Umeå Universitet Biomedicinska analytikerprogrammet Påvisande av skillnad i tillväxt av lymfocyter efter tillsats av phytohemagglutinin, purified protein derivative eller Staphlyococcus aureus enterotoxin B Årskull: BMA-08 Laborationsrapport i Laboratoriemedicin 2, termin 6 Laborationsdatum: Inlämnad: Godkänd: Handledare:
Abstrakt Superantingen är antigen som ger ett mer massivt immunsvar än ett traditionellt antigen. Superantigen binder bara till V-delen på β-kedjan på TCR och passar in till ett större antal T-celler än traditionella antigen. Aktivering av T-celler resulterar i frisättning av ett stort antal cytokiner. Cytokinfrisättningen leder till hyperaktivering av komplementsystemet, inflammatoriska celler samt koagulationskaskaden vilket kan ge effekter som vävnadsskada, multiorgansvikt och chock. Staphylococcus aureus producerar ett enterotoxin med superantigenaktivitet som heter SEB. Phytomhemagglutinin (PHA) är en mitogen som används vid stimulering av ospecifik proliferation av lymfocyter. För antigenspecifik T-cells proliferation används purified protein derivative (PPD). Syftet med laborationen var att undersöka vilket av PHA, PPD och SEB som gav högst stimulerande effekt på T-cellers proliferation och om stimulit var högst dag 4 eller dag 6 för respektive PHA, PPD och SEB samt jämföra de olika värdena. Mononukleära celler från venblod taget på laborationsdeltagare i CPT-rör användes för att utföra testet. Cellerna späddes med RPMI-medium. I två cellodlingsplattor tillsattes cellerna med respektive PHA, PPD och SEB samt blank och bakgrund och inkuberades i fyra respektive sex dagar. För att mäta proliferationen tillsattes 5-bromo-2 -deoxyuridin (BrdU) som binder in istället för tymidin vid DNAsyntesen och kan detekteras genom ELISA. PHA gav störst tillväxt av celler eftersom det gav högst absorbans, följt av SEB, PPD och Noll. För alla utom PPD var det högst absorbans dag 4 jämfört med dag 6. För brunnarna utan tillsatts (Noll) ska det inte vara någon skillnad mellan dagarna vilket man kunde utläsa av t- och Mann Whitney U-test (p>0,05).
Nyckelord Superantigen, lymfocytstimulering, BrdU, mitogen, ELISA Introduktion Superantingen är antigen som kan ge ett mer massiv immunsvar än ett traditionellt antigen. T-cells receptorn (TCR) binder vanligtvis antigen via båda α- och β-kedjan och har då en specificitet så att varje TCR bara kan binda ett visst sorts antigen. Superantigen binder bara till β-kedjan på TCR och passar då in till ett mycket större antal T-celler. Detta leder till att ett superantigen kan aktivera många fler T-celler än ett vanligt antigen kan. För att T-cellen ska aktiveras krävs även bindning av superantigenet till utsidan av major histocompatibility complex klass II (MHC II). Det blir en trepartsbindning mellan TCR, MHC II och superantigenet. MHC II behöver inte ha bundit annan peptid i klyftan. Bindningen är alltså inte peptidspecifik (1, 2). Aktivering av T-celler resulterar i frisättning av ett stort antal cytokiner som till exempel tumor necrosis factor α (TNF- α) och interleukin 1 (IL-1). Cytokinfrisättningen leder till hyperaktivering av komplementsystemet, inflammatoriska celler samt koagulationskaskaden vilka alla kan ge effekter som vävnadsskada, multiorgansvikt och chock. Toxisk chock syndrom (TSS) är ett exempel på en sjukdom orsakad av ett superantigen från Staphylococcus aureus och Streptococcus pyogenes (1, 2). Superantigen kan produceras av bakterier, virus eller svamp (1). Autoimmunitet tros kunna induceras av superantigen på grund av den stora T-cells stimuleringen och massiva frisättningen av cytokiner. T-celler aktiverar i sin tur B-celler som producerar antikroppar som då kan reagera på kroppsegna peptider och leda till autoimmunitet. Forskare tror även att molekylär mimicry kan ha inverkan i utvecklingen av autoimmuna sjukdomar, det vill säga när det finns homologa sekvenser hos människan och exempelvis bakterien som immunförsvaret reagerar på (1). Infektion av superantigenproducerande mikroorganismer leder till immunsuppression hos patienten. Superantigenen inducerar ökning av FAS-receptorer på T-cellerna yta. Det leder till ökad apoptos och att den sorts T-celler som blir aktiverade slås ut vilket ger ökad risk för infektion av mikroorganismen med det antigen som vanligtvis kontrollerades av T-cellen med den specificiteten på TCR. Vissa av T- cellerna går in i anergy, de blir paralyserade och svarar inte på stimuli (1). Staphylococcus aureus producerar bland annat ett enterotoxin med superantigenaktivitet som heter SEB. Det kan orsaka TSS och matförgiftning (3). Phytomhemagglutinin (PHA) är en mitogen, utvunnet från röda kidneybönor, som används vid stimulering av ospecifik proliferation av T-lymfocyter. PHA består av fem tetramera glykoproteiner med vardera två subenheter. Endast T-lymfocyter stimuleras av PHA, ingen tillväxt av B-lymfocyter sker. T-cellerna behöver däremot närvaro av monocyter för att stimuleras av PHA (4, 5). För att få antigenspecifik T-cells proliferation används purified protein derivative (PPD) som till exempel används i tuberkulintest (6). Tillsats av antigenen SEB, PHA och PPD är tre olika sätt att få proliferation av T-celler. För att mäta proliferationen tillsätts 5-bromo-2 -deoxyuridin (BrdU) som binder in istället för tymidin vid DNA-syntesen och kan detekteras genom ELISA (7).
Hypotesen är att det efter 4 dagar kommer att finnas fler T-celler i de brunnar där PHA och SEB finns eftersom de inte behöver processas, det vill säga visas upp på MHC av antigenpresenterande celler, utan det sker en polyklonal proliferation. PPD kräver processning vilket gör att det tar längre tid att få ett T-cellssvar. Efter 6 dagar kommer det att finnas flest celler efter PHA-stimulering för de ger ett generellt stimuli med en polyklonal expansion som följd medan PPD ger en monoklonal expansion och SEB ger en delvis polyklonal expansion men inte i lika hög grad som PHA. Syftet med laborationen var att undersöka vilket av phytohemagglutinin, purified protein derivative och Staphylococcus aureus enterotoxin B som gav högst stimulerande effekt på T-cellers proliferation och om stimulit var högst dag 4 eller dag 6 för respektive PHA, PPD, och SEB samt jämföra de olika värdena.
Material och metod Celler Mononukleära celler från venblod taget på en laborationsdeltagare, kvinna, 23 år, i CPT-rör. Odling Venblod taget i CPT-rör vändes 8-10 gånger innan centrifugering i rumstemperatur i swing-out rotor under 30 minuter vid 1510 relative centrifugal force (RCF), utan broms. Mononukleära celler samlades då i ett vitaktigt lager under plasman, ovanför gelen. Det vitaktiga lagret sögs upp och överfördes till ett 15 ml sterilt centrifugrör. Cellerna tvättades genom tillsatts av sterilt PBS (15 ml), vändning av röret 5 gånger innan centrifugering i 15 minuter vid 300 RFC med broms. Det mesta av supernantanten sögs bort och cellerna resuspenderades försiktigt i det som var kvar. Ytterligare 10 ml sterilt PBS tillsattes, röret vändes 5 gånger och centrifugerades i 10 minuter vid 300 RFC med broms och supernantanten sögs bort. Pelleten resuspenderades sedan i 3-5 ml RPMImedium (GEBCO)(RPMI-1640, 10% fetalt kalvserum, penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 µg/ml). För att kontrollera koncentrationen av celler i lösningen togs 10 µl till Bürkers räknekammare, önskad slutkoncentration var 0,5 x 10 5 celler/ml. Två cellodlingsplattor användes, en för odling i fyra dagar och en för odling i sex dagar. Till varje avsedd brunn tillsattes 50 µl celler/brunn (slutkoncentration 1 x 10 4 celler/brunn). Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) späddes till 20 ng/ml, phytohemagglutinin (PHA) samt purified protein derivative (PPD) späddes till 10 µg/ml i RPMI-medium, slutkoncentration 10 ng/ml SEB respektive 5 µg/ml PHA och PPD. 50 µl/brunn RPMI-medium tillsattes till noll-brunnarna, blank innehållande 100 µl odlingsmedium/brunn utan celler samt bakgrund innehållande 100 µl celler/brunn tillsattes till respektive brunnar. Runt alla provbrunnar tillsattes slutligen 200 µl sterilt vatten. Plattorna inkuberades i 37 o C i 5 % CO 2 -inkubator i fyra respektive sex dagar. Inmärkning Gjordes dag 4 och dag 6. Till alla brunnar på fyradagars-plattan utom bakgrundsbrunnarna tillsattes 10 µl/brunn av BrdU (1:100 BrdU till sterilt cellodlingsmedium, Cell Proliferation ELISA, BrdU kit, Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland) per 100 µl lösning och inkuberades sedan i 37 o C i 4 timmar. För att undvika att variation i signaler uppkommer på grund av hopklumpning av celler, resuspenderas cellerna innan de centrifugerades, 300 g, 10 minuter och vätskan hälldes av. Därefter torkades cellerna och plattan ställdes in i kyl till dag 7. Detektion
Till cellerna tillsattes 200 µl FixDenat (ELISA kit) och inkuberades 30 minuter vid 15-25 o C. FixDenate skakades sedan ur plattan. 100 µl anti-brdu-pod (ELISA kit) tillsattes/brunn innan inkubering i 90 minuter i 15-25 o C. Lösningen skakades ur och brunnarna sköljdes noggrant tre gånger med 200 µl Washing solution (ELISA kit)/brunn. Tvättlösningen skakades ur mellan varje ny tillsatts av Washing solution. Substrat lösning, 100 µl/brunn, tillsattes och inkuberades i 15-25 o C tills det hade blivit en färgutveckling som var tillräckligt kraftig för att kunna mätas fotometriskt (2-30 minuter). Absorbansen avlästes vid 450 nm (Labsystems Multiscan PLUS, Labsystems, Finland) efter att 25 µl 1 M H 2 SO 4 /brunn stopplösning tillsatts. Statistiska beräkningar Q-test gjordes I Excel 2007 och används för att stryka värden som avviker mycket från gruppen. t-test visar om det finns en signifikant skillnad mellan medelvärdet om man jämför två grupper. Testet utfördes i Excel 2007. f-test utfördes i Excel 2007 och visar på det finns någon signifikant skillnad mellan värdena i gruppen, i detta fall mellan absorbansvärdena. Mann-Whitney U jämför som t-testet om det finns någon signifikant skillnad mellan medelvärde. Skillnad mot t-test är att vi har kan ha en variabel som inte är normalfördelad. Testet gjordes i SPSS Statistics 17.0. Kruskall Wallis kan även den användas då en variabel inte är normalfördelad. Det är ett rangsummatest. Utfördes i SPSS Statistics 17.0. One Way Anova genomfördes i SPSS Statistics 17.0. Testet visar om det finns en signifikant skillnad mellan medelvärden för fler än två olika grupper. Post hoc Bon ferroni visar mellan vilka grupper den signifikanta skillnad finns som visas i One Way Anova. Utfördes i SPSS Statistics 17.0.Boxplot gjordes i SPSS Statistics 17.0 och används till att jämföra värden inom en grupp mot en annan grupps värden. Ger en illustrativ bild och ger bra översikt även över till exempel median.
Resultat Värden för absorbans erhölls efter mätning med spektrofotometer (Tabell I). Q-test visade att ett värde gick att stryka från antigen Noll, dygn 4 (0,157). Medelvärde, median och standardavvikelse beräknades från de övriga värdena (Tabell II). F-test blev p>0,05 för alla antigen. T-test blev p<0,05 för alla utom Noll som blev p>0,05. Samma värden erhölls för Mann Whitney U-test. One Way Anova har p<0,05. Post Hoc Bonferroni har alla antigen jämfört med varandra p<0,05. I Kruskall Wallis test får PHA högst rangsumma följt av SEB, PPD och Noll i den ordningen.
Diskussion Att ett värde gick att stryka från noll pekar på att det avvek kraftigt från de övriga värdena, 0,157 jämfört med ett medelvärde på 0,078. Att F-test blev p>0,05 för alla antigen visar på att det inte finns någon signifikant skillnad i spridning av absorbans mellan dag 4 och dag 6 för respektive antigen. T- testen visar att för alla utom Noll fanns det en signifikant skillnad mellan medelvärde av absorbans när man jämför dag 4 och dag 6 medan det för Noll inte fanns någon signifikant skillnad mellan medelvärdet. Mann Whitney U-test visar samma, det vill säga att det inte finns någon signifikant skillnad mellan medelvärde (p>0,05) för Noll medan det för det övriga antigenen finns en signifikant skillnad (p<0,05). Mann Whitney U-test visar även att för utom för PPD är det högst absorbans dag 4 det vill säga det finns mest celler i brunnarna dag 4 jämfört med dag 6. One Way Anova test har p<0,05 vilket visar att det finns en signifikant skillnad i medelvärde av absorbansen mellan de olika antigenerna. Post Hoc Bonferroni test visar att den minst signifikanta skillnaden i medelvärde ligger mellan antigenen PHA mot SEB och PPD mot Noll. Alltså skiljer det minst i medelvärde i absorbans mellan de grupperna. Kruskall Wallis test visar att PHA har högst rangsumma. Det innebär att PHA har den högsta absorbansen följt av SEB, PPD och Noll den minsta absorbansen. Även i boxplot kan man se att PHA har högst absorbans följt av SEB, PPD och Noll (figur 1). Absorbansen är högre dag 4 än dag 6 för PHA, SEB och Noll men högre dag 6 för PPD. Medelvärdet skiljer sig för alla antigen mellan dygnen utom för Noll där medelvärde är mer likt. Alla medelvärden skiljer sig även mellan antigenen. Sammanfattningsvis kan man säga att PHA gav störst tillväxt av celler eftersom det gav högst absorbans följt av PPD och Noll. SEB är dock svårt att veta om det gav högst tillväxt eftersom vi inte hade lika stor koncentration av SEB som vi hade av PHA och PPD. Den hade däremot näst högst koncentration av celler. För alla utom PPD var det högst absorbans dag 4 jämfört med dag 6 vilket visar på större tillväxt tidigt för PHA och SEB vilket är en följd av att de inte behöver processas innan de stimulerar ett immunsvar medan PPD behöver processas och därför kommer immunsvaret lite senare. Noll ska det inte vara någon skillnad på tillväxten mellan dagarna eftersom det inte ska växa där. Det finns en signifikant skillnad i absorbansen mellan antigenen.
Referenser 1) Hemalatha. V., P. Srikanth and M. Mallika. 2004. Superantigens - Concepts, clinical disease and therapy. Indian Journal of Medical Microbiology. 22(4):204-211. 2) Textbook of bacteriology. Superantigen. [Elektronisk]. Tillgänglig <http://www.textbookofbacteriology.net/proteintoxins.html> [2011-03-02]. 3) Textbook of bacteriology. Toxic shock syndrome. [Elektronisk]. Tillgänglig <http://www.textbookofbacteriology.net/staph_4.html> [2011-03-02]. 4) Nesbit, L., S.M. Johnson, D. Pappagianis, and N.M. Ampel. 2010. Polyfunctional T Lymphocytes Are in the Peripheral Blood of Donors Naturally Immune to Coccidioidomycosis and Are Not Induced by Dendritic Cells. Infection and immunity. Jan. 2010. 309 315. doi:10.1128/iai.00953-09 5) http://www.sciencedirect.com/science?_ob=pdfexcerpturl&_imagekey=b7gft-4dk5t6h-fk- 1&_uoikey=B7GFT-4DK5T6H- FK&_piikey=B0122267656005065&_cdi=20131&_user=10&_acct=C000050221&_version=1&_useri d=10&md5=a110879555a78ff22927992650257a9a&ie=/excerpt.pdf 6) Mahan, C.S., J.J. Thomas, W. Henry Boom, and R. E. Rojas. 2008. CD4+ CD25high Foxp3+ regulatory T cells downregulate human Vd2+ T-lymphocyte function triggered by anti-cd3 or phosphoantigen. Immunology. doi:10.1111/j.1365-2567.2008.02982.x 7) Wellesley. BrdU. [Elektronisk]. Tillgänglig <http://www.wellesley.edu/biology/concepts/html/brdu.html> [2011-03-02].
Tabeller Tabell I. Absorbansvärden (450 nm) för PHA, PPD, SEB och Noll efter 4 respektive 6 dygns inkubation. Antigen Dygn Absorbans 450 nm 1 2 3 4 5 PHA 4 1,178 1,091 0,997 0,947 0,889 6 0,823 0,745 0,856 0,888 0,679 PPD 4 0,198 0,257 0,143 0,317 0,099 6 0,427 0,394 0,299 0,412 0,345 SEB 4 0,849 0,934 0,522 0,978 0,812 6 0,455 0,399 0,644 0,602 0,534 Noll 4 0,065 0,048 0,068 0,157* 0,052 6 0,044 0,039 0,056 0,048 0,029 *Värde struket genom Q-test. Tabell II. Medelvärde, median och standardavvikelse i absorbans (450 nm) för PHA, PPD, SEB och Noll efter 4 respektive 6 dygn. Antigen Dygn Medelvärde Median Standardavvikelse PHA 4 1,020 0,997 0,115 6 0,798 0,823 0,085 PPD 4 0,203 0,198 0,087 6 0,375 0,394 0,053 SEB 4 0,819 0,849 0,179 6 0,527 0,534 0,101 Noll 4 0,058 0,059 0,010 6 0,043 0,044 0,010
Figurer Figur 1. Absorbansvärden efter att celler odlats under stimuli av phytohemagglutinin (PHA), purified protein derivative (PPD), Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) och Noll (inget stimuli) i fyra (blå) respektive sex (grön) dagar. PHA gavs högst stimuli, absorbansen blev högst eftersom cellkoncentrationen var högst.