BLOCK 1; LABORATION 1: Bananflugan som arbetsmaterial Bananflugan, Drosophila melanogaster, tillhör gruppen Diptera, tvåvingar. Den förekommer naturligt i stora delar av världen. Bananflugan är 2-3 mm lång, har gulbrun kroppsfärg och rödbruna facettögon. Bananflugans generationstid är 9 dygn vid optimala betingelser (bra mat, 25 C och fuktig miljö). Äggstadiet varar i ett dygn, sedan följer tre larvstadier på 1+1+2 dygn. Mellan varje larvstadium ömsar larven skinn. Pupptiden varar 4 dygn. En generation från förälder till avkomma tar i praktiken ungefär 14 dagar. D. melanogaster har åtta kromosomer (2n=8). Kromosompar 1 utgörs av könskromosomerna (X,X eller X,Y), medan par 2, 3 och 4 är de autosomala kromosomerna. Hos tvåvingar, myggor och flugor, förekommer en speciell sorts kromosomer i spottkörtlarna hos larverna. Dessa kallas polytena kromosomer och blir mycket stora på grund av upprepade kromosomdelningar i en och samma cell. Polytena kromosomer har en mycket karakteristisk bandstruktur och kan lätt identifieras. HONOR OCH HANAR SKILJER SIG ÅT PÅ FÖLJANDE SÄTT: 1. Honorna är genomsnittligt större än hanarna. 2. Bakre delen av bakkroppen är spetsig hos honor, avrundad hos hanar. 3. Antal segment på bakkroppen är olika hos honor och hanar. Honor 7 och hanar 5. 4. Hanar har genitalbågar på könsorganet. 5. Hanar har sk könskam på främre benparet.
ARBETSUPPGIFTER i anslutning till genkartläggningen SKICKAS IN PER POST TILL AGNETA PROFT. Korsningsschema I:GE Observera att korsningsriktningen alltid är given genom att honans fenotyp sätts före x -tecknet och hanens efter. I korsningsscheman får a beteckna vilken recessiv gen som helst och + motsvarande normalallel. = Y-kromosom Könsbunden Autosomal a x +: P: a a x + a a x + + Fenotyp: a + a + F1: Fenotyp: F2: Fenotyp: Könsbunden Autosomal + x a: P: + + x a + + x a a Fenotyp: + a + a F1: Fenotyp: F2: Fenotyp:
1. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen a x + könsbunden? 2. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen a x +, autosomal? 3. Går det att avgöra om a är könsbunden eller autosomal i F1 av korsningen a x +? 4. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen a x + könsbunden? 5. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen a x + autosomal? 6. Går det att avgöra om a är könsbunden eller autosomal i F2 av korsningen a x +? 7. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen + x a, könsbunden?
8. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen + x a autosomal? 9. Går det att avgöra om a är könsbunden eller autosomal i F1 av korsningen + x a? 10. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen + x a, könsbunden? 11. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen + x a autosomal? 12. Går det att avgöra om a är könsbunden eller autosomal i F2 av korsningen + x a?
ARBETSUPPGIFTER i anslutning till genkartläggningen SKICKAS IN PER POST TILL AGNETA PROFT. Korsningsschema II: Observera att korsningsriktningen alltid är given genom att honans fenotyp sätts före x -tecknet och hanens efter. I korsningsscheman får A beteckna vilken dominant gen som helst och + motsvarande normalallel. = Y-kromosom Könsbunden Autosomal A x +: P: A A x + A A x + + Fenotyp: A + A + F1: Fenotyp: F2: Fenotyp: Könsbunden Autosomal + x A: P: + + x A + + x A A Fenotyp: + A + A F1: Fenotyp: F2: Fenotyp:
1. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen A x +, könsbunden? 2. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen A x +, autosomal? 3. Går det att avgöra om A är könsbunden eller autosomal i F1 av korsningen A x +? 4. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen A x + könsbunden? 5. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen A x + autosomal? 6. Går det att avgöra om A är könsbunden eller autosomal i F2 av korsningen A x +? 7. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen + x A, könsbunden?
8. Vilka fenotyper förväntas i F1 av korsningen + x A autosomal? 9. Går det att avgöra om A är könsbunden eller autosomal i F1 av 10. korsningen + x A? 11. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen + x A, könsbunden? 12. Vilka fenotyper förväntas i F2 av korsningen + x A autosomal? 13. Går det att avgöra om A är könsbunden eller autosomal i F2 av korsningen + x A?
BLOCK 1; LABORATION 2: Genkartläggning En huvudinriktning i den moderna genetiken, genomiken, bygger på att gensekvenser kan identifieras med utgångspunkt från deras lokalisation i genomet. Förutsättningen för detta är att man har genkartor med tidigare kända gener och andra DNA sekvenser som man använder som markörer. Genkartor skapar man bl.a. genom s.k. kopplingsanalys (Se Kap 8). Vi säger att gener är kopplade om de liggar på samma kromosom. Och det betyder att de alleler för två loci som finns på samma kromosom (DNA-molekyl) har en stor tendens att nedärvas tillsammans. Men genom meiotisk rekombination mellan de homologa kromosomerna så kan denna koppling brytas. (Observera att i meiosen 1:a profas så består varje homolog kromosom av två identiska DNA-molekyler.) Kopplingsanalysen bygger på att analysera om och i vilken utsträckning t.ex. två specifika genmutanter nedärvs tillsammans i korsningar eller pedigrees (hos människor). Handledning till LABORATION 2 Koppling innebär ju att generna ligger i samma kromosom. För två gener och testkorsning gäller att man får ett underskott av rekombinanter och ett överskott av parentaler om koppling föreligger. För tre gener kan 1) alla tre generna vara kopplade, 2) två kan vara kopplade eller de kan ligga i tre olika kromosomer (alltså ingen koppling). 1) I det första fallet får man två kategorier med många individer. Dessa är då parentaler. Man får också två kategorier med mycket få individer (kanske inga alls). Dessa är då resultatet av dubbla överkorsningar. Övriga fyra kategorier liknar varandra i antal två och två och representerar de enkla överkorsningarna i första och andra regionen. 2) Om två gener är kopplade och den tredje ligger i en annan kromosom får man fyra lika stora kategorier som representerar fri klyvning av parentaltyper och fyra sinsemellan lika stora kategorier men i lägre antal som representerar rekombinanterna. 3) Om alla tre generna ligger i olika kromosomer får man åtta kategorier med lika antal individer. Löst typuppgift Njurformade ögon bildas av den recessiva mutanten k (kidney) hos Drosophila. (Motsvarande vildtypsallel ger runda ögon). Orange ögonfärg produceras av genen cardinal cd. En tredje gen har en allel e (ebony) som ger svart kroppsfärg. Honor heterozygota för de tre generna testkorsades med hannar homozygota för alla tre generna. Resultatet av denna korsning blev:
Testkorsningsavkomma Antal Vildtyp 8 ebony 1173 cardinal 138 ebony, cardinal 89 kidney 97 kidney, ebony 128 kidney, cardinal 1761 kidney, ebony, cardinal 6 Beräkna ordningsföljd och genavstånd. Lösning Bestäm först vilka som är parentaler. Dessa finns ju i störst antal. Det måste vara de som antingen är ebony eller kidney, cardinal. Det betyder att parentalkorsningen måste ha varit en korsning mellan individer homozygota för ebony och individer homozygota för cardinal och kidney. Du kan nu skriva om de åtta fenotyperna med en tillfällig ordningsföljd och med riktiga beteckningar. Du antar förslagsvis att cardinal ligger i mitten Du kan också ordna de olika grupperna av djur så att lika antal kommer intill varandra. Tabellen kommer då att se ut så här: k cd + 1761 + + e 1773 + cd e 89 k + + 97 k + e 128 + cd + 138 + + + 8 k cd e 6 Du kan också rita upp genotypen hos F1 honorna på ett mera exakt sätt. k cd + + + e Observera dock att ordningsföljden är tillfällig och kan visa sig vara felaktig.
Du kan nu tänka efter hur de olika fenotyperna har uppkommit och titta på de tre generna två och två. Du kan sedan fylla i tabellen enligt följande: Finns k och cd cd och e k och e överkorsn. mellan: k cd + 1761 nej nej nej + + e 1773 nej nej nej + cd e 89 ja ja nej k + + 97 ja ja nej k + e 128 ja nej ja + cd + 138 ja nej ja + + + 8 nej ja ja k cd e 6 nej ja ja Det kan ibland vara svårt att se om man har gjort rätt. En ledtråd är då att man alltid skall ha fyra "ja" och fyra "nej" i varje kolumn. Du kan nu summera samtliga "ja" i varje kolumn. För överkorsning mellan k och cd får du: 89+97+128+138=452. För överkorsning mellan cd och e får du: 89+97+8+6=200. För överkorsning mellan k och e får du:128+138+8+6=280. Detta innebär att den tillfälliga ordningsföljden måste revideras. Avståndet mellan k och cd var störst. Alltså måste e ligga i mitten. Vi skall nu beräkna avståndet mellan generna. För att göra det måste man först ha reda på totalsumman av antal individer. detta antal är 4000. Antal överkorsningar mellan cd och e är 200. Avståndet mellan cd och e blir då 200/4000 x 100=5 cm. Avståndet mellan e och k blir 280/4000 x 100=7cM. Avståndet mellan k och cd är 452/4000 x 100 = 11,3 cm.. Vid den direkta uträkningen missar man de dubbla överkorsningarna och detta värde blir alltså för lågt. Det korrekta värdet mellan k och cd = 5 cm + 7 cm = 12 cm
UPPGIFT: I den här laborationen ska Du genom att använda Virtual Flylab bestämma vilka gener som ligger på X-kromosomen. Följande mutantgener används: Black Body (BL); svart kroppsfärg Crossveinless Wings (CV); ingen tvärribba på vingarna Curly Wings (CY); upprullade vingar Forked Bristles (F); gaffelgrenade borst på ryggen Singed Bristles (SN); svedda borst på ryggen Yellow body (Y); gul kroppsfärg Du kan se en lite närmare beskrivning på generna i Virtual Flylab SKICKA IN OCH REDOVISA KORSNINGSSCHEMA FÖR VARJE AV OVANSTÅENDE GENER. Med hjälp av kopplingsanalys, eller s.k. "Three-point-test" skall Du sedan bestämma genordning och genavstånd. Tips! Honan i testet måste vara heterozygot och hannen skall ha de recessiva karaktärerna. Ett djur kan t.ex inte ha två borstkaraktärer samtidigt i Virtual Flylab. REDOVISNING, SOM SKICKAS IN: 1. Rita schematiskt upp parental och F1 flugorna. 2. Förklara hur de olika fenotyperna uppkommit. 3. Vilken är genordningen mellan de fyra generna. Motivera svaret 4. Vad är genavstånden mellan de undersökta generna. 5. Stämmer Dina värden med genkartan i Klug och Cummings sid 170? Om inte, förklara varför.
BLOCK 2: LABORATION 3: Humana karaktärer, populationsstudie INTRODUKTION Alla människor är olika varandra. En del av den variation som vi kan se beror på våra gener, en del på andra faktorer. Som alla vet är fingeravtryck ett bra sätt att identifiera människor på. Vi föds med ett mönster som inte förändras under livstiden. Inte ens enäggstvillingar har dock exakt samma fingeravtrycksmönster, vilket visar att egenskapen inte bara beror på generna. Även i de fallen då generna är det viktigaste är det inte säkert att en gen är ansvarig för en viss egenskap. Det mesta av det vi kallar normalvariation beror tvärtom på många gener (polygen nedärvning). Ett antal egenskaper som ligger inom normalvariationen har beskrivits som monogent nedärvda. Närmare undersökningar har ofta visat att det inte är så enkelt. Laborationen går ut på att vi först utgår ifrån att det är fråga om monogen nedärvning. Därefter kan ni själva kolla om det stämmer. Vi kan också se hur stor variation vi kan påvisa inom denna population. Finns det några som är identiskt lika? Notera din egen fenotyp för två karaktär. Ange också din genotyp så långt det är möjligt enligt locus-beteckningar nedan. Gör samma för ytterligare minst 19 personer. FÖLJANDE KARAKTÄRER OBSERVERAS: 1. Örsnibbar. Örsnibben kan vara fri eller sammanvuxen med huvudet. Detta har antagits bero på en enda gen; fri örsnibb är dominant i förhållande till sammanvuxen. Troligen är det inte så enkelt utan egenskapen visar polygen nedärvning. Försök ändå klassa er själva. 2. Hårfästet. Hos en del individer går hårfästet ner i en liten spets widow s peak. Detta har ansetts bero på en dominant gen i förhållande till frånvaron av widow s peak. Försök att klassa er själva. 3. Tungrullning. En dominant gen anses ansvarig för att en del människor kan rulla tungan till en strut, medan andra inte kan det. Detta har betvivlats, bl a därför att enäggstvillingar bara har 67% överensstämmelse i denna egenskap. Kanske är den inte alls ärftlig. För enkelhetens skull utgår vi från att den är ärftlig och nedärvs på detta enkla sätt Klassa er själva. 4. Lillfingret. En dominant gen har ansetts ansvarig för om man har böjt lillfinger. Lägg bägge händerna avslappat på bordet och se om lillfingret böjer sig åt ringfingrets håll. Klassa er själva. 5. Liftartumme. En del människor har en större rörlighet i den yttre tumleden än andra. Om denna led kan böjas i nära 90o vinkel anses man ha liftartumme. Denna egenskap beror på en recessiv gen, som dock har en ofullständig penetrans (ca 90%). Klassa er själva.
6. Smakare resp icke smakare. Förmågan att uppleva den bittra smaken av PTC (fenyltiokarbamid) bestäms av en dominant gen medan den motsvarande recessiva allelen betyder oförmåga att känna smaken. Istället för att testa kemikalien smakar vi på det vita skiktet i skalet av grapefrukt. Klassa er själva. 7. Hår på mellanfalangen. I stort sett alla av oss har hår på den innersta leden (falangen) av våra fingrar. Vi saknar hår på den yttersta men mellanfalangen kan vara antingen med eller utan hår. Man har antagit att en dominant gen bestämmer förekomsten av hår på något eller några av fingrarna. Olika alleler kan sedan bestämma vilka fingrar som har behåring och vilka som saknar. Klassa er själva. 8. Knäppning av händerna. Om man knäpper händerna kommer alltid höger fingrar överst för en del människor medan vänster fingrar hamnar överst hos andra. Denna egenskap har ansetts ärftlig och beror på ett enda allelpar. 9. Egenskapen höger fingrar överst skulle vara recessiv och vänster fingrar överst dominant. Klassa er själva. EGNA RESULTAT BETECKNING Örsnibb Fri.. C- Fast.. cc Hårfäste Rakt.. ww Spetsigt.. W- Tungrullare Ja.. R- Nej.. rr Lillfinger Böjt.. B- Rakt.. bb Liftartumme Ja.. hh Nej.. H- Smakare Ja.. T- Nej.. tt Hår på mellanled Ja.. M- Nej. mm Handknäppning: Höger över.. ff Vänster över.. F-
GRUPPENS RESULTAT Egenskap Örsnibb Hårfäste Tungrullning Lillfinger Liftartumme Smakare Hår på mellanled Handknäppning Dominant fenotyp Recessiv fenotyp % recessiv ANALYS AV ÄRVDA KARAKTÄRER Vi väljer ut två karaktärer för att studera om det finns någon korrelation mellan dem, eller om det bara beror på slumpen att en individ har båda. Karaktär nummer 1: Andel individer i gruppen som uppvisar den: Karaktär nummer 2: Andel individer i gruppen som uppvisar den: Betrakta andelen som uppvisar en karaktär som sannolikheten för vem som helst att uppvisa den. Räkna ut sannolikheten för vem som helst att uppvisa båda karaktärerna. sannolikhet(ha båda)=sannolikhet (ha karaktär 1) x sannolikhet (ha karaktär 2): Beräkning av antalet heterozygoter
Med hjälp av Hardy-Weinbergs lag kan man beräkna hur många personer som teoretiskt är bärare av den recessiva allelen i heterozygot form. Dela upp er i grupper låt varje grupp undersöka en av de recessiva karaktärerna. Jag undersöker karaktären: Beräkningar: I gruppen finns teoretiskt personer som är heterozygota bärare av denna allel. Om du har denna recessiva karaktär och din partner inte har den, hur stor är sannolikheten att ert första barn har karaktären? Beräkningar: SKICKA IN RESULTAT OCH UTRÄKNINGAR TILL AGNETA PROFT.
BLOCK 2: LABORATION 4: Humana karyotyper KROMOSOMANALYSER Människans 46 kromosomer ordnas och benämnes efter ett system som bestämdes vid en konferens i Denver 1960. Man tog då hänsyn till kromosomstorlek och centromerernas läge. Sedan lärde man sig att göra differentialfärgningar som bl a åstadkommer tvärband på kromosomerna och därigenom fick man möjlighet att identifiera de individuella kromosomerna. Det är idag huvudsakligen fyra metoder som används för differentialfärgning av kromosomer). Vid en konferens i Paris 1971 gjordes en överenskommelse om regler för benämning av kromosomernas band. Klassifikationen av de humana kromosomerna bestäms av the Standing Committee of Human Cytogenetic Nomenclature som regelbundet uppdaterar systemet. Deras rapport går under benämningen the International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN). Ett diagram för den bandade humana karyotypen finns i) och detaljerade beskrivningar av de humana kromosomerna finns på (HUGO). Studiet av människans kromosomer är också en viktig del av det Humana Genomprojektet (HUGO). Med utvecklingen av Fluorescence In Situ Hybidization (FISH) har det blivet möjligt att direkt på kromosomerna lokalisera var generna finns lokaliserade. Denna metodik i många olika varianter har fått stor betydelse för studiet av de kromosomala sjukdomssyndromen men också inom t.ex. cancerforskningen. Ett av de största projekten är som bedrivs av amerikanska National Cancer Institute (NCI). Celler i lämpliga delningsstadier för att göra cytogenetiska analyser (studera kromosomerna) kan man skaffa sig genom cellodling, blododling eller direktpreparat. Blododling är ofta det lämpligaste vid arbete med humant material. Vita blodkroppar har i motsats till röda blodkroppar en cellkärna och kan växa och föröka sig. I vanliga odlingsmedier delar sig cellerna dock inte. P C Nowell fann 1959 att en tillsats av phytohemagglutinin ( från extrakt av trädgårdsböna, Vicia faba ) gav en markant ökning av mitoser hos leukocyter in vitro. Flera olika odlingsmedier och även olika typer av mitogen ( mitos-stimulerande ämnen ) finns tillgängliga i handeln.
För att göra en cytogenetisk analys behöver man ha celler i metafas där man eliminerat bildandet av kärnspolen så att de individuella kromosomerna kan studeras morfologiskt. Man använder vanligen colchicin eller derivat av detta såsom colchemid, dessa ämnen undertrycker bildatet av mikrotubuli. Fig. 1 Schematisk bild över uppsättning av blodkultur och tillverkning av kromosompreparat. Flera olika differentialfärgningsmetoder används rutinmässigt för karyotypanalyser G-bandning - kromosomerna utsätts för kontrollerad behandling med trypsinas innan de färgas med Giemsa, ett DNA-specifikt färgämne. Mörka band kallas G-band. Ljusa band är G-negativa. Q-bandning - kromosomerna färgas med fluorescerande färgämnen som Qiunacrine, DAPI eller Hoechst 33258, vilka i första han binder till ATrikt DNA. Man studerar preparaten i UV-mikroskop. Fluorescerande band kallas Q-band och markerar samma kromosomala segment som G- banden. R-bandning - ger ett omvänt (Reverse) G-bandningsmönster. Kromosomerna denatureras i saltlösning vid ca 90 o C innan de färgas
med Giemsa. Värmebehandlingen denaturerar AT-rikt DNA och R-band motsvarar de G-negativa banden. C-bandning - färgar konstitutivt (Constitutive) heterokromatin, dvs konstant heterokromatiska regioner (centromerregioner och vissa regioner på kromosom 1, 9, 16 och Y). Kromosomerna denatureras med mättad bariumhydroxid-lösning innan de färgas med Giemsa. Material (DELAS UT I GÖTEBORG) A. Diagrambild av de humana bandade kromosomerna B. 5 st fotografier på humana G-bandade metafasceller: Foto A, Foto B, Foto C, Foto D & Foto E. Varje foto representerar metafasceller från någon av följande: (1) Normal man eller normal kvinna (2) Klinefelters syndrom (3) Turners syndrom (4) Patient med trisomi (5) Patient med Robertsonsk translokation Uppgift: Uppgiften är att para ihop vilket foto (A - E) som motsvarar vilken patient eller normal person (1-5). Du ska i samtliga fall också ange om det är man eller kvinna. Motivera svaren. Utförande. Människans kromosomer behandlas i kapitel 7 i kursboken och där finns också olika fotografier på G-bandade kromosomer. Börja med att titta igenom detta kapitel. TIPS 1. Räkna antalet kromosomer i varje metafasplatta. Är det 2n = 46? eller 2n =
TIPS 2. Räkna de minsta kromosomerna (G-gruppen, se nedan) i varje metafasplatta Är det en man eller en kvinna? 3. Markera på varje foto vilka kromosomer som tillhör de olika grupperna D respektive G (se följande sidor) och markera X- och Y-kromosomerna. Bestäm på så sätt vilken metafasplatta som tillhör var och en av de ovan nämnda individerna.