Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit

Transkript

1 1 Tillverkare Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit A SURVEYOR Scan KRAS och NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD med DHPLC-system Läs dessa anvisningar noga innan du använder produkten. Spara denna bruksanvisning för framtida bruk.

2 Denna sida har avsiktligt lämnats tom

3 Innehållsförteckning 1 Tillverkare CRC RAScan Combination Kit Avsedd användning Indikationer Principer för CRC RAScan KRAS och NRAS mutationsdetektionsanalys KRAS och NRAS Analys av patientprover med SURVEYOR Scan Kit SURVEYOR Nuclease Härledning av kittets kontrollsubstanser Komponenter Låda med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h ) Låda med SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h ) Antal prover som kan testas med ett kit DNA sekvensering Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser Reagensberedning Förvaring och hållbarhet Varningar och försiktighetsåtgärder Förberedande provinsamling, hantering och förvaring Analysprocess Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan kit En översikt Stegvisa anvisningar INLEDANDE installation/kalibrering av DHPLC Att tänka på före KRAS och NRAS provanalys Att tänka på avseende templat Att tänka på avseende arbetsflödet Amplifieringsprotokoll Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll Kvalitetskontroll av PCR produkter SURVEYOR Nuclease nedbrytning Kontrollparametrar Kvalitetskontroll av CRC RAScan Combination Kit Användning av kontrollplasmid DNA Tolkning av resultat Analys av KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 med SURVEYOR Nuclease Granskning av SURVEYOR Scan resultat Exempel på resultat Prestationsegenskaper LOD för mutationer med SURVEYOR Scan kit Sekvensbekräftelse Analysprocessens begränsningar Bilaga A A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan kit A.2 Kontrollernas DNA stämplar A.3 Systemkrav för denaturering med HPLC (DHPLC) A.4 Laboratorieinstallation för PCR analyser A.5 Litteraturlista Bilaga B Felsökningsguide Beställningsinformation Kontaktuppgifter Översättning Ansvarsfriskrivning Varumärken & upphovsrätt... 44

4 1 Tillverkare 1 Tillverkare Tillverkare EGrepresentant M P Transgenomic, Inc Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel CRC RAScan Combination Kit 2.1 Avsedd användning Endast för professionellt bruk. Transgenomics CRC RAScan Combination Kit är en in vitro diagnostisk analys som upptäcker somatiska mutationer i Exon 2, 3 och 4 i KRAS- och NRASgenerna. Dessa mutationer påvisas av SURVEYOR Nuclease-klyvningstoppar och inkluderar de mutationer som har känd potential för klinisk signifikans. Detta kit är utformat för användning i ett kliniskt diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. Detta kit har referensen katalognummer Denna bruksanvisning kan hämtas på Indikationer Kliniker kan använda CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system för att underlätta fastställande om patienters kolorektala cancer kanske inte kommer att svara på behandling med EGFR-hämmare (epidermal growth factor receptor) såsom panitumumab. CRC RAScan Combination Kit får inte användas för diagnos av kolorektal cancer eller någon annan form av cancer. CRC RAScan Combination Kit är en analys som detekterar förekomsten av potentiella somatiska mutationer i Exons 2, 3 och 4 hos KRAS-genen, men som inte bekräftar mutationens sekvensidentitet. För att bestämma exakt vilken mutation som detekteras krävs ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls mned CRC RAScan Combination Kitbör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med kolorektal cancer. Det är viktigt att notera att användning av DHPLC för att identifiera prover som är positiva för en KRAS- eller NRAS-mutation med detta kit endast bör utgöra en vägledning och att alla mutationer måste bekräftas genom ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Sid. 3

5 3 Principer för CRC RAScan KRAS och NRAS mutationsdetektionsanalys 3 Principer för CRC RAScan KRAS och NRAS mutationsdetektionsanalys 3.1 KRAS och NRAS Riktade terapier för receptorn EGFR (epidermal growth factor receptor) har visat sig vara effektiva mot kolorektalcancer. Forskning har visat att cirka 40 % av alla kolorektala tumörer bär på somatiska KRAS-genmutationer och kliniska studier visade att mutationer i KRAS Exon 2 (kodon 12 och 13) förutspår bristande svar på EGFR-hämmande behandling. Nyligen genomförda undersökande studier har visat att patientpopulationen kan sållas ytterligare eftersom inte heller patienter vars mcrc-tumörer hade ytterligare en mutation i KRAS Exons 3 och 4 eller NRAS Exons 2, 3 och 4 tenderade att svara på EGFR-hämmande behandlning 1-7. Detta kit är utformat för användning vid diagnostisk analys av somatiska mutationer i KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4. CRC RAScan Combination Kit är en analys för detektion av alla sekvens- samt infogade/saknade avvikelser i Exons 2, 3 och 4 hos KRAS- och NRAS-generna. Mutationer i KRAS och NRASkodon 12, 13, 59, 61, 117 och 146 har förknippats med bristande effekt hos panitumumab. Positive Controls tillhandahålls i detta kit för mutationer i kodon 12, 61, 117 och 146. Detta kit använder Transgenomics patentskyddade SURVEYOR Nuclease-teknik och ger, i samverkan med DHPLC System teknik, en enkel och känslig detektion av potentiella mutationer. Det kan detektera en blandning av 2-5 % muterat DNA i en bakgrund av ej muterat DNA. Kontrollstudier har påvisat extremt hög överensstämmelse i väldefinierade prover med kolorektalcancer. Användning av CRC RAScan Combination Kit kommer att minska användarens sekvenseringbörda och även hjälpa till vid sekvenseringsbestämning då automatisk sekvenseringsprogramvara inte klarar att klargöra förekomst av låg mutationsnivå. På grund av att denna analys har en hög känslighet i förhållande till Sanger-sekvensering, rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A.4 Laboratorieinstallation för PCR-analyser. 3.2 Analys av patientprover med SURVEYOR Scan Kit CRC RAScan Combination Kit får endast användas i samband med det arbetsflöde som visas nedan. Arbetsflöde Patientprov Test KRAS och NRAS Exons 2, 3 & 4 Rapportera resultat Figur 1 CRC RAScan Combination Kit arbetsflöde för screening av KRAS och NRAS För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS Exons 2-4, se Bilaga A.1 Översikt av platta för CRC RAScan Combination Kit. Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Sid. 4

6 3 Principer för CRC RAScan Scan KRAS och NRAS mutationsdetektionsanalys 3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomics SURVEYOR Nuclease är en avvikelsespecifik (mismatch-specific) växtbaserad DNA-endonukleas som kan söka efter kända och okända mutationer och polymorfismer i heteroduplex DNA 8. Enzymet klyver DNA med hög precision på ställen med avvikelser i basen och andra förändringar. Denna DNA-endonukleas klipper av båda strängarna på en DNA-heteroduplex på 3 -sidan av det avvikande stället. Tillfogade/saknade och bassubstituerande avvikelser identifieras men klyvningens effektivitet varierar beroende på sekvensen på avvikelsen. Figur 2. Verkningssätt för SURVEYOR Nuclease. Endonukleasen känner igen en avvikelse och klyvs vid 3 -sidan av det avvikande stället. Detta klyver den dubbla DNA-strängen och lämnar kvar ett 3 -överhäng av ett enda baspar. SURVEYOR Nuclease har använts i många olika sammanhang för att korrekt detektera en rad mutationer och polymorfismer i gener. I synnerhet har SURVEYOR Nuclease använts för att bekräfta förekomsten av kända mutationer i ett antal gener som associeras med njurcancer, lungcancer, cancer i huvud och nacke, leukemi, endometriecancer och för att förutsäga resultatet av strålbehandling 9,10,11. CRC RAScan Combination Kit har utformats för att klyva avvikelser i KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 för efterföljande analys av DHPLC. Obs! Om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heterduplex bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Biopsiprover från tumörer kommer dock att innehålla Wild-Typeceller på grund av tumörheterogenitet och/eller kontamination av normala vävnader; notera att prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha identiska kromatogram. Obs! Endast den DNA Polymerase som tillhandahålls med detta kit får användas för analysens PCR-komponent. Obs! Följ specifika anvisningar i handboken till ditt DHPLC-system. För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet Användning av kontroll-dna-plasmider. Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) (endast Nordamerika), +1 (402) eller +44 (0) (Europa) och begära "KRAS- och NRAS-support". Alternativt kan du mejla oss på: SURVEYORscan@Transgenomic.com Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 5

7 4 Härledning av kittets kontrollsubstanser 4 Härledning av kittets kontrollsubstanser De kontrollsubstanser som tillhandahålls i detta kit är plasmida kloner av KRAS och NRAS Exon 2, 3- och 4-sekvenser. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens överensstämmelse genom jämförelse med NCBI Reference Seuquences: NG_ (KRAS) och NG_ (NRAS). Kontrollerna har en genetisk "stämpel". Se Bilaga A.2 Kontrollernas DNA-stämplar; dessa är variationer av KRAS eller NRAS Wild-Type-sekvenser i en region som inte förväntas ha mutationer och som kan användas för att felsöka provkontamination av Positive Controls. Se Bilaga B - Felsökningsguide, problem 8, för ett exempel på en SURVEYOR Scan-kurva av sådan kontamination. "KRAS Control Wild-Type" konstruerades genom syntes och kloning av KRAS Exons 2, 3 och 4 med användning av NCBI Reference Sequence NG_ "KRAS Positive Control Exon 2" konstruerades genom syntes av KRAS Exon 2 med användning av ovanstående referenssekvens, men innehållande G12D-mutationen. DNAsekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 12 med en GGT>GAT-förändring. Denna klon blandas därefter med KRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "KRAS Positive Control Exon 3" konstruerades genom syntes av KRAS Exon 3 med användning av ovanstående referens, men innehållande Q61H-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 61 med en Q61H, CAA>CACförändring. Denna klon blandas därefter med KRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "KRAS Positive Control Exon 4A" konstruerades genom syntes av KRAS Exon 4 med användning av ovanstående referens, men innehållande K117N-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 117 med en K117N, AAA>AATförändring. Denna klon blandas därefter med KRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "KRAS Positive Control Exon 4B" konstruerades genom syntes av KRAS Exon 4 med användning av ovanstående referens, men innehållande A146T-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 146 med en A146T, GCA>ACAförändring. Denna klon blandas därefter med KRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "NRAS Control Wild-Type" konstruerades genom syntes och kloning av NRAS Exons 2, 3 och 4 med användning av NCBI Reference Sequence NG_ "NRAS Positive Control Exon 2" konstruerades genom syntes av NRAS Exon 2 med användning av ovanstående referens, men innehållande G12D-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 12 med en GGT>GAT-förändring. Denna klon blandas sedan med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "NRAS Positive Control Exon 3" konstruerades genom syntes av NRAS Exon 3 med användning av ovanstående referens, men innehållande Q61K-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 61 med en Q61K, CAA>AAAförändring. Denna klon blandas sedan med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "NRAS Positive Control Exon 4" konstruerades genom syntes av NRAS Exon 4 med användning av ovanstående referens, men innehållande A146T-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 146 med en A146T, GCC>ACCförändring. Denna klon blandas sedan med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Sid. 6

8 5 komponenter 5 Komponenter CRC RAScan Combination Kit tillhandahålls i ett ytterhölje som två separata kartonger: (a) en låda med reagenser för analys av KRAS Exons 2, 3 och 4 och (b) en låda med reagenser för analys av NRAS Exons 2, 3 och 4. Tillsammans innehåller lådorna tillräckligt med reagenser frö att utföra det antal analyser som anges i avsnitt Låda med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h ) Lådan med komponenter för analys av KRAS Exons 2, 3 och 4 har två innerkartonger: (1) a SURVEYOR Digestion Components Box med 10 reagensrör och (2) en yttre PCR Components and Controls Tube-Holder som innehåller 20 reagensrör. Katalognummer Komponent Låda med SURVEYOR nedbrytningskomponenter Färg på rörets lock Volym för 130 reaktioner SURVEYOR Nuclease W Lila 3 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Svart 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 2 x 105 µl ,15 M MgCl 2 Solution Brunt 2 x 105 µl Stop Solution Rött 250 µl Låda med PCR-komponenter och kontroller DNA Polymerase Genomskinligt 2 x 100 µl x DNA Polymerase Reaction Buffer Genomskinligt 1 ml dntps (10 mm) Genomskinligt 2 x 500 µl F KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µm) Blått 125 µl R KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µm) Blått 125 µl F KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µm) Blått 90 µl R KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µm) Blått 90 µl F KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µm) Blått 90 µl R KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µm) Blått 90 µl F KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µm) Blått 90 µl R KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µm) Blått 90 µl KRAS Control Wild-Type Gult 120 µl KRAS Positive Control Exon 2 Grönt 40 µl KRAS Positive Control Exon 3 Grönt 40 µl KRAS Positive Control Exon 4A Grönt 40 µl KRAS Positive Control Exon 4B Grönt 40 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 125 µl Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 7

9 5 komponenter 5.2 Låda med SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h ) Lådan med komponenter för analys av NRAS Exons 2, 3 och 4 har två innerkartonger: (1) en SURVEYOR låda med nedbrytningskomponenter med 10 reagensrör och (2) en yttre PCRkomponenter och kontrollrörshållare som innehåller 14 reagensrör. Katalognummer Komponent Låda med SURVEYOR nedbrytningskomponenter Färg på rörets lock Volym för 100 reaktioner SURVEYOR Nuclease W Lila 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Svart 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 µl ,15 M MgCl 2 Solution Brunt 105 µl SURVEYOR Stop Solution Rött 250 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 2 x 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 2 x 125 µl Låda med PCR-komponenter och kontroller DNA Polymerase (250 U) Rött 100 µl DNA Polymerase (50 U) Rött 20 µl DNA Polymerase 10X PCR Buffer Genomskinligt 1 ml dntps (10 mm) Genomskinligt 500 µl F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Blått 90 µl R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Blått 90 µl F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) Blått 90 µl R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) Blått 90 µl F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) Blått 90 µl R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) Blått 90 µl NRAS Control Wild-Type Mix Gult 120 µl NRAS Positive Control Exon 2 Grönt 40 µl NRAS Positive Control Exon 3 Grönt 40 µl NRAS Positive Control Exon 4 Grönt 40 µl 5.3 Antal prover som kan testas med ett kit CRC RAScan Combination Kit är utformad för att räcka till analys av 230 reaktioner. Det totala antal prover som kan testas med kittet beror på den genomsnittliga satsstorleken som testas vid ett tillfälle eftersom en uppsättning kontrollreaktioner (Wild-Type Controls, Positive Controls och kontroller utan templat) måste inkluderas i varje reaktionsplatta. Tabellen nedan anger vilket antal prover som kan analyseras med ett KRAS- och NRAS-kit beroende på storleken på en genomsnittlig sats. I tabellen beaktas (a) de 21 kontrollerna (7x Wild-Type, 7x Positive Controls, 7x kontroller utan templat) som krävs för varje körning och (b) gränsen på 230 reaktioner per kit. Obs! Om flera plattor körs, måste en uppsättning med de 21 kontroller som anges ovan köras på varje platta. Därför kräver två plattor sammanlagt 42 kontrollreaktioner, 3 plattor kräver 63 kontrollreaktioner, o.s.v. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 8

10 5 komponenter Med en större provsatsstorlek ökar antalet prover som kan testas med ett kit, vilket minskar den genomsnittliga reagenskostnaden per prov. Nedanstående tabell ger en vägledning till hur många prover som kan testas med kiterna. Provsatsstorlek Antal kontrollreaktioner + antal provamplikoner Antal reaktioner som krävs per körning Totalt antal provsatskörningar per kit Totalt antal prover som testas per kit DNA-sekvensering Sekvenseringsprimers (PN F och R) tillhandahålls för användning vid DNAsekvensering av alla testade prover. De PCR-amplikoner som skapas före SURVEYOR Nucleasenedbrytning bör användas för sekvensering. 6 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser Ytterligare komponenter och utrustning som behövs för att använda CRC RAScan Combination Kit med DHPLC innefattar det följande: DHPLC-system, kolumn, buffertar, DNA-storleksmarkör - se Bilaga A.3.1 DHPLC-specifikationer för SURVEYOR Scan-användningar beträffande egenskaper för ett lämpligt DHPLC-system för användning med detta kit Vatten för molekylärbiologi 0,2 ml-pcr-rör, remsor eller platta med 96 brunnar Mikropipetter Pipettspetsar Isbad Vortexblandare Mikrocentrifug Termocykler Agarosgeler och utrustning för agarosgelelektrofores 10 % blekmedel eller liknande rengöringsmedel 7 Reagensberedning Alla reagenser som ingår i detta kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp, och/eller blandas i en vortex-blandare eller mikrocentrifug före användningen. Se mer information under Analysproceduren, nedan. Reagenser behöver kombineras för att producera Master Mixblandningar och reaktionsblandningar. En fullständig beskrivning ges under Analysprocedur nedan. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 9

11 8 Förvaring och hållbarhet 8 Förvaring och hållbarhet Detta kit skall förvaras i mellan 18 ºC och -25 C i en frys med konstant temperatur tills dess det används. Observera utgångsdatumet på varje kit du erhåller. Använd inte kittet efter passerat utgångsdatum. SURVEYOR Nuclease-blandningen som tillreds i Steg 7 av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W avaktiveras med tiden när det förekommer tillsammans med övriga komponenter i SURVEYOR Nuclease-reaktionsblandning. 9 Varningar och försiktighetsåtgärder Ingen av reagenserna i detta kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer. Transgenomics dokumentnr. MSD kan hämtas från Det finns inga ämnen i detta kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en infektionsrisk. Detta kit skall bara användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker. Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med komponenterna i detta kit. Efter användningen ska kittets komponenter kasseras som sjukvårdsavfall och enligt lokala lagar och föreskrifter. Alikvoter av reagens som pipetterats från rören i detta kit är endast avsedda för engångsbruk. Komponenterna i detta kit har validerats som fortfarande stabila efter 25 upptiningscykler. Använd inte detta kit om antalet upptiningscykler har överskridits. 10. Förberedande provinsamling, hantering och förvaring CRC RAScan Combination Kit har validerats för användning med DNA som utvunnits från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) kolorektala cancertumörprover. För optimal DNAextraktion ska vävnaden fixeras i formalin i timmar innan den bäddas in i paraffin. Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva tumörcellen en heterogen blandning av tumörceller med mutationer och tumörceller utan mutationer. Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte är jämnt fördelade i tumören, kan den analysresultaten från olika sektioner i samma tumör skilja sig åt. För att öka möjligheten att upptäcka en mutation, bör DNA från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast tumörområdet skrpas från objektglaset med en ny, steril skalpell för varje nytt objektglass. För framgångsrik användning av detta kit bör den extraherade DNA:n uppfylla kriterierna i Att tänka på avseende templat. OBS! Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys ska förvaras vid -20 ºC till -80 ºC. Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Page 10

12 11 Analysprocess 11 Analysprocess 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan-kit - En översikt Detektion och bekräftelse av mutationer med SURVEYOR Nuclease omfattar tre steg: Steg 1 - Förbered PCR-amplikoner från muterat (test) och normalt (referens) DNA, och fortsätt efter den sista PCR-amplifieringscykeln med att smälta alla dubbla strängar och därefter långsamt låta dem svalna för optimal uppkomst av hetero- och homoduplexer (heteroduplexer uppstår när en sträng i en Wild-Type-sekvens härdas med en sträng av en muterad sekvens). Steg 2 Behandla en del av den härdade heteroduplex/homoduplex -blandningen med SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease skär av båda strängarna av heteroduplex DNA så att DNA-fragment bildas. Control Wild-Type-DNA utgör, när den behandlas på liknande sätt, en bakgrundskontroll. Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten på ett DHPLC-system. Formeringen av nya kluvna produkter, till följd av förekomsten av en eller flera avvikelser, påvisas genom förekomsten av ytterligare kromatografiska toppar. Migrationstiderna för de kluvna produkterna anger storleken på fragmenten och därmed avvikelsens eller avvikelsernas placering. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 11

13 12 Stegvisa anvisningar 12 Stegvisa anvisningar 12.1 INLEDANDE installation/kalibrering av DHPLC När SURVEYOR Nuclease-plattan ställs in för analys av DHPLC, se Bilaga A.3 Systemkrav för denaturering med HPLC (DHPLC) Att tänka på före KRAS- och NRAS-provanalys Innan prover körs på ett DHPLC-system måste en lämplig DNA-storleksmarkör köras för att tillförsäkra att systemet fungerar korrekt. Laboratoriepersonal som använder instrumentet bör kontrollera DNA-storleksmarkörens kvalitet innan analysen startas Att tänka på avseende templat 1. För FFPE isolerad DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherad DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR /280 absorptionsförhållandet skall vara över1,80 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara 12,5 ng/µl. Späd ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten om så behövs Att tänka på avseende arbetsflödet Kittet är avsett att möjliggöra analys av 230 reaktioner. Mindre provsatser kan köras, men kitkontroller och en "kontroll utan templat" måste inkluderas med varje provsats. Det finns tillräckligt med kontrollsubstans i kittet för 230 reaktioner av alla provomgångar av alla olika storlekskombinationer. I allmänhet bör bearbetning av alla prov utföras från början till slut enligt beskrivningen i den här bruksanvisningen. Om bearbetningen av ett prov stoppas innan alla steg är klara, ska DNA förvaras i -20 C vid angivna punkter. Man bör dock undvika att utsätta ett fruset prov för upprepad upptining och förvaring (-18 till -25 C) av PCR-amplifierad DNA eller SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter under längre perioder (>1 vecka). Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Page 12

14 12 Stegvisa anvisningar Analys av prover bör följa nedan illustrerade arbetsflöde: Skrapa vävnad 1 DNAisolering och PCR 2 3 Gelelektrofores 5 SURVEYOR Scan Misslyckades SURVEYOR Scan Positiv Ange Robust/Svag PCR 4 SURVEYOR Nuclease och DHPLC Analysis SURVEYOR Scan Negativ 7 6 Sekvensbekräftelse NVD 8 Sekvenskvalitet Misslyckades Mutationer i KRAS eller NRAS kodoner G12, G13, A59, Q61, K117 eller A146 Sekvenskvalit et godkänd 9 NVD Figur 3: Arbetsflöde för analys med CRC RAScan Combination Kit Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Page 13

15 12 Stegvisa anvisningar Anmärkningar till figur 3 1. Isolera DNA från FFPE med vedertagen laboratorieteknik. 2. Utför PCR och kontrollera DNA-kvaliteten med gelelektrofores. 3. Registrera om PCR-bandet är robust ( 20 ng/µl) eller svagt (<20 ng/µl). Om det finns flera PCR-band ska ny genomisk DNA beredas från FFPE. 4. Gå vidare till SURVEYOR Nuclease-behandling och DHPLC systemanalys med prover som angetts som antingen robust PCR eller svag PCR efter PCR-amplifiering. Observera ett det vid en svag PCR-bestämning kan finnas otillräcklig DNA för att få meningsfulla resultat genom DHPLC, men det kan finnas tillräckligt med DNA för sekvensering. 5. Se Bilaga B Felsökningsguide för exempel på misslyckade SURVEYOR Scanresultat. Alla prover med ett misslyckat SURVEYOR Scan-resultat bör köras om antingen genom att: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomisk DNA kvar b. extrahera DNA från FFPE på nytt; detta bör vara sekundärt val eftersom det ofta inte är önskvärt att skära ytterligare ett FFPE-block. c. om en annan sektion eller block används måste hela analysen göras om eftersom avvikelser i nedbrytningen kan bero på tumörheterogenicitet. 6. Om det inte finns några synliga klyvningstoppar ska ett negativt SURVEYOR Scanresultat registreras, d.v.s. NVD = No Variant Detected (ingen avvikelse detekterad). 7. Om ett prov visar SURVEYOR Nuclease klyvningsprodukter (matchar inte relevant Wild- Type-Control) ska dessa skickas till sekvenseringsbekräftelse. 8. Om sekvensbekräftelseanalysen inte godkänns, ska man antingen: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomiskt DNA kvar b. extrahera DNA från FFPE på nytt; detta bör vara sekundärt val eftersom det ofta inte är önskvärt att skära ytterligare ett FFPE-block. 9. Om sekvensbekräftelseanalysen är godkänd bör resultaten visa antingen: a. Wild-Type-sekvens, d.v.s. ingen avvikelse detekterad (NVD -No Variant Detected); eller b. Avvikelse detekterad. Om sekvensbekräftelsen visar någon basförändring som leder till aminosyraförändring vid: i. kodon 12 eller 13 ii. kodon 59 eller 61 iii. kodon 117; eller iv. kodon 146 bedöm som positiv för KRAS- eller NRAS-mutation. Obs! Det är möjligt att ha en positiv SURVEYOR Scan-bestämning som också ger resultatet "Ingen avvikelse detekterad" vid ett sekvensbekräftelsetest. Detektionsnivån (LOD) för SURVEYOR Nuclease på ett DHPLC-system är så låg som 2% mutation i 98% Wild-Type-DNA för vissa mutationer, medan LOD för sekvensering är cirka 10-25% mutation i 90-75% Wild-Type- DNA. OBS! om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Tumörbiopsiprover kommer emellertid att innehålla Wild-Type-celler på grund av tumörheterogenitet och/eller kontaminerande normal vävnad. Obs! Prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha identitiska kromatogram. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 14

16 12 Stegvisa anvisningar Obs! Positiva SURVEYOR Scan-resultat kan bero på andra basförändringar än de som har befunnits vara KRAS- eller NRAS-aktiverande. Dessa mutationer är sällsynta och måste bekräftas av en annan metod, t.ex. DAN-sekvensering, för att fastställa om det positiva SURVEYOR Scanresultatet är en KRAS-eller NRAS-aktiverande mutation eller ej. OBS! Den formalinfixationsprocess som används vid beredning av FFPE-tumörbiopsiprover kan orsaka deaminering av cytosin. Denna deaminering omvandlar cytocin till uracil. Polymerasen kommer att "läsa" detta uracil som tymin och införliva en adenin i de kopierade strängarna. Detta kommer sedan att se ut som en mutation där den normala G nu har bytts ut mot A som orsakar en GC- till AT-mutation, vilket är en artefaktmutation på grund av fixationsprocessen och inte en äkta somatisk mutation. Detta förekommer sällan, men om de kopieras tidigt under PCR-cykeln kommer de att "se ut som" mutationer. De upprepas inte vid omanalys. Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer som skulle kunna beaktas vid beslut av patientvård är för KRAS: - Kodon 12: AGT (G12S) och GAT (G12D) - Kodon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) och GGT (G13G, en tyst mutation) - Kodon 146: GCA>ACA (A146T) Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer som skulle kunna beaktas vid beslut av patientvård är för NRAS: - Kodon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D) - Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) eller GGC (G13G, en tyst mutation) - Kodon 146: GCC>ACC (A146T) Därför rekommenderas att sådana mutationer bekräftas med duplikatanalys av samma genomiska DNA eller att alla prover omfattas av duplikatanalys från analysens början Amplifieringsprotokoll 1. Transgenomics förblandade dntp-lösningar (PN och ) tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mm total deoxynukleotid (2,5 mm av var och en av de fyra deoxynukleotiderna). 2. KRAS och NRAS Forward and Reverse PCR primers (KRAS PN F/R, F/R, F/R och F/R; NRAS PN F/R, F/R och F/R) tillhandahålls vid 10 µm. 3. Ta ut 10 µm-primrar, 10 mm dntp:er och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN ) ur frysen och tina på is. 4. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 5. Förbered Master Mix-blandningarna på is. 6. Använd nedanstående tabell som en vägledning för beredning av en Master Mix för var och en av KRAS Exon 2-, KRAS Exon 3-, KRAS Exon 4A-, KRAS Exon 4B-, NRAS Exon 2-, NRAS Exon 3- och NRAS Exon 4-reaktionerna: Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller): 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntp:er (µl) 40 Forward Primer (µl) 25 Reverse Primer (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Total volym Master Mix 48,0 Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 15

17 12 Stegvisa anvisningar **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl, öka volymen extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningen med samma mängd för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherad DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherad DNA på <5 ng/µl används. 7. Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning av ovanstående tabell. Observera att: (a) För Master Mix 1, KRAS Exon 2, krävs tre ytterligare reaktioner per provplatta: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 samt KRAS Exon 2 kontroll utan templat (NTC1). (b) För Master Mix 2, KRAS Exon 3, krävs tre ytterligare reaktioner per provplatta: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 samt KRAS Exon 3 kontroll utan templat (NTC2). (c) För Master Mix 3, KRAS Exon 4A, krävs tre ytterligare reaktioner per provplatta: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A samt KRAS Exon 4A kontroll utan templat (NTC3). (d) För Master Mix 4, KRAS Exon 4B, krävs tre ytterligare reaktioner per provplatta: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B samt KRAS Exon 4B kontroll utan templat (NTC4). (e) För Master Mix 5, NRAS Exon 2 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 och NRAS Exon 2 kontroll utan templat (NTC5). (f) För Master Mix 6, NRAS Exon 3 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 3 och NRAS Exon 3 kontroll utan templat (NTC6). (g) För Master Mix 7, NRAS Exon 4 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 4 och NRAS Exon 4 kontroll utan templat (NTC7). OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 8. Märk 0,2 ml PCR-rören eller brunnarna i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation. 9. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för preparering av Master Mix-blandning. 10. Tillsätt nödvändig volym vatten för molekylärbiologi till 2,0 ml centrifugeringsrör som är märkta Master Mix. 11. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören. 12. Tillsätt nödvändig mängd 10 mm dntp:er till Master Mix-rören. 13. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör. 14. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör. 15. Ta ut DNA Polymerase (PN ) ur frysen. 16. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 17. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 18. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. 19. Förslut Master Mix-rören. 20. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera under en kort stund i ~10 sekunder före användning. 21. Förvara på is tills det används. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 16

18 12 Stegvisa anvisningar 22. Pipettera 48,0 µl (se anmärkning ovan i steg 6) av Master Mix-blandningen i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Se till att det inte spiller eller stänker mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 23. Tillsätt 2,0 µl (se anmärkning ovan i steg 6) av varje provtemplat-dna eller vatten (NTC - no template control) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontamineriong av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med med prov- DNA och NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 24. Endast därefter ska kittets kontrolltemplat-dna (PNs , , , , , , , & ) öppnas ett i taget. Pipettera 2,0 µl av var och en av kontrolltemplaten sist för att minska risken för att något prov-dna kontamineras. När pipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat (NTC) i brunnar som inte ligger intill Positive Controls eller prover. OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS Exons 2-4, se Bilaga A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan-kit. 25. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 26. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar samlas i botten av brunnarna eller rören. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa centrifugeringen i annat fall Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll 1. Använd följande termocykelprotokoll för PCR-amplifiering och heteroduplexformering: 15 cykler 30 cykler Inledande denaturering 95 C 5 minuter Touchdown-amplifiering 95 C 30 sekunder 62 C, -0,5 ºC/cykel 30 sekunder 72 C 25 sekunder Amplifiering 95 C 30 sekunder 55 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Slutgiltig förlängning 1 cykel 72 C 2 minuter Heteroduplex formering 95 ºC 2 minuter 12 C Paus 12.7 Kvalitetskontroll av PCR-produkter 1. Kvaliteten och kvantiteten på amplikoner bör kontrolleras med gelelektrofores (eller motsvarande) innan du fortsätter med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning. 2. Analysera en alikvot av PCR-produkt tillsammans med flera olika mängder av en 100-bp DNA-stege. 3. Använd stegen till att beräkna koncentrationen av amplifierad DNA. 4. Bara ett enda band >20 ng/µl som motsvarar huvud-pcr-produkten ska synas. 5. Om det finns flera band, se till att kvaliteten på tillsatt DNA-templat var tillräckligt god (se Bilaga B Felsökningsguide). Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 17

19 12 Stegvisa anvisningar 6. Om ingen produkt kan iakttas, se till att kvaliteten på tillförd DNA-templat var tillräckligt god (se Bilaga B Felsökningsguide). Om kvaliteten motsvarar specifikationerna, ska du öka volymen på templatet till 4,0 µl per 50 µl reaktion (minska vattenmängden per reaktion till 31,0 µl). 7. Inga PCR-produkter ska synas i kontrollprovet utan templat. Om DNA-produkt kan iakttas är kontrollen troligen kontaminerad, se Bilaga B Felsökningsguide. 8. Ange PCR som robust eller svag PCR. a. Robust PCR ska ha ett enda band med minst 20 ng/µl. b. Svag PCR ska ha ett enda band med mindre än 20 ng/µl. c. Fortsätt med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning vid såväl robusta som svaga PCR-bedömningar. TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka SURVEYOR Nuclease-nedbrytning 1. När prov-pcr har bedömts vara av tillräckligt hög kvalitet och kvantitet, ska nedbrytning med SURVEYOR Nuclease utföras enligt beskrivningen nedan. En provkoncentration om minst 40 ng/ul krävs för optimal nedbrytning med SURVEYOR Nuclease 2. Tina rören med 0,15 M MgCl 2 Solution och SURVEYOR Enhancer Cofactor på is. 3. Tillsätt 10,0 µl av varje PCR-amplifierat prov till ett nytt 0,2 ml PCR-rör eller brunn på en platta med 96 brunnar. 4. Bered en ny blandning 0,15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nucleaseblandning). Använd följande tabell som en vägledning för beredning av Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning för analys av flera prover. Nedanstående exempel har volymer för en Master Mix för 10 prover. Tänk på att en Master Mix-volym som är något större än denna beräkning krävs för att ge utrymme för svinn vid pipettering. Antal SURVEYOR Nuclease-nedbrytningsreaktioner: 10 Volymberäkning: 0,15 M MgCl 2 Solution (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10,0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20,0 Total volym Master Mix: 50,0 Tillsätt 5 µl SURVEYOR Nuclease Master Mix till varje PCR-amplifierat prov (µl) 10,0 Total volym SURVEYOR Nucleasenedbrytningsreaktion: 15,0 a. Centrifugera alla reagenser före användning. b. Vortexblanda varje reagens försiktigt före pipettering; centrifugera under en kort stund i ~10 sekunder efter varje vortexmoment. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 18

20 12 Stegvisa anvisningar c. För varje nedbrytning, tillför följande komponenter till ett 0,2 ml PCR (eller större) mikrocentrifugeringsrör. 1,0 µl 0,15 M MgCl 2 Solution (PN ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN ) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN ) Eller tillsätt 5 µl Master Mix som beretts enligt ovanstående tabell. 5. Vortexblanda försiktigt Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i 10 sekunder på låg hastighet. 6. Centrifugera Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i 10 sekunder på låg hastighet. 7. Placera Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på is tills den är redo att användas. Obs! Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning som beretts i steg 7 ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W blir inaktivt över tid vid förekomst av de övriga komponenterna i Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning. 8. Pipettera 5,0 µl-alikvot av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i varje rör eller brunn med 10,0 µl alikvot av amplifierad PCR-produkt (se steg 3 ovan). 9. När pipetteringen är klar, centrifugera 0,2 ml PCR-rör eller plattan med 96 brunnar i 10 sekunder. 10. Vortexblanda försiktigt 0,2 ml PCR-rör eller plattan med 96 brunnar i 10 sekunder. 11. Centrifugera i 10 sekunder med låg hastighet (detta moment är extra viktigt om nedbrytningen sker i ett instrument som saknar uppvärmt lock). 12. Inkubera vid 42 C i 30 minuter. 13. Tillsätt 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (PN ) i varje rör eller brunn och vortexblanda försiktigt (total SURVEYOR Nuclease-reaktionsvolym är 16,0 µl). TIPS: SURVEYOR nedbrytningsprodukter kan lagras vid -20 ºC i upp till en vecka. 14. Ladda provnedbrytningarna i ett DHPLC-system. Obs! För föreslagna gradientinställningar för DHPLC-systemet för analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar, besök Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 19

21 13 Kontrollparametrar 13 Kontrollparametrar 13.1 Kvalitetskontroll av CRC RAScan Combination Kit Kontroll-DNA-plasmider ingår i detta kit för att tillhandahålla kvalitetskontroller vid specifika steg i analysprocessen. För amplifieringsprotokollet, erbjuder dessa kontroller ett sätt att säkerställa att Master Mix-blandningarna är korrekt preparerade och att amplifieringen fungerar korrekt. Kontrollsubstanser utan templat (där vatten tillförs istället för DNA-templat) krävs också för att kontrollera förekomsten av eventuell kontamination av kitkomponenter från ett ovidkommande DNA-templat. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa kontroll- DNA-plasmider en effektiv kontroll av klyvningsreaktionsförhållanden (beredning av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning och inkubationsförhållanden) har varit tillfredsställande. I analysstadiet ger DHPLC System kromatogram av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner en vägledning huruvida klyvningsprodukttopparna motsvarande den mutationen i KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 kommer att elueras även vid låga nivåer (se figurer 4-10). Klyvningsprodukttoppar som motsvarar andra mutationer i KRAS eller NRAS Exons 2, 3 och 4 kan elueras i något avvikande positioner. Om PCR-amplikonerna inte motsvarar resultaten som beskrivs i Kvalitetskontroll av PCRprodukter, se Bilaga B - Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan du går vidare med ytterligare provanalyssteg Användning av kontrollplasmid-dna Detta kit är utrustat med nio kontroll-dna: KRAS Control Wild-Type; PN KRAS Positive Control Exon 2; PN KRAS Positive Control Exon 3; PN KRAS Positive Control Exon 4A; PN KRAS Positive Control Exon 4B; PN NRAS Control Wild-Type; PN NRAS Positive Control Exon 2; PN NRAS Positive Control Exon 3; PN NRAS Positive Control Exon 4; PN Dessa kontroll-dna är plasmider med tillägg. Den Positive Controls innehåller två plasmider: en blandning av KRAS eller NRAS Control Wild-Type och en mutationsklon som skiljer sig från Wild- Type vid ett enstaka baspar. Kontrollerna tillhandahålls i separata flaskor, var och en med en koncentration på 10 5 kopior/µl. KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 Forward och Reverse PCR-primrar som krävs för PCRamplifiering tillhandahålls separat i kitten. Följ instruktionerna som står i Amplifieringsprotokollet, SURVEYOR Nuclease-nedbrytning och Analys av KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 med SURVEYOR Nuclease för användning av dessa kontroller. VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSERNA INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Page 20

22 14 Tolkning av resultat 14 Tolkning av resultat 14.1 Analys av KRAS och NRAS Exons 2, 3 och 4 med SURVEYOR Nuclease För jämförelse och kontroll ska man ALLTID utföra SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på var och en av kontrollerna (Wild-Type och Positive Controls), en kontroll utan templat (NTC), samt prov- DNA som ska köras med samma provplatta i samma DHPLC-system. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa kontrollplasmid-dna en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av SURVEYOR Nuclease-blandning och inkuberingsförhållanden) var tillfredsställande. I analysstadiet ger DHPLC-systemets kromatogram av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner en vägledning om var DNA-fragmenten efter klyvningen vid dessa specifika mutationers avvikelseställe kommer att elueras, även vid låga nivåer (se figurerna 4-10). Om antingen PCR-amplikonerna eller SURVEYOR Nuclease-klyvningsfragment som härletts av kontroll-dna inte motsvarar beskrivna resultat, se Bilaga B -Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan nästa steg i provanalysen tas. Nedanstående exempel är endast i illustrationssyfte och ska INTE användas för att fastställa identiteten hos någon viss mutation. Bekräftelse av identiteten hos en mutation krävs för att oåterkalleligt fastställa förekomsten av en specifik basförändring i Exons 2, 3 eller 4 i KRAS- eller NRAS-generna. SURVEYOR Nuclease klyver vid alla avvikelser som uppstår till följd av heteroduplex formering mellan Wild-Type och muterat DNA, inte bara mutationer i Exons 2, 3 eller 4. SURVEYOR Nuclease bekräftar att en avvikelse förekommer. Mutationens specifika basförändringsidentitet krävs för bestämning av KRAS- och NRAS-aktiverande status och den måste bekräftas med en annan metod, t.ex. sekvensering Granskning av SURVEYOR Scan-resultat Inspektera kromatogrammen och jämför de för Wild-Type och Positive Controls med provets. Fastställ om provets kromatogram liknar Wild-Type-mönstret eller ej. Om det är annorlunda bör provet betraktas som "SURVEYOR Scan-positivt" och skickas till DNA-sekvensanalys. Exempel på sådana prov finns i figurer 4-10 och Bilaga B Felsökningsguide, problem 7 och 8. Ett prov med SURVEYOR Nuclease-mönster som skiljer sig från mönstret för Wild-Type bör skickas för sekvensbekräftelse även om det inte är identiskt med den Positive Controls. Ett exempel på ett sådant prov finns i Bilaga B Felsökningsguide, problem 7. Zooma vid behov in på området av intresse och lägg provets kromatogram ovanpå Wild-Type Control för den amplikonen. Notera skillnader mellan Wild-Type Control och det analyserade provet. Viktigt! Efter en grundlig genomgång av varje prov bör datagranskaren undersöka om intilliggande prover i analysplattan har identiska positiva SURVEYOR Scan-resultat. Om identiska positiva resultat förekommer kan de bero på korskontamination av prov eller kontroll och analysen måste upprepas. Bruksanvisning för CRC RAScan Kit med DHPLC-system Page 21

23 14 Tolkning av resultat 14.3 Exempel på resultat Exempel på resultat som erhållits med CRC RAScan Combination Kit med ett DHPLC-system visas i figurerna 4-10 nedan. I dessa exempel har den metod som beskrivs i Stegvisa anvisningar med användning av WAVE 4500HT-HS System med såväl UV- som fluorescensdetektorer, följts exakt. För föreslagna gradientinställningar för DHPLC-system för analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar, besök Figur 4A DHPLC-genomflöde G12D ger 74- och 116-bpfragment KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Okluven Prov 1, KRAS Exon bp Prov 2, KRAS Exon 2 amplikon Prov 3, KRAS Exon 2 DNA-storleksmarkör Okluven 190-bp amplikon DHPLCavrinning Figur 4B G12D ger 74- och 116-bpfragment KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 Okluven Prov 1, KRAS Exon bp Prov 2, KRAS Exon 2 amplikon Prov 3, KRAS Exon 2 DNA-storleksmarkör Okluven 190-bp amplikon Figurerna 4A och 4B: WAVE DHPLC-analys med UV-detektion (figur 4A) och fluorescensdetektion (figur 4B) av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning av KRAS Positive Control Exon 2 och KRAS Control Wild-Type samt CRC DNA som isolerats från FFPEsektioner. Vid visuell granskning av kromatogrammen ska de nedbrutna proverna jämföras med Wild-Type Control (brun linje). KRAS Positive Control Exon 2 (blå linje) är en blandning av Wild- Type och muterade G12D-plasmider som ger nedbrytningstoppar på 74 och 116 bp; denna kontroll visar att nedbrytningsmomentet i SURVEYOR Nuclease fungerar och visar det område i kromatografen som bör undersökas visuellt för att fastställa om ett prov ska skickas för DNAsekvensanalys. När nedbrytningsmönster jämförs för proverna 1-3 med Wild-Type ej nedbrutet kromatogram är det uppenbart att proverna 1 och 2 (röda och turkosa linjer) har sannolika mutationer och bör sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av en mutation i relevant kodon. Prov 3 (grön linje) har liknande kromatogram som de som observeras för Wild-Type Control och behöver inte skickas för DNA-sekvensanalys. Observera att sekvenseringsresultatet är det definitiva resultatet eftersom det kan finnas andra ej relevanta mutationer som kan ge samma fregmentstorlekar. Bruksanvisning för CRC RAScan Combination Kit med DHPLC-system Sid. 22