LightCycler SeptiFast Test MG

FÖR ANVÄNDNING MED: LightCycler SeptiFast Test MG för användning med instrumentet LightCycler 2.0 (serienummer 1415001 och senare) För in vitro-diagnostisk användning. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : 04 469 046 001 SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : 04 404 432 001 SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : 04 404 459 001 SeptiFast Software Set REF : 04 705 220 001 AVSEDD ANVÄNDNING LightCycler SeptiFast Test MG är ett in vitro-test för nukleinsyreamplifiering för detektion och identifiering av bakterie- och svamp-dna från mikroorganismer som beskrivs närmare i SeptiFast Master List (SML) i humant K-EDTA-blod med hjälp av instrumentet LightCycler 2.0. Testet används i kombination med klinisk bedömning, fastställda mikrobiologiska analyser och/eller andra laboratoriemarkörer som ett hjälpmedel vid hantering av patienter med misstänkt sepsis och andra bakterie-/svampinfektioner i blodomloppet. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Sepsis är en av de främsta orsakerna till dödlighet och sjukdom på sjukhus, oftast orsakad av bakteriemi och/eller fungemi. Rätt antibiotisk behandling och snabbt påbörjad behandling är kritiska faktorer som kan minska sjukdom och dödlighet som associeras med sepsis. Andelen patienter som initialt behandlats med olämpliga antibiotiska regimer vid intensivvårdsenheter är betydande och varierar mellan 11 % och 46 % (1,2,3). På sjukhus tar det vanligen minst 48 timmar att identifiera bakterie-/svamppatogenen (patogenerna), och medicinmottagligheten som hör till, från blododlingar (1). Snabb patogendetektion genom molekylära diagnostikverktyg kan underlätta snabb diagnos av bakteriemi/fungemi och tidigare tillförsel av rätt antibiotisk behandling. Samtidigt minskar man olämplig överanvändning.av antibiotika som verkar på bred front (4,5). LightCycler SeptiFast Test MG är utformad för att detektera mikroorganismer som orsakar cirka 90 % av alla infektioner i blodomloppet (1,6). Medan mikrobiologiska metoder detekterar livsdugliga mikororganismer detekterar detta test både livsdugliga och ej livsdugliga mikororganismer samt även fritt mikrobiellt DNA. Target-arter listas i SeptiFast Master List (SML) i tabell 1. Dessa arter detekterades som positiva med hjälp av LightCycler SeptiFast Test MG vid interna studier och/eller kliniska försök. Några av dessa arter hör till dem som oftast behandlas på ett felaktigt sätt: Enterococcus spp.; E. coli; Candida spp.; Klebsiella spp (6). Dessutom är tidig identifiering viktigt för några av target-arterna i SML, eftersom de orsakar infektioner som är ytterst svåra att behandla. Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Fler än en art i ett prov kan detekteras. Följaktligen är realtids-pcr-resultat ytterligare ett verktyg för att underlätta en tidig klininsk bedömning. Tabell 1: SeptiFast Master List (SML) Gram (-) Gram (+) Svampar Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Koagulasnegativa stafylokocker (arter som representerar gruppen KNS listas i tabell 9). 2 Arter som representerar gruppen Streptococcus spp. listas i tabell 9. 3 Arter som ofta kallas A. calcoaceticus-a. baumannii (Acb-komplex) detekteras inte (8). 1

ANVÄNDNINGSPRINCIPER LightCycler SeptiFast Test MG baseras på 3 grundläggande processer: Extraktion med mekanisk lysering och rening av DNA PCR amplifiering av target DNA i realtid i 3 parallellreaktioner (grampositiva bakterier, gramnegativa bakterier och svampar) och detektering via särskilda hybridiseringsprober Automatiserad identifiering av arter och kontroller Extraktion Den mekaniska lyseringen av proverna utförs med hjälp av SeptiFast Lys Kit MG och instrumentet MagNA Lyser. De lyserade proverna inkuberas med SeptiFast Prep Kit MG vid förhöjd temperatur med en proteas- och kaotropisk lyseringsbuffert som frigör nukleinsyran och skyddar det frigjorda DNA mot DNaser i blod. En definierad volym med internkontroll (IC) tillsätts i varje prov tillsammans med lyseringsreagens. IC består av syntetiska dubbelsträngade DNA-molekyler med primerbindningsställen som är identiska med de för målsekvenserna. IC innehåller unika H probebindningsregioner som gör attt differentiering av amplifierad IC från target-specifik amplicon kan ske. After tillsats av bindningsbuffert överförs blandningen till en centrifugeringskolumn med en glasfiberfilterinsertion. Humant genomiskt och bakterie-/svamp-target DNA binds till glasfiberytan. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära fragment, tas bort i två tvättsteg. När tvättningen är klar elueras de adsorberade nukleinsyrorna i förhöjd temperatur. Eluaten undergår PCR-analys. PCR-amplifiering och detektion i realtid Val av target Det interna transkriberade spacer-området (ITS) har valts ut som målområde för bakterie- och svampartdifferentiering. Det medger en högre analytisk sensitivitet än enskilda kopieringsgener, eftersom det finns en mängd operoner i genomerna för bakterier och svampar. Vidare är ITS mer artspecifik än ribosomala RNA och därför bäst lämpad för artdifferentiering. Det ligger mellan 16S och 23S ribosomala DNA-sekvenser av alla gram(+) och gram(-) bakterier och mellan 18S och 5,8S ribosomala DNA-sekvenser av alla svampar. Amplifiering Innan PCR-amplifieringen minskas risken för ampliconsmitta genom att du använder AmpErase (uracil-n-glykosylas)-enzym. Det identifierar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. De extraherade proverna tillsätts i amplifieringsblandningen som innehåller hot-start Taq-polymeras i de LightCycler -kapillärer (100 µl) MG där PCR-amplifiering sker. Varje target hos de specificerade arterna amplifieras med antingen generiska eller specifika primers. En blandning av targets amplifieras samtidigt i reagenskontrollerna (RCs). Realtidsdetektion av PCR-produkter via H-prober Amplicon detekteras via fluorescens med hjälp av ett par särskilda H-prober. De här fluorescensmärkta H-proberna hybridiseras till en intern sekvens av det amplifierade fragmentet under bindningsfasen för amplifieringscykeln. Den utsända fluorescensen mäts av instrumentet LightCycler 2.0 i en av de fyra olika detektionskanalerna. Efter att amplifieringen har avslutats utförs en smältkursanalys. Smälttemperaturen T M beror på längd, sekvens och grad av homologi mellan proben och target DNA. Proberna är utformade för att särskilja dessa arter genom deras T M som detekteras i en kanal. Automatiserad identifiering av arter och kontroller Smälttemperaturerna (T M s) för prover och kontroller analyseras via ett tilldelat identifieringsprogram (SeptiFast Identification Software) och en rapport skapas. Låga koncentrationer av koagulasnegativa stafylokocker (KNS) och streptokocker som speglar intervallet av arbetsgångens smitta visas därför inte. Om det finns ett positivt resultat för Staphylococcus aureus bör en efterföljande meca resistenstestning övervägas. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). REAGENS SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Tests LM (lyseringsmatris) 100 x glas-/keramikpartiklar SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests [1] LB (lyseringsbuffert) < 50 % guanidintiocyanat 20 % Triton X-100 Hälsoskadlig 20 x 1500 µl [2] PK (proteinas K) 2 % proteinas K Glycerol [3] BB (bindningsbuffert) < 50 % guanidintiocyanat 20 % Triton X-100 [4] IRB (inhibitionsborttagningsbuffert) < 50 % guanidin-hcl < 40 % etanol Hälsoskadlig Hälsoskadlig Hälsoskadlig 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 10 x 1800 µl 2

SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests [5] WB (tvättbuffert) < 0,2 % natriumklorid < 80 % etanol Mycket brandfarligt 10 x 1600 µl [6] EB (elueringsbuffert) 10 x 400 µl Tris-HCl-buffert BET (blodextraktionsrör) 1 x 50 FC (filterkolumner) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Tests [1a] RM 1a (reaktionsmix 1a) 3 U/µl FastStart Taq polymeras < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) 3 x 27 µl [1b] RM 1b (reaktionsmix 1b) < 1 % Brij < 0,1 % magnesiumlösning < 0,1 % dntp [2] DM G+ (detektionsblandning, grampositiv) < 0,001 % primer, prober för G+ < 1 % Brij [3] DM G- (detektionsblandning, gramnegativ) < 0,001 % primer, prober för G- < 1 % Brij [4] DM F (detektionsblandning svampar) < 0,001 % primer, prober för F < 1 % Brij [5] RC G+ (reagenskontroll, grampositiv) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för G+ EDTA [6] RC G- (reagenskontroll, gramnegativ) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för G- EDTA [7] RC F (reagenskontroll svampar) < 0,001 % DNA-kontrolltemplat för F EDTA [8] IC (internkontroll) < 0,001 % DNA i mallen för bearbetade kontroller för G+, G-, F EDTA [9] NC (negativ kontroll) < 35 % polyetenglykol 10000 3 x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set 1.0 eller senare P/N: 04 705 220 001 1 x SeptiFast Identification Software SeptiFast Macro SeptiFast meca Macro SeptiFast MCC Macro SeptiFast Proof Files 3

VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER Allmänna varningar och säkerhetsåtgärder För in vitro-diagnostisk användning. Detta test är endast avsett att användas med humant blod som samlats i K-EDTA. Heparin har visat sig hämma PCR och får inte användas med detta förfarande. Om testet genomförs för en patient som får heparin (t.ex. terapeutiskt eller under hemodialys) bör prov tas innan något heparin tillförs. Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd puderfria engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagens. Blanda inte reagens från olika loter. Blanda inte reagens från olika kit, förutom de som krävs för Master Mix. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Använd inte kit efter utgångsdatum. Kontakta närmaste Roche-representant om du vill erhålla säkerhetsdatablad (MSDS). Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner, som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) och i CLSI-dokument M29-A (9). Rengör och desinficera alla arbetsytor och handskar noggrant med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ). Försäkra dig om att handskarna är resistenta mot DNA dekontaminationsreagens. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagens. Undvik att dessa reagens kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. Undvik att lyseringsbuffert (LB) och bindningsbuffert (BB) kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med rikliga mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Späd med vatten innan spillet torkas upp. Låt inte LB och BB komma i kontakt med hypokloritlösning (blekmedel). Denna blandning kan bilda en mycket giftig gas. Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot post-amplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbeten inbegriper reagensberedning och provberedning. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas för vid hantering av prov eller kontroll eller för pipettering eller bearbetning av amplifierad DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i post-amplifieringsområdet. Förekomsten av AmpErase-enzym i Master Mix minskar risken för amplicon-smitta. Smitta från positiva kontroller och positiva prover kan dock endast undvikas om god laboratoriesed iakttas och de förfaranden som beskrivs i denna bipacksedel noga följs. Särskilda varningar och säkerhetsåtgärder för användning av LightCycler SeptiFast Test MG DNA från target-organismer för LightCycler SeptiFast Test MG förekommer i miljön. För att undvika falskt positiva resultat genom detektion av sådan miljömässig DNA (DNA-smitta) är det nödvändigt att skapa en arbetsgång som är fri från kontaminerande DNA. Det är i synnerhet användaren som kan vara källan till DNA-smitta, eftersom den mänskliga huden och de övre luftvägarna innehåller olika mikroorganismer som också är targetorganismer i LightCycler SeptiFast Test MG [t.ex. streptokocker och koagulasnegativa stafylokocker (KNS)]. Följande principer är rekommendationer som syftar till att undvika DNA-smitta. Reagens och förbrukningsmaterial för LightCycler SeptiFast Test MG LightCycler SeptiFast Test MG reagens och förbrukningsmaterial är av MG-kvalitet. MG-produkter är utformade för högsensitiv detektion av nukleinsyra från bakterier och svampar. Patentskyddade tillverkningsprocesser utvecklades för att eliminera DNA-smitta som kan interferera med sådana analyser. Undvik onödigt öppnande och stängande av reagensflaskor. Kläder och handskar Använd puderfria handskar under hela arbetsgången. Undvik att exponera huden använd handskar som går utanpå laboratorierockens ärmar. Byt handskar omedelbart vid kontaminering eller behandling med DNA-kontaminerande reagens (t.ex. LTK-008 ; handskarna måste vara resistenta mot reagenset). Rör inte handflate- och fingerytan på hanskarna när du tar på dem. Skötsel av det laminära flödet Rengör arbetsytorna i det laminära flödet med DNA dekontaminationsreagens efter varje extraktion. OBS! Försäkra dig om att utrustningen är resistent mot DNA dekontaminationsreagens. Rengör alla ytor inuti det laminära flödet regelbundet (väggar, utrymmen under bottenplattan, golvplattan). Se till att det laminära flödet är DNA-fritt om det används av flera användare. Slå på UV-ljuset och luftströmmen i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. Skötsel av PCR-arbetsstation Rengör arbetsytorna på PCR-arbetsstationen med DNA kontaminationsreagens efter varje PCR-beredning. Rengör alla ytor inuti PCR-arbetsstationen regelbundet. Slå på UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Se till att UV-ljuset har slagits av när du arbetar. OBS! Byt UV-lampa på det laminära flödet och PCR-arbetsstationen enligt tillverkarens anvisningar. Behandling av enheter och förbrukningsvaror Lämna, om möjligt, särskilda förbrukningsvaror och enheter som använts för LightCycler SeptiFast Test MG i det laminära flödesfacket. Bestråla alla objekt med UV-ljuset i minst 30 minuter innan du börjar arbeta. Använd endast DNA-fritt förbrukningsmaterial (t.ex. MG-kvalitet. Se avsnittet Material som ej medföljer förpackningen.) Använd dem endast en gång. Använd capping tool för att stänga kapillärer (se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 för hanteringsanvisningar) Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 (kapitlet Underhåll ) om kapillärer går sönder. 4

Säkerhetsåtgärder vid pipettering Öppna reagensflaskorna, pipettera spetsfacken och kapillärfacken under det laminära flödet. Använd inte samma pipettspetsar och kapillärer utanför det laminära flödet. Rör inte kanten eller gängorna på en öppen flaska. Rör vid flaskan när du pipetterar under kanten. Rör inte kanten på en öppen kapillär. Lägg alla objekt som använts under förfarandet under det laminära flödet i logisk ordning (undvik korspipettering). Vid spill ska du avsluta det pågående arbetsmomentet och omgående behandla arbetsområdet med DNA dekontaminationsreagens (t.ex. LTK-008 ). FÖRVARING OCH HANTERING SeptiFast Lys Kit MG Förvaras i 15 till 25 C. Öppna flaskorna endast en gång. Återanvänd dem inte. Använd inte efter utgångsdatum. SeptiFast Prep Kit MG Förvara i 15 till 25 C (får varken frysas eller förvaras i kylskåp). Öppna PK maximalt 3 gånger. Öppna andra flaskor endast en gång och kassera allt oanvänt reagens. Blanda inte reagens från olika loter inom en extraktionskörning. Använd inte efter utgångsdatum. LightCycler SeptiFast Kit MG Förvaras i 15 till 25 C. Skyddas mot ljus. Förvara Master Mix (blandningar med [1a], [1b] och [2] eller [3] eller [4]) i 2 till 8 C i maximalt 3 dagar. Förvara RC i 2 till 8 C i upp till 10 dagar eller frys omgående i 15 till 25 C efter varje användning. Öppna RC maximalt 6 gånger. Öppna andra flaskor endast en gång och kassera allt oanvänt reagens. Blanda inte reagens från olika loter inom en PCR-körning. Använd inte efter utgångsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER SeptiFast Lys Kit MG P/N: 04 404 432 001 100 Tests SeptiFast Prep Kit MG P/N: 04 404 459 001 10 Tests LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: 04 469 046 001 54 Tests SeptiFast Software Set 1.0 eller senare (medföljer en gång) P/N: 04 705 220 001 MATERIAL SOM EJ MEDFÖLJER FÖRPACKNINGEN Kan köpas från Roche Instrumentet LightCycler 2.0 med programversion 4.05.415 eller senare 03 531 414 201 LightCycler -kapillärer MG (100 µl) 03 612 066 001 LC karusellcentrifugen 2.0 03 709 582 001 MagNA Lyser-instrument (230 V) 03 358 976 001 LightCycler Multicolor Compensation Set 04 484 355 001 SeptiFast kylblock 04 555 864 001 Kan köpas från andra företag Centrifuge med swingout-rotor för 15 ml rör min. 4200 g-kraft (t.ex. Eppendorf) 1x Centrifuge 5810 2x adaptrar (1par) med element för 15 ml-rör med konisk botten 1x swingout-rotor min. 4200 x g Centrifug (t.ex. Eppendorf) 1x MiniSpin 2 termomixrar (t.ex. Eppendorf) 2 x termomixer komfort inkl. 1 x termoblock för 24 x 2,0 ml-flaskor och 1 x termoblock för 8 x 15 ml-flaskor Rör/flaska rullmixer (t.ex. Stuart Scientific) 1 x rullmixer 1 x Vortex VWR International 521-0076 521-0061 521-0044 VWR International 521-0012 VWR International 460-1112 460-1116 460-1120 VWR International 445-5210 444-1372 5

DNA-fria flaskor och spetsar (t.ex. MG-förbrukningsartiklar, greiner bio-one) 5 ml filterspetsar MG 1 ml filterspetsar MG 100 µl filterspetsar MG 20 µl filterspetsar MG 1 ml serumpipet MG 1,5 ml rör MG DNA-dekontaminationsreagens (t.ex. biodelta GmbH) LTK-008 set Pipett 1-5 ml (t.ex. Thermo Life Sciences) 1 x finnpette 1-5 ml Pipettera 10-1000 µl (t.ex. Eppendorf) 2 x referens 100-1000 µl 2 x referens 10-100 µl 1 x referens 2-20 µl (endast för meca testning) Fack för laminärt flöde (t.ex. Cleanair) BioSafety Cabinet EF 4E PCR-arbetsstationen (t.ex. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Biocap Passive DNA PCR Cabinet Positiv kontrollmaterial Erhålls hos andra företag eller bereds i användarens laboratorium (se avsnittet Förslag på beredning av positiv kontrollmaterial). greiner bio-one 940525MG 750289MG 772289MG 774289MG 700371MG 616202MG biodelta GmbH 200-000 VWR International 613-2541 VWR International 613-3650 613-3649 613-3647 VWR International 135-0055 VWR International 135-6576 PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. Provtagning LightCycler SeptiFast Test MG är endast avsett att användas med K-EDTA-blodprover. Blod ska samlas i sterila rör med K-EDTA som antikoagulant. Transport och förvaring av prover Vid transport av helblod ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas (10). Vid transport av helblod ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas (10). Helblod kan förvaras i 15 till 25 C eller i 2 till 8 C i upp till 3 dagar eller i 15 till 25 C i upp till 4 timmar. Hållbarhet för eluat Använd behandlade prover direkt efter DNA-rening. Förvara en portion som ska beredas för påföljande meca-test, om så behövs (ytterligare information finns i LightCycler SeptiFast meca Kit MG). Eluat kan förvaras i 15 till 25 C eller i 2 till 8 C i upp till 3 dagar eller i 15 till 25 C i upp till 4 timmar. BRUKSANVISNING Innan standardextraktion av prov och kontroll Förbered instrumentet LightCycler 2.0 och PCR-arbetsstationen Färgkompensation: Använd LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001). Om färgkompensationsfilen är utgången ska du förbereda en ny fil. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler Multicolor Compensation Set. Installation av SeptiFast Identification Software (SIS): För installation av uppdateringar ska du kontrollera om ytterligare information medföljer produkten. 1. Logga in på LightCycler -datastationen som administratör. 2. Sätt i SeptiFast Software Set-CD-skivan i CD-enheten på LightCycler -datastationen. 3. För installation första gången: Om Microsoft.NET 1.1 framework inte är installerat kommer du att uppmanas att installera programmet i början av SIS-setup. Microsoft.NET 1.1 framework måste installeras, annars kommer inte SIS att fungera korrekt. 4. Tryck på <OK> för att starta SIS-installationen och följ installationsguiden. 5. Välj <just me> om endast en användare ska arbeta med LightCycler -datastationen, och välj <everyone> om fler än en användare ska arbeta med LightCycler -datastationen. 6. Bekräfta fönstret <Setup succeeded> med <OK> (SIS kan nu startas från skrivbordet genom att du klickar på ikonen). 7. Datamappen för *.ixo-filer: <C:\Export to SIS> skapas automatiskt. Test för korrekt installation av SIS (för test with LightCycler SeptiFast Test MG och LightCycler SeptiFast meca Kit MG): 1. Alla proof-filer kopieras automatisk från SeptiFast Software Set-CD-skivan till mappen <C:\Export to SIS>. 2. Dubbelklicka på SIS-ikonen på skrivbordet och tryck på <Start>. 3. Välj proof-fil från <C:\Export to SIS> (SeptiFast Proof 1.0.ixo respektive SeptiFast meca Proof 1.0). 4. Välj No för att bekräfta om LightCycler -rapporten innehåller flaggan <User Developed or Modified Test Method>. 5. Filen analyseras automatiskt och data visas. 6. Skriv ut rapporten. 7. Öppna och skriv ut de korrelerande pdf-filerna (SeptiFast Proof 1.0.pdf respektive SeptiFast meca Proof 1.0.pdf). 8. Den utskrivna rapporten och proof.pdf:en måste matcha varandra. Om inte ska du kontakta din Roche-representant. 9. Utför stegen 3 8 med den andra proof-filen. 6

Avinstallation av SIS: 1. Logga in på LightCycler -datastationen som administratör. 2. Klicka på <Start> i aktivitetsfältet på LightCycler -datastationen. 3. Välj <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs>. 4. En lista på alla aktuella installerade program visas. Klicka på <SIS>. 5. Välj <Remove> och bekräfta med <Yes>. Installation av SeptiFast Macros: 1. Installera makros från CD-skivan SeptiFast Software Set. 2. Se användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0 för installation av makro ( för in vitro diagnostisk användning ). Förbereda facket för laminärt flöde och PCR-arbetsstationen 1. Rengör och sanera noggrant det laminära flödesfacket och PCR-arbetsstationen (t.ex. med LTK-008 ). 2. Slå på i minst 30 minuter: UV-ljuset och luftströmmen för det laminära flödesfacket, UV-ljus för PCR-arbetsstationen. 3. Slå av UV-ljuset medan du arbetar. 4. Öppna LightCycler SeptiFast Kit MG och ta ut: 1 flaska IC och 2 flaskor NC och låt dem tina i 2 till 8 C i ett rack för extraktion (medföljer ej). 1 flaska RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F och låt dem tina i SeptiFast kylblock till 2 till 8 C under extraktion. 5. Slå på: Termomixer 1 (för 15 ml-rör) och ställ in på 56 C, termomixer 2 (för 1,5 ml-rör) och ställ in på 70 C. 6. Placera tillräckligt med EB (1 flaska per prov/nc) i termomixer 2 (70 C). 7. Fyll rören med provrör med blod eller provflaskor på rullmixern och blanda i 30 minuter. Bearbeta omedelbart. Prov- och kontrollextraktion OBS! Utför alla hanteringssteg i facket för laminärt flöde. Förslag på beredning av positiv kontrollmaterial Positiv kontrollmaterial kan köpas från andra företag. Om det bereds i användarens laboratorium ska välkarakteriserade kliniska isolater väljas enligt den lokala prevalensen och den kliniska inverkan. Dessa isolerade kolonier ska resuspenderas och spikas i negativt blod till en koncentration på ungefär 300 CFU/ml. För positiv kontroll kan ATCC material 33592, en meticillinresistent S. aureus, användas som ger möjlighet att använda eluat som positiv kontroll även för LightCycler SeptiFast Test MG och LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Stammen odlades i 18 24 timmar i 28 till 37 C på blodagar (5 % fårblod) och resuspenderades i buffert till 0,5 McFarland (~1,5x10 8 CFU/ml). Denna suspension är spikad i negativt blod till en slutlig koncentration på 300 CFU/ml. Pre-lyseringsförfarande med SeptiFast Lys Kit MG OBS! Läs användarhandboken för instrumentet MagNA Lyser noggrant. 1. Använd 2 lämpligt märkta flaskor LM för varje prov eller NC. 2. Öppna 2 flaskor i taget, överför 1500 µl provblod eller NC i varje flaska. 3. Stäng de 2 rören ordentligt. OBS! Märk inte korken på rören. 4. Pre-lysera prover i instrumentet MagNA Lyser i 70 sekunder i 7000 rpm. 5. Låt flaskorna stå utanför instrumentet i 10 minuter. Centrifugera inte! Extraktion med SeptiFast Prep Kit MG OBS! Allt reagens ska vara klara lösningar. Om fällning har bildats ska du värma upp lösningen (till högst 37 C). Skaka försiktigt tills fällningen löses upp. 1. Tillsätt 150 µl PK i BET 1. 2. Tillsätt 2 x 1 ml pre-lyserat prov eller NC till BET 1. Undvik att pipettera lyseringsmatris eller skum. 3. Förslut och vortexa kort. 4. Tillsätt 10 µl IC. Använd en ny pipettspets för varje prov eller NC. 5. Tillsätt innehållet i 2 flaskor LB, förslut och vortexa omedelbart och noga. 6. Inkubera 15 minuter i 56 C genom att blanda försiktigt (t.ex. 500 rpm med Eppendorf termomixer). OBS! Alla vätskor i BET 1 måste täckas med inkubering. 7. Tillsätt innehållet i 1 flaska BB, förslut och vortexa. 8. Sätt FC på BET 2. Rör inte innersidan eller uttaget för FC. 9. Pipettera hälften av extraktionsblandningen från BET 1 på FC-filtret (cirka 3,2 ml). 10. Förslut och centrifugera BET 2-FC-enheten i 1 minut i 1900 x g. 11. Pipettera återstoden av extraktionsblandningen från BET 1 på FC-filtret (cirka 3,2 ml). Använd en ny pipettspets för varje prov eller NC. 12. Förslut och centrifugera BET 2-FC-enheten i 3 minuter i 1900 x g. 13. Sätt FC på BET 3. Kassera BET 2 med genomflöde. 14. Tillsätt innehållet i en flaska IRB på FC-filtret i BET 3. 15. Förslut och centrifugera BET 3-FC-enheten i 2 minuter i 4200 x g. 16. Tillsätt innehållet i en flaska WB på FC-filtret i BET 3. 17. Förslut och centrifugera BET 3-FC-enheten i 10 minuter i 4200 x g. 18. Sätt FC på BET 4. Kassera BET 3 med genomflöde. 19. Centrifugera BET 4 i 1 minut i 4200 x g. 20. Sätt FC på BET 5. Kassera BET 4. 21. Pipettera 300 µl föruppvärmd EB (70 C) i mitten av FC. 22. Förslut och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur. 23. Centrifugera i 2 minuter i 4200 x g. 24. Kassera FC. Överför eluat i 1,5 ml-flaskor (t.ex. med serumpipetter från greiner bio-one). Undvik kontakt med rörets sida. 7

Reagensberedning med LightCycler SeptiFast Kit MG OBS! Vi rekommenderar att du utför alla hanteringssteg i en PCR-arbetsstation åtskilt från extraktionsstället. 1. Ta ut SeptiFast kylblock med reagensflaskor från kylskåpet, dekontaminera med DNA-dekontamineringsreagens (t.ex.ltk-008 ) och överför till PCR-arbetsstationen. 2. Vortexa de tinade reagensen kort (utom RM 1a) och låt alla reagens hastigt sjunka till botten. (Om fällningar har bildats, värm upp lösningen till 37 C i 5 minuter och blanda försiktigt tills fällningarna har lösts upp.) 3. Placera flaskorna med tinat reagens samt eluatflaskor i de angivna positionerna i SeptiFast-kylblocket. 4. Öppna flaskorna RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- och DM F. 5. Pipettera 600 µl RM 1b i RM 1a och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. 6. Pipettera 200 µl reaktionsmix från 1a i varje flaska DM G+, DM G- och DM F för att skapa Master Mix MM G(+), MM G(-) och MM F; blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner. Beredning av PCR-reaktioner 1. Placera det antal kapillärer som krävs i SeptiFast-kylblocken, 3 kapillärer för RC (positionerna 1, 2, 3), 3 kapillärer för eluat av NC (positionerna 4, 5, 6), 3 kapillärer för varje eluat av prover (positionerna 7 och uppåt). 2. Pipettera 50 µl av MM G(+) i varje kapillär på den översta raden. 3. Pipettera 50 µl av MM G(-) i varje kapillär på mellanraden. 4. Pipettera 50 µl av MM F i varje kapillär på den nedersta raden. 5. Öppna den första proveluatflaskan. Börja med flaskan på höger sida om SeptiFast-kylblocket. 6. Pipettera 50 µl av proveluat i var och en av de tre kapillärerna ovan, som innehåller MM G(+), MM G(-) och MM F. OBS! Byt spets vid varje pipetteringssteg. 7. Stäng de tre kapillärerna med capping tool (ingår i instrumentet LightCycler 2.0; se användarhanboken för LightCycler 2.0 för instruktioner om använding). 8. Fortsätt med de återstående proveluaten enligt beskrivningen för steg 5 7. Pipettera sist NC-eluat i kapillärerna i positionerna 4, 5 och 6. 9. Öppna RC G+. 10. Pipettera 50 µl i kapillären för position 1. 11. Stäng kapillären och därefter RC G+. 12. Pipettera RC G- och RC F i kapillärpositionerna 2 respektive 3, enligt beskrivningen för steg 9 11. 13. Överför alla kapillärer efter deras nummer i LightCycler -provkarusellen. 14. Centrifugera LightCycler -provkarusellen med LC 2.0-karusellcentrifugen. 15. Placera LightCycler -provkarusellen i instrumentet LightCycler 2.0. Förvaring av återstående reagens och eluat 1. Märk alla oanvända Master Mix-blandningar MM G(+), MM G(-) och MM F med antal återstående reaktioner och datum. Placera flaskorna i motsvarande positioner i SeptiFast-kylblocket. 2. Master Mix MM kan förvaras i 2 till 8 C i upp till 3 dagar. För nästa körning kan sparad Master Mix (MM) fyllas på med färskt MM för att uppnå den volym med arbetslösning som krävs. Denna lösning måste användas omedelbart. 3. Placera flaskorna i motsvarande positioner i SeptiFast-kylblocket i 2 till 8 C. 4. Märk eluatprover och NC med körningsnummer och datum. 5. Kassera alla tomma reagensflaskor. Laddning och drift av instrumentet LightCycler 2.0 OBS! Vi rekommenderar att du kör instrumentet LightCycler 2.0 i ett rum som är åtskilt från DNA-rening och beredning av arbetslösningar. 1. Starta SeptiFast Macro SeptiFast_1.0_04469046001 eller senare (se kapitlet användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0, kapitlet Köra ett Roche-makro ). OBS! Fortsätt inte körningen om användaren är utloggad. Starta en ny körning med ett nytt namn. OBS! Använd inte fältet <assay lot number>. Om du vill lägga till analyslotnumret till körningen ska du skriva in informationen i respektive fält i provredigeraren. 2. Spara körningen med ett namn som ger otvetydlig identifiering (t.ex. användarnamn och datum). 3. Minska antalet prover från standardladdningslistan om färre än 7 prover krävs. Ta bort alla 3 kapillärerna för ett prov i listan, inte bara 1 eller 2 av de 3 parallellanalyserna. Om för många kapillärer oavsiktligt raderas ska du inte lägga till dem utan starta om proceduren från början. 4. Det är möjligt att skriva in patientspecifika data i <parenteser> istället för att använda standardinställning [t.ex. G(+) <Namn_01> istället för G(+) <prov 1>]. Texten måste vara identisk för de de 3 parallellanalyserna i en provlista för att säkerställa rätt providentifiering av SIS. Alternativt kan du lämna standardinställningarna och, om så behövs, använda <Run Note> för att skriva in data. 5. När all provspecifik information har lagts till fortsätter du med kitguiden och startar körningen i instrumentet LightCycler 2.0. OBS! Ändra inte prefixen G(+), G(-), F. Byt inte namn på reagenskontroller [t.ex. G(+) #RC#] och negativa kontroller [t.ex. G(+) #NC#]. 6. När körningen är avslutad ska du kontrollera vätskenivån i kapillärerna (resultat för en kapillär är ogiltiga om volymen i kapillären är variabel). 8

Toppdetektion och automatisk providentifiering Allmän förklaring av analysmoduler OBS! Starta inte dataanalys under körningen av instrumentet LightCycler 2.0. Manuell T M -hämtning kräver 12 T M -hämtningsmoduler (3 analyser, 4 kanaler). Den absoluta kvantifikationsmodulen kräver inte manuell drift. Manuell T M -hämtning kan utföras i upp till 6 toppar med hjälp av T M -streckkoder. T M -streckkoderna för varje analysmodul är fördefinierad i SeptiFast-makrot. Alla kurvor för den valda bilden visas i smälttoppens fönster. Du kan välja eller välja bort T M -streckkoder utan flagga. Baseline för varje analysmodul är fördefinierad i SeptiFast-makrot. Du får inte ändra eller välja bort baselines. Om du råkar ändra ska du skriva in det rätta värdet från tabell 3: Baseline-värden. Om fler än en kapillär aktiveras visas inställningarna för den första kapillären i kryssrutan. Byte av streckkoder påverkar alla aktiverade kapillärer. OBS! Ändra inte följande inställningar: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> eller <Peak Width>. Inställningen <Display - Peak Height> kan väljas. Topparna är definierade som maximalt över baseline. Riktningsförändringar är inte toppar. Ett undantag är RC G-, kanal 610 (se bild 1, kurva 2). I kurva 1 är de två vänstra topparna maximum och måste markeras med två markörlinjer. I kurva 2 visas en av topparna (t.ex. den andra) som en riktningsförändring, men måste även den markeras. I kurvorna 3 och 4 saknas en av topparna. Endast två istället för tre markörlinjer måste aktiveras. Bild 1: RC G-, CH 610 Kurva 1 Kurva 2 Kurva 3 Kurva 4 T M -markörlinjer måste väljas i det giltiga T M -intervallet (se tabell 2). Tabell 2: T M -intervall för giltiga toppar CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] Lågt T M [ C] Högt T M [ C] G(+) 48 53 49 64 49 59 45 65 G(-) 52 66 55 69 48 65 57 62 F 56 61 44 58 49 62 51 62 Värdena för dessa baselines är fördefinierade enligt följande tabell och får inte ändras. (Om värdena skulle råka ändras ska du skriva in dem igen enligt tabellen, annars kommer körningen att flaggas.) Tabell 3: Baseline-värden CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G(-) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059 Justera T M -streckkoderna 1. När körningen är avslutad visar experimentguiden <Analyses have been created>. 2. Flytta fönstret till nederst på sidan (tryck inte på <Finish>). 3. Se till att T M - och baseline-värdena är synliga. 4. Klicka på analysmodulen [t.ex. T M -hämtning G(+) 610]. 5. Aktivera alla positioner i analysen för att få en översikt [t.ex. G(+)]. 6. Klicka endast på positionen G(+) #RC#. 7. Justera T M -streckkoden så att toppens maximum går över baseline. Kom ihåg att endast fokusera på de giltiga T M -intervallen (se tabell 2: T M - intervall för giltiga toppar). Om det inte finns någon topp över baseline måste T M -streckkoden raderas (avaktivera bocken i respekive ruta). I slutet av T M -hämtningen för en särskild kapillär måste det finnas en maximal topp med T M -streckkoder. I vissa fall kan låga koncentrationer av E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8 55,9) och C. albicans (F, CH 640, T M 53,4 57,5) uppträda som riktningsförändring av respektive IC-topp (G+, CH 705, T M 45,5 49,6; F, CH 640, T M 44,8 48,0). Märk dessa riktningsförändringar även med T M -streckkod. 9

8. Aktivera nästa position [t.ex. G(+) #NC#] tillsammans med G(+) #RC# för att få en översikt. (Automatisk värdering anpassas efter den högsta toppen.) 9. Aktivera endast den valda positionen [t.ex. G(+) #NC#]. (Automatisk värdering anpassas efter bakgrundstoppen för NC. Baseline kanske inte längre är synlig.) 10. Fortsätt med toppdetektion enligt beskrivningen för steg 5 7. 11. När du har avslutat den första analysen [t.ex. T M -hämtning G(+) 610] fortsätter du med nästa, enligt beskrivningen för steg 4 10. Avsluta T M -hämtning 1. Flytta experimentguiden till mitten av skärmen och tryck på <Finish>. 2. En rapport skapas automatiskt och måste skrivas ut. 3. Körningen sparas automatiskt. 4. Exportera *.ixo-filen till <C:\Export to SIS>. 5. Kontrollera om rapporten innehåller flaggor och om <run state: complete> visas. 6. Om flaggor inträffar, eller andra meddelanden för run state visas, är körningen ogiltig och alla prover måste testas på nytt. Automatisk toppidentifiering med SeptiFast Identification Software (SIS) 1. Dubbelklicka på SIS-ikonen på skrivbordet och tryck på <Start>. 2. Välj körning från mappen <C:\Export to SIS> och ladda *.ixo-filen. 3. Välj Yes eller No för att bekräfta om LightCycler -rapporten innehåller flaggan <User Developed or Modified Test Method> eller inte. 4. *.ixo-filen analyseras automatiskt och data visas i en rapport. 5. Skriv ut SIS-rapporten. RESULTAT Tolkning av resultat FLAGGOR och KOMMENTARER kan genereras med SeptiFast Identification Software (SIS) som RUN FLAGS, ASSAY FLAGS och FLAGS i SPECIMEN-rutan (se nedan). Kontrollera om det finns körningsutskrift(er) för FLAGS eller COMMENTS i alla rutor. Bild 2: Specimen-ruta Specimen Assay Data Result Flags Comment G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <species> SeptiFast sample 1 G(-) F Mer information finns i COMMENT fields of the RUN FLAGs och ASSAY FLAGs. Provresultat Namnen på <arterna> i RESULT-fältet indikerar att provet har befunnits positivt för den relevanta mikroorganismen. Rådata för de aktuella topparna visas i fältet DATA, inklusive kanalen (CH), smältpunkt (T M ), topphöjd (P H ) och korsningspunkt (CP 1 ). Symbolen i RESULT-fältet betyder att ingen analyt detekterades inom de definierade kriterierna för arterna. 1 CP visas endast för G(+) kanal 610, 640. meca-testning Om det finns ett positivt resultat för Staphylococcus aureus bör en efterföljande meca resistenstestning övervägas. Ytterligare information finns i bipacksedeln för LightCycler SeptiFast meca Kit MG (P/N: 04 488 814 001). Validering Valideringen utförs med SeptiFast Identification Software (SIS). Ogiltiga körningar visas automatiskt och markeras med. Hela körningen måste upprepas. Tabell 4: Flaggor för validering Comments 1 Betydelse ASSAY FLAG NC: IC not detected För NC detekterades ingen target och ingen IC. ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 2 >,< species > För NC detekterades en art. ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Ytterligare en flagga om fler än 3 amplicon detekterades för NC ASSAY FLAG RC: No amplicon: <species> En eller flera amplicon för RC detekterades inte ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Ytterligare en flagga om fler än 3 amplicon inte detekterades för RC SPECIMEN FLAG IC not detected För IC detekterades ingen target och ingen IC. 1 Systemfel listas i avsnittet Felsökning. 2 CP visas endast för G(+) kanal 610, 640. 10

KVALITETSKONTROLL Ett replikat av den negativa kontrollen (NC) och en vardera av 3 reagenskontroller (RC) måste finnas i var och en av de 3 parallellanalyserna [G(+), G(-), F] för varje testkörning. NC och RC måste placeras på definierade positioner enligt beskrivningen i avsnittet Beredning av PCR-reaktioner. Vi rekommenderar att du kör ett positivt material från Roche som positiv kontroll genom hela arbetsgången (se avsnittet Material som ej medföljer förpackningen). SIS fastställer resultaten för IC, NC och RC. Om kontrollerna inte når upp till de definierade specifikationerna flaggas alla provresultaten i fältet för SPECIMEN-rutan. Kontrollera SPECIMEN-rutan i körningsutskriften om det finns flaggor och kommentarer så att du säkerställer att körningen är giltig. Negativ kontroll (NC) NC måste vara negativ medan dess interna kontroll måste vara positiv. Om NC inte uppfyller kriterierna flaggas alla provresultat för analysen. Hela körningen måste upprepas. Reagenskontroll (RC) Varje RC måste vara positiv för amplicon targets för RC. Om någon RC inte uppfyller detta kriterium flaggas alla provresultat för analysen. Hela körningen måste upprepas. Positiv kontroll Den positiva kontrollen måste vara positiv. Om Roche-materialen eller de externa positiva kontrollerna inte uppfyller kriteriet är hela körningen ogiltig. Ingen flagga visas av SIS. Internkontroll (IC) Internkontrollen måste detekteras positiv för alla negativa prover liksom den negativa kontrollen. Om IC inte uppfyller det kriterieret flaggas alla provresultat. Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela processen (extraktion, amplifiering och detektion alla 3 analyserna). Om kontrollerna är konsekvent ogiltiga ska du kontakta Roche för teknisk hjälp. FELSÖKNING Tabell 5: Systemfel visas som COMMENTS för RUN FLAGS och i SIS-utskriften. Systemmeddelande (visas Sannolik orsak i flaggdelarna av SIS-utskriften) Åtgärd User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY Körningen är ogiltig; trolig orsak finns beskriven i användarhandboken för instrumentet LightCycler 2.0. Standardinställningar för makrot (t.ex. baselines, körningsprotokoll etc.) kan ändras. Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i en eller flera analysmoduler Om ett eller flera prover saknas på SIS-rapporten ska du kontrollera om: 1) Någon av de tre analyskapillärerna för ett prov har fel namn, dvs. de analysspecifika prefixen (G+, G-, F) har råkat raderas eller 2) En eller flera provkapillärer har fått fel namn eller så saknas provkapillärer. För att korrigera ska du öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 3. Spara och exportera igen. Välj rätt färgkompensation och beräkna en gång till. Färgkompensationsobjektet är äldre än sex månader Skapa ett nytt färgkompensationsobjekt. Invalid Macro Felaktigt makro körs Sök efter rätt makro i programmet LightCycler och/eller i SeptiFast Software Set. Invalid Baseline Baseline-värdena kan ha ändrats av misstag Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera baseline-värden enligt tabell 3. Spara och exportera igen. Invalid Control Tube En eller flera kontroller har fel namn Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av kontrollnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling En eller flera provkapillärer har fel namn eller provkapillärer saknas Felaktig version av programmet LightCycler används Ingen manuell T M -hämtning har utförts (vare sig i någon prov- eller analysmodul). Makro har avslutats utan analys Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och kontrollera stavningen av provnamn i provredigeraren. Ändra till standardnamn, spara och exportera igen. Öppna programmet LightCycler och sök efter numret på rätt version. Öppna den ursprungliga *.ixo-filen i programmet LightCycler och utför T M -hämtning. Spara och exportera igen. + additional run flags Fler än 5 körningsflaggor har detekterats Försök att åtgärda specifikt beskrivna flaggor och analysera om körningen med SIS. Invalid CCC File Name Två eller flera olika färgkompensationsfiler är aktiva i Välj rätt färgkompensationsfil och beräkna en gång till. en eller flera analysmoduler 11

TESTETS BEGRÄNSNINGAR Detta test har endast validerats för användning med humant blod som samlats i K-EDTA-antikoagulant. Testning av andra provtyper kan ge felaktiga resultat, falskt negativa eller falskt positiva. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och behandling av prover. Användning av den här produkten ska begränsas till personal som utbildats speciellt för arbetsgången med LightCycler SeptiFast Test MG. Egenskaperna för LightCycler SeptiFast Test MG är fastställda för blod som innehåller 1 000 30 000 WBC/µl. Aktuell taxonomi för mikroorganismer är huvudsakligen beroende av fenotypklassificering (biokemiska och fysiologiska egenskaper) och är kanske inte identisk med genetiska bestämningar. I sällsynta fall kan prover med höga mängder target DNA hos Streptococcus spp. få falskt negativt resultat. KLINISK UTVÄRDERING Mål och metoder för klinisk studie En klinisk multicenterstudie genomfördes på fyra platser i Europa. Syftet med studien var att utvärdera egenskaperna för LightCycler SeptiFast Test MG (SeptiFast Lys Kit MG, SeptiFast Prep Kit MG, LightCycler SeptiFast Kit MG) jämfört med blododling (BC) och andra mikrobiologiska testresultat. Humana EDTA helblodsprover togs för att identifiera target DNA för prover från SML (SeptiFast Master List, se tabell 1). Totalt 778 prover togs från 259 patienter med misstänkt systemisk bakterie- eller svampinfektion, oavsett antibiotisk behandlingsstatus, och kliniska symptom på systemisk infektion, inklusive sepsis, allvarlig sepsis och septisk chock. Företrädesvis patienter från intensivvårdsenheter ingick i studien. Parallellt togs blododlingar för rutindiagnos. Resultat från klinisk studie Diagnostisk sensitivitet och specificitet beräknades inte eftersom ingen lämplig referensmetod finns tillgänglig. Totalt analyserades 778 prover från 279 patienter med antingen BC eller PCR. Prover med arter som inte ingår i SML exkluderades. Tabell 6: Antal arter funna i EDTA-blod under den kliniska studien Endast BC Endast PCR Båda metoderna Staphylococcus aureus 19 10 CoNS 9 12 4 Streptococcus pneumoniae 2 4 Streptococcus spp. 2 5 4 Enterococcus faecalis 4 10 8 Enterococcus faecium 3 9 1 Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes / cloacae 2 22 8 Escherichia coli 1 22 10 Klebsiella pneumoniae / oxytoca 1 23 2 Proteus mirabilis 1 1 Pseudomonas aeruginosa 8 3 Serratia marcescens 2 5 1 Stenotrophomonas maltophilia 1 1 3 Aspergillus fumigatus 28 Candida albicans 2 3 3 Candida glabrata 2 Candida krusei 1 Candida parapsilosis Candida tropicalis Alla mikroorganismer 32 173 57 12

173 prover var BC-negativa men PCR-positiva. Under patientens episoder analyserades dessa resultat ytterligare. Andra mikrobiologiska resultat (dvs. en andra blododling som tagits vid en annan tidpunkt, kroppsvätskor/-vävnader, t.ex. dräneringar, sår, biopsi etc.) eller ett andra PCR-resultat från en separat blodtagning användes för att åtgärda avvikande resultat. Tabell 7: Resolution av 173 LightCycler SeptiFast Test MG-resultat som skilde sig från BC-resultat Konfirmerande resultat Antal av totalmängd % av totalmängd 122/173 70,5 % Annan blododling 32/173 18,5 % Olika kroppsvätskor 46/173 26,6 % PCR-resultat från en separat blodtagning 44/173 25,4 % Ej analyserade 51/173 29,5 % Ytterligare resultat: I 43 prover av 778 detekterades mer än en art med hjälp av LightCycler SeptiFast Test MG. I 32 prover av 778 detekterades svamparter med hjälp av LightCycler SeptiFast Test MG. ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING Interfererande ämnen Följande ämnen interfererar inte med detektionen av bakterie- och svamp-dna genom detta test. Tabell 8: Interfererande ämnen Antal Varunamn Aktiv komponent Tillverkare 1x C max 3x C max enheter 1 Piperacillin Piperacillin Hexal 4,0 12,0 mg/ml 2 Fortum Ceftazidim GlaxoSmithKline 0,50 1,5 mg/ml 3 Zienam Imipenem/Cilastatin MSD Sharp & Dohme 0,27* 0,80* mg/ml 4 Tazobac Piperacillin/Tazobaktam Wyeth Pharma 0,75 2,3 mg/ml 5 Ciprobay Ciprofloxacin Bayer 33,3 100,0 µg/ml 6 Vancomycin Vankomycin Lilly 83,0 250,0 µg/ml 7 Refobacin Gentamicin Merck 80,0 240,0 µg/ml 8 Zyvoxid Linezolid Pfizer 0,10 0,30 mg/ml 9 Sobelin Klindamycin Pfizer 0,30 0,90 mg/ml 10 InfectoClont Metronidazol Infectopharm 83,3 250,0 µg/ml 11 Diflucan Flukonazol Pfizer 0,13 0,39 mg/ml 12 Cancidas Caspofungin MSD Sharp & Dohme 8,3 25,0 µg/ml 13 Amphotericin B Amfotericin B Bristol-Myers Squibb 20,0 60,0 µg/ml 14 Novalgin Metamizol Aventis Pharma 0,83 2,5 mg/ml 15 Dexahexal Dexametason Hexal 1,3 4,0 µg/ml 16 ARA-cell Cytarabin cellpharm 63,3 190,0 µg/ml 17 Arterenol Norepinefrin (Noradrenalin) Aventis Pharma 4,8 14,4 µg/ml 18 Aquo-Trinitrosan Glycerolnitrat Merck 1,3 4,0 µg/ml 19 Heparin-Natrium-5000- ratiopharm Heparin ratiopharm 0,83 2,5 I.U./ml Det var inte möjligt att använda C MAX (0,67) av Zienam infusionslösning på grund av signifikant spädning av provet. 13

Analytisk sensitivitet Den analytiska sensitiviteten hos LightCycler SeptiFast Test MG analyserdes genom träffsannolikhetsanalys för varje analyt i en serie spädningar på 100, 30 och 3 CFU/ml i EDTA-blod (se tabell 9). En minimisensitivitet på 30 CFU/ml erhölls var alla arter, utom för Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes och Candida glabrata (100 CFU/ml). Tabell 9: Arter testade med träffsannolikhetsanalys Target Ant. positiva/ant. testade Target Ant. positiva/ant. testade Koncentration [CFU/ml] Koncentration [CFU/ml] 100 30 3 100 30 3 Acinetobacter baumannii 8/8 12/12 17/20 Klebsiella pneumoniae 8/8 12/12 16/20 Aspergillus fumigatus 8/8 12/12 20/20 Proteus mirabilis 8/8 12/12 20/20 Candida albicans 8/8 12/12 14/20 Pseudomonas aeruginosa 8/8 12/12 20/20 Candida glabrata 8/8 9/12 0/20 Serratia marcescens 8/8 12/12 20/20 Candida krusei 8/8 12/12 11/20 Staphylococcus aureus 8/8 12/12 15/20 Candida parapsilosis 8/8 12/12 17/20 Staphylococcus epidermidis 1 8/8 9/12 0/20 Candida tropicalis 8/8 12/12 14/20 Staphylococcus haemolyticus 1 8/8 6/12 0/20 Enterobacter aerogenes 8/8 12/12 10/20 Stenotrophomonas maltophilia 8/8 12/12 19/20 Enterobacter cloacae 8/8 12/12 15/20 Streptococcus pneumoniae 8/8 12/12 6/20 Entercoccus faecalis 8/8 12/12 17/20 Streptococcus agalactiae 2 8/8 11/12 2/20 Entercoccus faecium 8/8 12/12 13/20 Streptococcus pyogenes 2 8/8 8/12 0/20 Escherichia coli 8/8 12/12 20/20 Streptococcus mitis 2 8/8 12/12 13/20 Klebsiella oxytoca 8/8 12/12 17/20 1 Arter som representerar gruppen KNS för SML i tabell 1. 2 Arter som representerar gruppen Streptococcus spp. för SML i tabell 1. Analytisk specificitet Inklusivitet För att bevisa likformighet och homogenitet för ITS-målområdet togs kliniska isolater som härstammar från olika geografiska regioner i Europa (södra, centrala och norra) samt USA. Totalt 1548 isolater har karakteriserats genom mikrobiologiska metoder och testats med LightCycler SeptiFast Test MG [se tabell 1 SeptiFast Master List (SML)]. I USA-provtagningen ingår inte Aspergillus fumigatus, Candida krusei och Staphylococcus haemolyticus. Inom grupperna med Streptococcus spp. och koagulasnegativa stafylokocker (KNS) testades de arter som skildras i tabell 10 positiva med LightCycler SeptiFast Test MG. Tabell 10: Arter som representerar grupper med Streptococcus spp. respektive koagulasnegativa stafylokocker (KNS) testades positiva med LightCycler SeptiFast Test MG Streptococcus spp. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS) S. anginosus S. hominis subsp. novobiosepticus S. bovis S. pasteuri S. constellatus S. warneri S. cristatus S. cohnii subsp. urealyticum S. gordonii S. hominis subsp. hominis S. intermedius S. lugdunensis S. milleri S. cohnii subsp. cohnii S. mitis S. capitis subsp. ureolyticus S. mutans S. capitis subsp. capitis S. oralis S. caprae S. parasanguinis S. saprophyticus S. salivarius S. saprophyticus subsp. saprophyticus S. sanguinis S. xylosus S. thermophilus S. vestibularis S. viridans 14

Avvikande resultat återfanns i färre än 1,2 % av alla resultat. 5 av 128 Enterobacter (aerogenes/cloacae)-stammar var identiska med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) inom dess ITS-område och tolkades som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca). Citrobacter freundii och Salmonella enterica kan vara identiska med Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) respektive E. coli inom deras ITSområden och tolkas som Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) respektive E. coli. 14 av 158 Streptococcus viridans-stammarna var identiska med Streptococcus pneumoniae inom dess ITS-område och tolkas som S. pneumoniae. I sällsynta fall detekteras kanske inte Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) om en mutation inom målsekvensen orsakar en ändring av smältpunkten. Exklusivitet Tabell 11: Alla prover befanns negativa i varje analys. Actinobacillus actinomycetemcomitans Corynebacterium jeikeium Mycoplasma pneumoniae Aeromonas hydrophila Cryptococcus neoformans Neisseria meningitidis Bacillus cereus Gemella haemolysans Pantoea agglomerans Bacteroides fragilis Haemophilus influenzae Peptostreptococcus magnus Bartonella henselae Histoplasma capsulatum Porphyromonas gingivalis Bordetella pertussis Legionella pneumophila Prevotella denticola Borrelia burgdorferi Listeria monocytogenes Propionibacterium acnes Burkholderia cepacia Moraxella (Branhamella) catarrhalis Proteus vulgaris Campylobacter jejuni Morganella morganii Yersinia enterocolitica Cardiobacterium hominis Mycobacterium fortuitum Clostridium perfringens Mycobacterium tuberculosis Precision Precisionen utvärderades med K-EDTA helblod som spikats med medium (10³ CFU/ml) och låga (10² CFU/ml) koncentrationer av Serratia marcescens, Klebsiella oxytoca, Candida krusei och Enterococcus faecalis. Prover analyserades i replikat om 7 med hjälp av 6 instrument och fler än 3 användare på 3 dagar. Smälttopparna analyserades. För intra-analysprecision och inter-analysprecision var alla toppar inom +/- 1,5 C. MEDDELANDE TILL KÖPAREN Köpet av denna produkt ger köparen rätt att använda den för amplifiering och detektion av nukleinsyrasekvenser för human in vitro-diagnostik. Inget allmänt patent eller annan licens tilldelas i det här dokumentet förutom den särskilda användningsrätt som beviljas vid köpet. REFERENSER 1. Kollef M, et al. Inadequate antimicrobial treatment of infections, Chest 1999, 115: 462-474. 2. Garnacho-Montero J, et al. Impact of inadequate empirical antibiotic therapy on the outcome of patients admitted to the ICU with Sepsis, Crit Care Med. 2003, 31(12): 2742-51. 3. Byl B, et al. Impact of Infectious Disease Specialists and Microbiological Data on the Appropriateness of Antimicrobial Therapy for Bacteremia, Clin Infect Dis 1999: 29: 60-66. 4. Suttorp N. Changing populations and future trends in the management of serious infections from: AIM website (www.infectionacademy.org). 5. Peterson LR, et al. Towards targeted prescribing: will the cure for antimicrobial resistance be specific, directed therapy through improved diagnostic testing?, J Antimicrob Chemother 2004, 53: 902-5. 6. Harbarth S, et al. Inappropriate initial antimicrobial therapy and its effect on survival in a clinical trial of immunomodulating therapy for severe sepsis, Am J Med. 2003, 115: 529-535. 7. Houang, E.T.S., et al. Significance of Genomic DNA Group Delineation in Comparative Studies of Antimicrobial Susceptibility of Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother, Apr. 2003, p. 1472-1475. 8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 9. Clinical Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA:CLSI, 1997. 10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 15

Ú Distributed by Tillverkad i Tyskland för: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247) Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F-38240 Meylan Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora C Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland, +49 621 7590 ROCHE, LIGHTCYCLER, MGRADE, MAGNALYSER, FASTSTART, HYBPROBE, SEPTIFAST och AMPERASE är varumärken som tillhör Roche. ROCHE RESPONSE CENTER är ett varumärke som tillhör Roche. Amphotericin B är ett registrerat varumärke som tillhör Bristol-Myers Squibb Company. Aquo-Trinitrosan är ett registrerat varumärke som tillhör Merck & Co., Inc. ARA-cell är ett registrerat varumärke som tillhör cell pharma GmbH. Arterenol är ett registrerat varumärke som tillhör Aventis Pharma Ltd. Cancidas är ett registrerat varumärke som tillhör MSD Sharp & Dohme GmbH. Ciprobay är ett registrerat varumärke som tillhör Bayer AG. Dexahexal är ett registrerat varumärke som tillhör Hexal AG. Diflucan är ett registrerat varumärke som tillhör Pfizer Inc. Fortum är ett registrerat varumärke som tillhör GlaxoSmithKline. Heparin-Natrium-5000-ratiopharm är ett registrerat varumärke som tillhör ratiopharm International. InfectoClont är ett registrerat varumärke som tillhör Infectopharm GmbH. LTK-008 är ett varumärke som tillhör biodelta, ZTB GmbH. MiniSpin är ett registrerat varumärke som tillhör Eppendorf. Novalgin är ett registrerat varumärke som tillhör Aventis Pharma Ltd. Piperacillin är ett registrerat varumärke som tillhör Hexal AG. Refobacin är ett registrerat varumärke som tillhör Merck & Co., Inc. Sobelin är ett registrerat varumärke som tillhör Pfizer Inc. Tazobac är ett registrerat varumärke som tillhör Wyeth Pharmaceuticals AG. Vancomycin är ett registrerat varumärke som tillhör Lilly Pharma Holding GmbH. Zienam är ett registrerat varumärke som tillhör MSD Sharp & Dohme GmbH. Zyvoxid är ett registrerat varumärke som tillhör Pfizer Inc. 2005, Roche Molecular Systems, Inc. Med ensamrätt. 11/2005 (04623886001-01ENGL) 04802900001-01 16