 genen. Många studier görs i skrivande stund. 23