för användning med instrumentet LightCycler 2.0

LightCycler SeptiFast meca Test MG FÖR ANVÄNDNING MED: för användning med instrumentet LightCycler 2.0 (serienummer 1415001 och senare) För in vitro-diagnostisk användning. LightCycler SeptiFast meca Kit MG 2 x 15 Tests REF : 04 488 814 001 LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set v2.0 REF : 05 164 443 001 AVSEDD ANVÄNDNING LightCycler SeptiFast meca Test MG är ett in vitro-test för nukleinsyreamplifiering för detektion och identifiering av meca DNA i humant K-EDTAblod med hjälp av instrumentet LightCycler 2.0. Det används som en hjälp vid detektion av meticillinresistenta Staphylococcus aureus-stammar. Testet används i kombination med klinisk bedömning, fastställda mikrobiologiska analyser och/eller andra laboratoriemarkörer som ett hjälpmedel vid hantering av patienter med misstänkt MRSA-infektion i blodomloppet. Testet används för patienter som har befunnits positiva med LightCycler SeptiFast Test MG för Staphylococcus aureus. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Staphylococcus aureus är en av de vanligaste isolerade patogenerna vid infektioner i blodomloppet (1). Risken för meticillinresistenta nosokomiala stammar har ökat stadigt i många regioner (2) och nya samhällsförvärvade stammar (3) utgör ett växande hot. Meticillinresistens är förknippat med en betydligt högre dödlighet än bakteriemi med meticillinsensitiv Staphylococcus aureus (4,5) (MSSA). Meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) har ansetts medverka överproportionellt till olämplig empirisk behandling, t.ex.inom intensivvårdsenheter (6,7) och för att orsaka betydande tilläggskostnader (8). Förbättrat beslutsfattande i fråga om tidigt val av antibiotika är avgörande (9). LightCycler SeptiFast meca Test MG har ytterligare ett verktyg för att underlätta beslutsfattande i fråga om val av antibiotika. LightCycler SeptiFast meca Test MG kan underlätta tidig diagnos och rätt antibiotikabehandling. Den här nukleinsyrebaserade metoden detekterar meca-genen, som åstadkommer en hög nivå av meticillinresistens. ANVÄNDNINGSPRINCIPER Testet används för att detektera meca-dna hos patienter som har befunnits positiva med LightCycler SeptiFast Test MG för Staphylococcus aureus. Extraktion beskrivs i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. För LightCycler SeptiFast meca Test MG används en portion av elutatet från LightCycler SeptiFast Test MG. Arbetsgången med LightCycler SeptiFast Test MG omfattar extraktion med mekanisk lysering och rening av DNA. Därefter amplifieras target DNA genom realtids-pcr i 3 parallellreaktioner (grampositiva bakterier, gramnegativa bakterier och svamp) och detekteras via särskilda H- prober. Identifikation av arter och kontroler utförs automatiskt av programmet. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG (P/N: 04 469 046 001). Val av target En 314 bp-sekvens i meca-genen (10) har valts ut som målregion för amplifiering, detektion och identifiering. Genprodukten för meca-genen är PBP2a (eller PBP2')-proteinet, som är ytterligare ett penicillinbindande protein som påvisats i humana och icke humana resistenta Staphylococcusstammar, dvs. S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. cohnii or S. sciuri. Genen meca åstadkommer en hög nivå av meticillinresistens i mecautpressande stammar. Generna meca från olika Staphylococcus-arter är mycket välkonserverade. Därför kan meca-gener från olika arter inte särskiljas från varandra genom sekvens. PCR-amplifiering och detektion i realtid Amplifiering Innan PCR-amplifieringen minskas risken för ampliconsmitta genom att du använder AmpErase (uracil-n-glykosylas)-enzym. Det identifierar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. De extraherade proverna tillsätts i amplifieringsblandningen som innehåller hot-start Taq-polymeras i de LightCycler -kapillärer (100 µl) MG där PCR-amplifiering sker. Target och reagenskontroll (RC) amplifieras med specifika primers. Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet. 04802934001-05SV 1 Doc Rev. 5.0

Realtidsdetektion av PCR-produkter via H-prober Amplicon identifieras via fluorescens med hjälp av ett par särskilda H-prober. De här fluorescensmärkta H-proberna hybridiseras till en intern sekvens av det amplifierade fragmentet under bindningsfasen för amplifieringscykeln. Den utsända fluorescensen mäts av instrumentet LightCycler 2.0 i en av de fyra olika detektionskanalerna. Efter att amplifieringen har avslutats utförs en smältkursanalys. Smälttemperaturen T M beror på längd, sekvens och grad av homologi mellan proben och target DNA. Automatiserad identifiering av meca och kontroller Smälttemperaturerna (T M ) för prover och kontroller analyseras via ett tilldelat identifieringsprogram (SeptiFast Identification Software v2.0) och en rapport skapas. REAGENS LightCycler SeptiFast meca Kit MG P/N: 04 488 814 001 2 x 15 Tests [1a] RM 1a (reaktionsmix 1a) 2 x 58 µl 5,5 U/µl FastStart Taq polymeras [1b] RM 1b (reaktionsmix 1b) 2 x 164 µl Tris-HCl-buffert < 1 % Brij < 0,1 % magnesiumlösning < 0,001 % dntp [2] DM (detektionsmix) < 0,001 % primer, prober Tris-HCl buffert < 1 % Brij [3] RC (reagenskontroll) <0,001 % DNA kontrolltemplat Tris-HCl buffert < 0,001 % bärare av RNA [4] IC (internkontroll) < 0,001 % DNA i processkontroll < 0,001 % bärare av RNA Tris-HCl buffert [5] DE (dekontaminationsenzym) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) Tris-HCl buffert [6] BU (buffert) < 0,5 % magnesiumlösning [7] DI (spädningsmedel) Vatten, PCR-grad 2 x 193 µl 2 x 275 µl 2 x 39 µl 2 x 20 µl 2 x 1000 µl 2 x 1000 µl 04802934001-05SV 2 Doc Rev. 5.0

VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER Säkerhetssymbol och varning H225: Mycket brandfarlig vätska och ånga. H302 + H332: Skadligt vid förtäring eller vid inandning. H315: Irriterar huden. H317: Kan orsaka allergisk hudreaktion. H318: Orsakar allvarliga ögonskador. H334: Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. H412: Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. EUH032: Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. P210: Får inte utsättas för värme, heta ytor, gnistor, öppen låga eller andra antändningskällor. Rökning förbjuden. P261: Undvik att inandas damm/rök/gaser/dimma/ångor/sprej. P284: Använd andningsskydd. P305 + P351 + P338 + P310: VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. P342 + P311: Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRALEN/läkare. P362 + P364: Ta av nedstänkta kläder och tvätta dem innan de används igen. P370 + P378: Vid brand: Släck branden med torr sand, torra kemikalier eller alkoholresistent skum. Allmänna varningar och säkerhetsåtgärder För in vitro-diagnostisk användning. Detta test är endast avsett att användas med humant blod som samlats i K-EDTA. Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd puderfria engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagens. Blanda inte reagens från olika loter. Blanda inte reagens från olika kit. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Använd inte kit efter utgångsdatum. Säkerhetsdatablad (SDS) erhålls på begäran från närmaste Roche-representant. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner, som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (11) och i CLSI-dokument M29-A (12). Rengör och desinficera alla arbetsytor och handskar noggrant med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ). Försäkra dig om att handskarna är resistenta mot DNA dekontaminationsreagens. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa reagens kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. I annat fall kan frätskador uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbeten inbegriper reagensberedning och provberedning. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas för vid hantering av prov eller kontroll eller för pipettering eller bearbetning av amplifierad DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i post-amplifieringsområdet. Förekomsten av AmpErase-enzym i Master Mix minskar risken för amplicon-smitta. Smitta från positiva kontroller och positiva prover kan dock endast undvikas om god laboratoriesed iakttas och de förfaranden som beskrivs i denna bipacksedel noga följs. 04802934001-05SV 3 Doc Rev. 5.0

Särskilda varningar och säkerhetsåtgärder för användning av LightCycler SeptiFast meca Test MG DNA från bakterier förekommer i miljön. För att undvika falskt positiva resultat genom detektion av sådan miljömässig DNA (DNA-smitta) är det nödvändigt att skapa en arbetsgång som är fri från kontaminerande DNA. Det är i synnerhet användaren som kan vara källan till DNA-smitta, eftersom den mänskliga huden och de övre luftvägarna innehåller mikroorganismer som kan innehålla target-genen i LightCycler SeptiFast meca Test MG [t.ex. meticillinresistent Staphylococcus aureus eller meticillinresistent koagulasnegativ Staphylococci]. Följande principer är rekommendationer som syftar till att undvika DNA-smitta. Reagens och förbrukningsmaterial för LightCycler SeptiFast meca Kit MG Reagenser och engångmaterial för LightCycler SeptiFast meca Kit MG har utvecklats för att minimera bakteriell DNA-smitta. MG-produkter är utformade för högsensitiv bakteriell och fungal nukleinsyredetektion. Patentskyddade tillverkningsprocesser utvecklades för att eliminera DNA-smitta som kan interferera med sådana analyser. Undvik onödigt öppnande och stängande av reagensflaskor. Kläder och handskar Använd puderfria handskar under hela arbetsgången. Undvik att exponera huden använd handskar som går utanpå laboratorierockens ärmar. Byt handskar omedelbart vid kontaminering eller behandling med DNA-kontaminerande reagens (t.ex. LTK-008 ; handskarna måste vara resistenta mot reagenset). Rör inte handflate- och fingerytan på hanskarna när du tar på dem. Skötsel av PCR-arbetsstation Rengör arbetsytorna på PCR-arbetsstationen med DNA kontaminationsreagens efter varje PCR-beredning. OBS! Försäkra dig om att utrustningen är resistent mot DNA dekontaminationsreagens. Rengör alla ytor inuti PCR-arbetsstationen regelbundet (väggar, utrymmen under bottenplattan, golvplattan). Se till att PCR-arbetsstationen är DNA-fri om den används av flera användare. Slå på UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. OBS! Byt UV-lampa på PCR-arbetsstationen enligt tillverkarens anvisningar. Behandling av enheter och förbrukningsvaror Lämna, om möjligt, särskilda förbrukningsvaror och enheter som använts för LightCycler SeptiFast meca Test MG i PCR-arbetsstationen. Bestråla alla objekt med UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Använd endast DNA-fritt förbrukningsmaterial (se bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG). Använd dem endast en gång. Använd capping tool för att stänga kapillärer (se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 för hanteringsanvisningar) Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 (kapitlet Underhåll ) om kapillärer går sönder. Säkerhetsåtgärder vid pipettering Öppna reagensflaskorna, pipettera spetsfacken och kapillärfacken under det laminära flödet. Använd inte samma pipettspetsar och kapillärer utanför det laminära flödet. Rör inte kanten eller gängorna på en öppen flaska. Rör vid flaskan när du pipetterar under kanten. Rör inte kanten på en öppen kapillär. Lägg alla objekt som använts under förfarandet under det laminära flödet i logisk ordning. Vid spill ska du avsluta det pågående arbetsmomentet och omgående behandla arbetsområdet med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ) FÖRVARING OCH HANTERING Förvaras i 15 till 25 C. Förvaras mörkt. Förvara Master Mix (se avsnittet Reagensberedning för beredning av Master Mix) i 2 till 8 C i högst 72 timmar. Förvara öppnade flaskor i högst 6 månader. Använd inte efter utgångsdatum. Frys och tina öppnade flaskor högst 4 gånger. Använd inte efter utgångsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 test SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 test LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 test SeptiFast Software Set v2.0 P/N: 05 164 443 001 (medföljer en gång) LightCycler SeptiFast meca Kit MG P/N: 04 488 814 001 2 x 15 test MATERIAL SOM EJ MEDFÖLJER FÖRPACKNINGEN Se bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. Provtagning Provtagningen beskrivs i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. 04802934001-05SV 4 Doc Rev. 5.0

Transport och förvaring av prover Transport och förvaring av prover beskrivs i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. Förvaring av eluat Eluat kan förvaras upp till 4 timmar i 15 till 25 C, 8 dagar i 2 till 8 C eller i -15 till -25 ºC i upp till 30 dagar. BRUKSANVISNING Innan reagensberedning påbörjas Färgkompensation Användning av LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) är en förutsättning. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Kit (P/N: 04 469 046 001). Installation av SeptiFast Identification Software (SIS) och SeptiFast meca-makro SeptiFast Identification Software (SIS) och SeptiFast meca-makro (filnamn: SeptiFast meca_1.0_04488814001 eller senare versioner) måste installeras innan du kör testet. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. Kontrollextraktion Positiv kontrollmaterial kan köpas från andra företag. För LightCycler SeptiFast meca Test MG och LightCycler SeptiFast Test MG kan ATCC-material 33592, en meticillinresistent S. aureus, användas som positiv kontrollmaterial. Beredningen beskrivs i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG. Den positva kontrollen ska bearbetas genom hela arbetsflödet som alla andra prover. Reagensberedning med LightCycler SeptiFast meca Kit MG 1. Rengör och sanera noggrant det laminära flödesfacket och PCR-arbetsstationen (t.ex. med LTK-008 ). 2. Slå på UV-ljuset och luftströmmen för det laminära flödesfacket och UV-ljus för PCR-arbetsstationen i minst 30 minuter. 3. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. 4. Tina komponenterna för LightCycler SeptiFast meca Kit MG skyddade från ljus i rumstemperatur i cirka 20 minuter. Vortexa en kort stund och pulscentrifugera snabbt. 5. Placera LightCycler -kapillärer i förkylda centrifugadaptrar, beroende på det totala antalet prover som ska analyseras, samt ytterligare två reaktioner för den negativa kontrollen och reagenskontrollen. 6. Bered Master Mix-blandningen genom att multiplicera mängden i kolumnen Volym med antalet reaktioner som ska köras (proveluat, negativ kontrolleluat och reagenskontrolleluat) plus ytterligare en reaktion för att få tillräcklig pipetteringsvolym. Fortsätt enligt beskrivningen nedan med en 100 µl standardreaktion. Steg Åtgärd 1 Bereda Master Mix-blandningen: Tillsätt följande komponenter i ett 1,5 ml reaktionsrör i 2 till 8 C i den ordning som anges nedan: Komponent Volym (µl) DI 13,5 BU 12 DM 10 IC 2 RM 1b 8,5 DE 1 RM 1a 3 Total volym 50 2 Blanda försiktigt genom pipettering. Vortexa inte! Pipettera 50 µl Master Mix till en för-kyld LightCycler -kapillär. 3 Tillsätt 50 µl av varje proveluat till varje separat kapillär och stäng kapillären med hjälp av capping tool. Tillsätt 50 µl eluat av den negativa kontrollen (NC) till en kapillär. NC är inte en del av LightCycler SeptiFast meca Kit MG och bereds genom att behandla NC från LightCycler SeptiFast Test MG. Prover från varje extraktion och PCR-grupp måste analyseras tillsammans med den NC som beretts i samma grupp. Kombinera inte extraktioner från olika grupper i samma körning. Stäng kapillären med hjälp av capping tool. Tillsätt 50 µl reagenskontroll (RC) i varje kapillär. Stäng kapillären med hjälp av capping tool. 4 Överför alla kapillärer enligt provladdningslistan i SeptiFast meca-makrot (RC, NC, prov 1, prov 2 ) till LightCycler provkarusellen. 5 Centrifugera LightCycler provkarusellen med LC karusellcentrifug 2.0 (kontrollera vätskenivån i kapillärerna). 6 Placera LightCycler provkarusellen i instrumentet LightCycler 2.0. Laddning och drift av instrumentet LightCycler 2.0 OBS! Vi rekommenderar att du kör instrumentet LightCycler 2.0 i ett rum som är åtskilt från DNA-rening och beredning av arbetslösningar. 1. Starta makrot SeptiFast meca (filnamn: SeptiFast meca_1.0_04488814001). Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0, kapitlet Köra ett Roche-makro. OBS! Använd inte fältet <assay lot number>. Om du vill lägga till analyslotnumret till körningen ska du skriva in informationen i respektive fält i provredigeraren. OBS! Fortsätt inte körningen om användaren är utloggad. Starta en ny körning med ett nytt namn. 2. Spara körningen med ett namn som ger otvetydlig identifiering (t.ex. användarnamn och datum). 04802934001-05SV 5 Doc Rev. 5.0

3. Minska antalet prover från standardladdningslistan om färre än 5 prover krävs. Om för många kapillärer oavsiktligt raderas ska du inte lägga till dem utan starta om proceduren från början. 4. Skriv in patientspecifika data inom <parentes> (t.ex. meca <Name-01>). 5. När all provspecifik information har lagts till fortsätter du med kitguiden och startar körningen i instrumentet LightCycler 2.0. 6. När körningen är avslutad ska du kontrollera vätskenivån i kapillärerna (resultat för en kapillär är ogiltiga om volymen i kapillären är variabel). OBS! Ändra inte provnamnens prefix. Radera inte parenteserna. Varje prov måste innehålla ett analysspecifikt prefix (meca) för att ge identifiering med SIS. Byt inte namn på reagenskontroll och negativ kontroll. OBS! Vissa specialtecken som ' och < > ` och kan orsaka problem med namnkonventionen när man anger ett namn i namnfältet. Toppdetektion och automatisk toppidentifikation Allmän förklaring av analysmoduler Manuell T M -hämtning kräver manuell drift i två automatiskt tillämpade T M -hämtningsmoduler. Den absoluta kvantifikationsmodulen, som också tillämpas automatiskt, kräver inte manuell drift. T M -streckkoden för varje analys är fördefinierad i SeptiFast meca-makrot. Alla kurvor för den valda bilden visas i smälttoppens fönster. Du kan välja eller välja bort T M -streckkoder. Baseline för varje analysläge är fördefinierad i SeptiFast meca-makrot. Du får inte ändra eller välja bort baselines. Om du råkar ändra ska du skriva in det rätta värdet från tabell 2: Baseline-värden. Om fler än en kapillär aktiveras visas inställningarna för den första kapillären i kryssrutan. Byte av streckkoder påverkar alla aktiverade kapillärer. OBS! Ändra inte inställningarna för <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> och <Peak Width>. Topparna är definierade som maximalt över baseline. Shoulders är inte toppar. Markörlinjerna måste väljas i de giltiga T M -intervallen (se tabell 1). Tabell 1: T M -intervall för giltiga toppar CH 640 CH 705 Lågt T M ( C) Högt T M ( C) Lågt T M ( C) Högt T M ( C) meca 62,00 69,00 51,50 58,50 Värdena för dessa baselines är fördefinierade enligt följande tabell och får inte ändras. (Om värdena skulle råka ändras ska du skriva in dem igen enligt listan, annars kommer körningen att flaggas.) Tabell 2: Baseline-värden CH 640 CH 705 meca 0,021 0,022 Justera T M -streckkoderna 1. När körningen är avslutad visar experimentguiden fönstret <Analyses have been created>. 2. Flytta fönstret till nederst på sidan (tryck inte på <Finish>). 3. Se till att T M - och baseline-värdena är synliga. 4. Klicka på analysmodul (t.e. T M -hämtning meca 640). 5. Aktivera alla positioner i analysen för att få en översikt. 6. Klicka endast på positionen meca #RC#. 7. Justera T M -streckkoden så att toppen går över baseline, fokusera endast på det giltiga T M -intervallet. 8. Aktivera nästa position (t.ex. meca #NC#) tillsammans med meca #RC# för att få en översikt. (Automatisk värdering anpassas efter den högsta toppen.) 9. Aktivera endast den valda positionen (t.ex. meca #NC#). (Automatisk värdering anpassas efter bakgrundstoppen för NC. Baseline kanske inte längre är synlig.) 10. Fortsätt med toppdetektion för prover enligt beskrivningen i steg 5 7. 11. När du har avslutat analysen för den första detektionskanalen (T M -hämtning meca 640) fortsätter du med T M -hämtning meca 705 enligt beskrivningen i steg 4 10. Avsluta T M -hämtning 1. Flytta experimentguiden till mitten av skärmen och tryck på <Finish>. 2. LightCycler -rapporten skapas automatiskt och måste skrivas ut. 3. Körningen sparas automatiskt. 4. Exportera *.ixo-filen till <C:\Export to SIS>. 5. Kontrollera om rapporten innehåller flaggor och om <run state: complete> visas. 6. Om flaggor inträffar, eller andra meddelanden för run state visas, är körningen ogiltig och alla prover måste testas på nytt. Automatisk toppidentifiering med SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS) 1. Dubbelklicka på SIS-ikonen på skrivborden och tryck på <Start>. 2. Välj körning från mappen <C:\Export to SIS> och ladda *.ixo-filen. 3. Välj Yes eller No för att bekräfta om LightCycler -rapporten innehåller flaggan <User Developed or Modified Test Method> eller inte. 4. *.ixo-filen analyseras automatiskt och data visas i en rapport. 5. Skriv ut SIS-rapporten. 04802934001-05SV 6 Doc Rev. 5.0

RESULTAT Tolkning av resultat FLAGGOR och KOMMENTARER kan genereras med SeptiFast Identification Software v2.0 (SIS) som RUN FLAGS, ASSAY FLAGS och FLAGS i SPECIMEN-rutan (se nedan). Kontrollera om det finns FLAGS eller COMMENTS i SPECIMEN-rutan i utskriften. Figur 1: Specimen-ruta Specimen Assay Data Result Flags Comment SeptiFast meca sample 1 meca <CH..., TM..., PH..., CP...> <meca> SeptiFast meca sample 2 meca Mer information finns i COMMENT-fälten för RUN FLAGs och ASSAY FLAGs. Alla flaggor listas i tabell 3. Provresultat Namnet <meca> i RESULT-fältet indikerar att provet har befunnits positivt för meca. Obs! Kontrollera kommentarfältet i LightCycler SeptiFast Test MG om flaggan <for meca resistance testing: Peak for CoNS from SML detected> 1 visas. Mer information finns i avsnittet Testets begränsningar. Rådata för de aktuella topparna visas i fältet DATA inklusive kanalen (CH), smältpunkt (T M ), topphöjd (PH) och korsningspunkt (CP 2 ). Symbolen i RESULT-fältet betyder att ingen analyt detekterades inom de definierade kriterierna för meca. 1 SML är SeptiFast Test Master List, mer information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast Test MG 2 CP visas för Channel 640 Validering Valideringen utförs med SeptiFast Identification Software v2.0. Ogiltiga resultat visas automatiskt och markeras med. Kommentarer för flaggorna och deras korrelerande betydelser listas nedan. Tabell 3: Flaggor för validering Comments 3 Betydelse ASSAY FLAG NC: IC not detected För NC detekterades ingen meca och ingen IC. ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP >,< meca > För NC detekterades meca. ASSAY FLAG RC: No amplicon: <meca> RC misslyckades. SPECIMEN FLAG IC not detected Ingen meca och ingen IC detekterades i provet. 3 Systemfel listas i avsnittet Felsökning KVALITETSKONTROLL Ett replikat vardera av NC och RC måste finnas med i varje testkörning. NC och RC måste placeras på definierade positioner enligt beskrivningen i avsnittet Reagensberedning. Vi rekommenderar att du kör ett positivt material från Roche som positiv kontroll genom hela arbetsgången enligt beskrivningen i avsnittet Kontrollberedning. SIS fastställer resultaten för IC, NC och RC. Om kontrollerna inte når upp till de definierade specifikationerna flaggas alla provresultat. Kontrollera SPECIMEN-rutan i körningsutskriften om det finns flaggor och kommentarer så att du säkerställer att körningen är giltig. Negativ kontroll (NC) NC måste vara negativ medan dess interna kontroll måste vara positiv. Om NC inte uppfyller kriterierna flaggas alla provresultat. Hela körningen måste upprepas. Reagenskontroll (RC) RC måste vara positiv för meca amplicon. Om RC inte uppfyller det kriterieret flaggas alla provresultat. Hela körningen måste upprepas. Positiv kontroll (PC) Den positiva kontrollen måste vara positiv. Om PC inte uppfyller kriteriet är körningen ogiltig. Ingen flagga visas av SIS. Hela körningen måste upprepas. Internkontroll (IC) Internkontrollen måste detekteras positiv för alla negativa prover liksom den negativa kontrollen. Om IC inte uppfyller det kriterieret flaggas alla provresultat. Om ogilitiga kontroller uppträder ska du upprepa hela proceduren (prov- och kontrollberedning, amplifiering och detektion av alla 3 analyser med LightCycler SeptiFast Test MG och påföljande resistenstestning med LightCycler SeptiFast meca Test MG). Om kontrollerna är konsekvent ogiltiga ska du kontakta Roche för teknisk hjälp. 04802934001-05SV 7 Doc Rev. 5.0

FELSÖKNING Tabell 4: Systemfel visas som COMMENTS för RUN FLAGS och i SIS-utskriften. Systemmeddelande (visas i flaggdelarna av SIS-utskriften) Sannolik orsak Åtgärd User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Körningen är ogiltig; trolig orsak finns beskriven i användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0. Standardinställningar för makrot (t.ex. baselines, körningsprotokoll etc.) kan ändras. Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i en eller flera analysmoduler Färgkompensationsobjektet är äldre än sex månader Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 2. Spara och exportera igen. Välj rätt färgkompensation och beräkna en gång till. Skapa ett nytt färgkompensationsobjekt. Invalid Macro Felaktigt makro körs Sök efter rätt makro i programmet LightCycler och/eller SeptiFast Software Set v2.0. Invalid Baseline Baseline-värdena kan ha ändrats av misstag Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 2. Spara och exportera igen. Invalid Control Tube En eller flera kontroller har fel namn Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av kontrollnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling En eller flera provkapillärer har fel namn eller provkapillärer saknas Felaktig version av programmet LightCycler används Ingen manuell T M -hämtning har utförts (vare sig i någon prov- eller analysmodul). Makro har avslutats utan analys Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Öppna programmet LightCycler och sök efter numret på rätt version. Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och utför T M -hämtning. Spara och exportera igen. + additional run flags Fler än 5 körningsflaggor har detekterats Försök att åtgärda specifikt beskrivna flaggor och analysera om körningen med SIS. Invalid CCC File Name Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i en eller flera analysmoduler Välj rätt färgkompensationsfil och beräkna en gång till. Ett eller flera prover saknas i SIS-rapporten. Kontrollera om en eller flera provkapillärer har fel namn eller om det saknas kapillärer. För att korrigera ska du öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. TESTETS BEGRÄNSNINGAR Om S. aureus detekteras med LightCycler SeptiFast Test MG och kommentarfältet för provrutan är <for meca resistance testing: Peak for CoNS from SML detected> har en blandning av S. aureus och KNS detekterats. Detektion av meca kan bero på meca-bärande KNS-stam och inte MRSA. Även om meca-bärande KNS inte detekteras med LightCycler SeptiFast Test MGkan meca-detektion bero på närvaron av KNS under detektionsgränsen och inte MRSA. Falskt negativa resultat kan inträffa under den specificerade detektionsgränsen (se avsnittet Analytisk sensitivitet) eftersom detektion av S. aureus- DNA med LightCycler SeptiFast Test MG kan vara känsligare än detektion av meca-dna med LightCycler SeptiFast meca Kit MG. The LightCycler SeptiFast meca Kit MG detekterar meca-genen och tillåter inte en slutgiltig fenotypisk identifiering. Detta test har endast validerats för användning med humant blod som samlats i K-EDTA-antikoagulant. Testning av andra provtyper kan ge felaktiga resultat, falskt negativa eller falskt positiva. Användning av den här produkten ska begränsas till personal som utbildats speciellt för arbetsgången med LightCycler SeptiFast meca Kit MG. Egenskaperna för LightCycler SeptiFast meca Kit MG är fastställda för blod som innehåller 1.000 30.000 WBC/µl. 04802934001-05SV 8 Doc Rev. 5.0

ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING Analytisk sensitivitet Minimisensitiviteten är 30 CFU/ml K-EDTA blod. Studien som beskrivs nedan visar att detektionsgränsen för MRSA har bestämts till S. aureus med LightCycler SeptiFast Test MG och till meca med LightCycler SeptiFast meca Kit MG. Seriespädningar av en känd MRSAkoncentration (ATCC 33592) spikades i helblod från friska blodgivare och bearbetades enligt beskrivningen i bipacksedeln för respektive test. Varje nivå analyserades i åtta replikat med hjälp av två loter. Tabell 5 visar sammanställda resultat för båda loterna. Detektionsgränsen för S. aureus är 7,7 CFU/ml (95 %) CI=[4,9-19,0] och för meca 24,2 CFU/ml (95 %) CI=[15,9-48,9]. Tabell 5: Detektionsgräns MRSA-koncentration [CFU/ml] Antal meca-positiva Antal S. aureus-positiva 100 16/16 16/16 50 16/16 16/16 25 14/16 16/16 12,5 14/16 16/16 6,25 10/16 14/16 3,13 5/16 13/16 1,56 1/16 7/16 0,78 0/16 4/16 0 0/16 0/16 Analytisk specificitet Inklusivitet Inklusiviteten testades med genomiskt DNA i 167 MRSA-stammar. De testade stammarna omfattar en referensstam (ATCC 33592) och 166 kliniska isolater som tagits i Europa och USA. Isolaterna innehöll SCCmec-typer I V enligt karakterisering av Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE). SCCmec är Staphylococcal Chromosomal Cassette, ett mobilt genetiskt element som innehåller meca-genen. Ytterligare 588 kliniska MRSA-isolater utan vidare molekylär karakterisering analyserades. I 580 isolater detekterades meca. Återstående 8 isolater klassifierades som Borderline Oxacillin Resistant S. aureus (BORSA) eller Modified S. aureus (MODSA) 4 som visar en MIC under 8 µg oxacillin per ml. Exklusivitet Genomiskt DNA i följande panel med de vanligaste patogenerna som orsakar infektioner i blodomloppet (13), stammar som är nära besläktade med dessa och stammar som är fylogenetiskt nära besläktade med S. aureus testades. Alla prover befanns negativa for meca. Actinobacillus actinomycetemcomitans Cryptococcus neoformans Pantoea agglomerans Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes Peptostreptococcus magnus Aeromonas hydrophila Enterobacter cloacae Porphyromonas gingivalis Aspergillus fumigatus Enterobacter taylore Prevotella denticola Bacillus cereus Enterococcus faecalis Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis Enterococcus faecium Proteus mirabilis Bartonella henselae Escherichia coli Proteus vulgaris Bordetella pertussis Gemella haemolysans Pseudomonas aeruginosa Borrelia burgdorferi Histoplasma capsulatum Salmonella enterica Burkholderia cepaci Klebsiella oxytoca Serratia marcescens Campylobacter jejuni Klebsiella pneumoniae Shigella sonnei Candida albicans Legionella pneumophila Staphylococcus aureus Candida glabrata Listeria monocytogenes Staphylococcus epidermidis Candida krusei Moraxella (Branhamella) catarrhalis Staphylococcus haemolyticus Candida parapsilosis Morganella morganii Stenotrophomonas maltophilia Candida tropicalis Mycobacterium fortuitum Streptococcus agalactiae Cardiobacterium hominis Mycobacterium tuberculosis Streptococcus mitis Citrobacter freundii Mycobacterium xenopi Streptococcus pneumoniae Clostridium perfringens Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pyogenes Corynebacterium jeikeium Neisseria meningitidis Yersinia enterocolitica 4 BORSA är en lågnivåresistens, baserad på ökad -laktamasproduktion. MODSA har förändrade PBP-strukturer med lägre bindningsaffinitet eller hyperproduktion av PBP:er (sällsynt). Ingen av grupperna bär på meca-genen. 04802934001-05SV 9 Doc Rev. 5.0

Interfererande ämnen Följande ämnen interfererar inte med detektionen av meca-dna genom detta test. Tabell 6: Interfererande ämnen Antal Varunamn Aktiv komponent Tillverkare 1x C max 3x C max enheter 1 Piperacillin Piperacillin Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Ceftazidim GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Imipenem/Cilastatin MSD Sharp & Dohme 0,27 0,67 mg/ml 4 Tazobac Piperacillin/Tazobaktam Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Ciprofloxacin Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Vankomycin Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Gentamicin Merck 80 240 µg/ml 8 Zyvoxid Linezolid Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Klindamycin Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Metronidazol Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Flukonazol Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Caspofungin MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Amfotericin B Bristol-Myers Squibb 20 60 µg/ml 14 Novalgin Metamizol Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal Dexametason Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Cytarabin cell pharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Norepinefrin (Noradrenalin) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Glycerolnitrat Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium-5000- ratiopharm Heparin ratiopharm 0,83 2,5 I.U./ml MEDDELANDE TILL KÖPAREN Köpet av denna produkt ger köparen rätt att använda den för amplifiering och detektion av nukleinsyrasekvenser för human in vitrodiagnostik. Inget allmänt patent eller annan licens tilldelas i det här dokumentet förutom den särskilda användningsrätt som beviljas vid köpet. 04802934001-05SV 10 Doc Rev. 5.0

REFERENSER 1. Pfaller, M.A., et al. Survey of blood stream infections attributable to gram-positive cocci: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and Latin America from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. SENTRY Participants Group. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 33:283-97. 2. Diekema, D.J., et al. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997-1999, Clin Infect Dis 32 (2001) (suppl 2), S114-S132. 3. Zetola, N., et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an emerging threat. The Lancet Infectious Diseases, Volume 5, Issue 5, 275-286. 4. Cosgrove, S.E., et al. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1;36(1):53-9. Epub 2002 Dec 13. 5. Whitby, M., et al. Risk of death from methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia: a meta-analysis. Med J Aust. 2001 Sep 3;175(5):264-7. 6. Kolleff, M.H., et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest (1999); 115: 462-74. 7. Harbarth, S., et al. Inappropriate Initial Antimicrobial Therapy and Its Effect on Survival in a Clinical Trial of Immunomodulating Therapy for Severe Sepsis, Am J Med. (2003); 115: 529-35. 8. Lodise, T.P., et al. Outcomes Analysis of delayed antibiotic treatment for hospital-acquired Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis (2003); 36: 14-23. 9. Paterson, D.L., et al. Empirical antibiotic choice for the seriously ill patient: are minimization of selection of resistant organisms and maximization of individual outcome mutually exclusive? Clin Infect Dis. (2003);36(8):1006-12. 10. Ryffel, C., et al. Sequence comparison of meca genes isolated from methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Gene. 1990 Sep 28;94(1):137-8. 11. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 12. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 13. Cockerill FR 3rd, et al, Analysis of 281,797 consecutive blood cultures performed over an eight-year period: trends in microorganisms isolated and the value of anaerobic culture of blood, Clin Infect Dis. 1997; 24 (3): 403-18. 04802934001-05SV 11 Doc Rev. 5.0

Information om revidering av dokumentet Doc Rev. 5.0 Avsnittet om varumärken och patent har uppdaterats så att det endast hänvisar till information online. 06/2015 Riskvarningar har lagts till. Med ensamrätt har tagits bort från informationen om copyright. Kontakta närmaste Roche-representant vid eventuella frågor. " Distributed by Tillverkad i Tyskland Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics 9115 Hague Road Indianapolis, IN 46250-0457 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800-526-1247) Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Quèbec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877-273-3433) Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G.B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal C Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Germany Varumärken och patent Se http://www.roche-diagnostics.us/patents 2015 Roche Molecular Systems, Inc. 06/2015 04623932001-05 04802934001-05SV 12 Doc Rev. 5.0