FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING.

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test HCMCAP 48 Tests P/N: 03568547 190 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent AVSEDD ANVÄNDNING COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test är ett in vitro-test för nukleinsyraamplifiering för kvantifiering av hepatit C-virus (HCV) RNA i human plasma eller serum, där instrumentet COBAS AmpliPrep används för automatisk provextraktion och analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 används för automatisk amplifiering och detektion. Testet är avsett att användas i kombination med en klinisk bedömning och andra laboratoriemarkörer för HCV-infektion, för klinisk hantering av patienter med kronisk HCV-infektion. Testet kan användas för att bedöma sannolikheten för bestående viral respons i ett tidigt skede i den antivirala behandlingen och för att bedöma viral respons på antiviral behandling mätt i förändringar i HCV RNA-nivåer i serum eller plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test är inte avsett att användas som screeningtest för förekomst av HCV i blod eller blodprodukter eller som ett diagnostiskt test för att bekräfta förekomst av HCV-infektion. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Hepatit C-virus 1 betraktas som det huvudsakliga etiologiska agenset. Det ansvarar för 90 95 % av fallen av post-transfusion icke-a- och icke-b-hepatit 2,3. HCV är ett enkelsträngat, positivt RNA-virus med ett genom på cirka 10 000 nukleotider som kodar för 3000 aminosyror. Som blodburet virus kan HCV överföras via blod eller blodprodukter. En utbredd användning av HCV-screeningtest för blod har märkbart minskat risken för transfusionsrelaterad hepatit. Risken för HCV-infektion är störst i samband med intravenöst drogmissbruk och i mindre utsträckning i samband med annan perkutan exponering 3. Förekomsten av HCVinfektion i världen, fastställt genom immunserologi, ligger i intervallet mellan 0,6 % i Kanada och 1,5 % i Japan 2. Förekomsten av anti-hcv-antikroppar hos patienter smittade med HCV har lett till utarbetandet av immunserologiska analyser som är specifika för dessa antikroppar. Förekomsten av anti-hcv-antikroppar är däremot ett mått på tidigare exponering för HCV-infektion, men kan inte betraktas som en markör för pågående infektion. Dessutom är direkt detektion med hjälp av virusodlingsmetoder inte möjligt trots att detektion av HCV-kärnantigen är möjligt. Måttet för alaninaminotransferasnivåer (ALAT) betraktas som en surrogatindikator på HCV-infektion, men är inte ett direkt mått på viremi. ALAT-nivån går inte att sätta i direkt samband med HCV-infektionsnivån. ALATnivån kan vara förhöjd på grund av olika orsaker till leverinflammation, inbegripet, men inte begränsat till, virushepatit. Däremot är detektion och kvantifiering av HCV RNA genom PCR-nukleinsyraamplifiering ett mått på aktiv viremi 4-6. Med PCR-teknik är det möjligt att detektera HCV-viremi före immunologisk serokonversion 7,8 och att detektera förändringar i virusmängden hos antikroppspositiva kroniskt HCVsmittade patienter som genomgår behandling med interferon 9. ANVÄNDNINGSPRINCIPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test är ett nukleinsyraamplifieringstest för kvantifiering av hepatit C-virus (HCV) RNA i humant serum eller plasma. Extraktion utförs automatiskt med instrumentet COBAS AmpliPrep och amplifiering och detektion utförs automatiskt med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test baseras på tre grundläggande principer: (1) extraktion för att isolera HCV RNA; (2) reverse transcription av target RNA för att skapa kompletterande DNA (cdna) och (3) samtidig PCR-amplifiering av target cdna och detektion av klyvd dubbelmärkt oligonukleotiddetektionsprob som är specifik för target. Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet. 05998212028-02SV 1 Doc Rev. 8.0

Med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test kan automatisk extraktion utföras följt av automatisk reverse transcription, PCR-amplifiering och detektion av HCV target RNA och HCV Quantitation Standard (QS) Armored RNA. Master Mix-reagenset innehåller primers och prober som är specifika både för HCV RNA och HCV QS Armored RNA. Master Mix har utvecklats för att säkerställa likvärdig kvantifiering för HCV-genotyp 1 till 6. Detektion av amplifierat DNA utförs med hjälp av en målspecifik och en QS-specifik dubbelmärkt oligonukleotidprob som tillåter oberoende identifiering av HCV amplicon och HCV QS amplicon. Kvantifieringen av HCV-virus RNA utförs med hjälp av HCV QS. Den kompenserar för hämningseffekter och kontrollerar extraktionen och amplifieringen så att kvantifieringen av HCV RNA blir korrekt i varje prov. HCV QS är en icke smittbärande Armored RNA-konstruktion som innehåller HCV-sekvenser med likadana primerbindningsställen som HCV target RNA och en unik probbindningsregion som gör att HCV QS amplicon kan särskiljas från HCV target amplicon. HCV QS tillsätts i varje prov med känt antal kopior och genomgår alla steg i extraktion, reverse transcription, PCR-amplifiering och detektion av klyvda dubbelmärkta oligonukleotidprober. Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 beräknar HCV RNA-koncentrationen i testproverna genom att jämföra HCV-signalen med HCV QS-signalen för varje prov och kontroll. Val av target Urvalet av target RNA-sekvensen för HCV beror på påvisandet av regioner inom HCV-genomet som visar maximal sekvenskonservering bland de olika HCV-genotyperna 10,11. Generisk kiselbaserad extraktion används för infångning av HCV RNA och HCV QS RNA, och definierade oligonukleotider används som primers för amplifiering av HCV RNA och HCV QS RNA. En målspecifik och en QS-specifik dubbelmärkt oligonukleotidprob möjliggör oberoende identifiering av HCV-amplicon och HCV QS-amplicon. Följaktligen är rätt val av primers och den dubbelmärkta oligonukleotidproben mycket viktigt för testets möjlighet att amplifiera och detektera HCV-genotyper. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test används reverse transcription och PCR-amplifieringsprimers för att definiera en sekvens inom den maximalt konserverade 5'-UTR för HCV-genomet 12. Nukleotidsekvensen hos primers har optimerats så att den ger jämförbar amplifiering av HCV-genotyper. Extraktion COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test använder automatisk extraktion i COBAS AmpliPrep Instrument med hjälp av en generisk kiselbaserad infångningsteknik. Vid proceduren krävs 850 µl plasma eller serum. HCV-viruspartiklarna lyseras genom inkubering i förhöjd temperatur med en proteas- och kaotropisk lyserings-/bindningsbuffert som frigör nukleinsyror och skyddar det frigjorda HCV RNA mot RNaser i serum eller plasma. Proteas och ett känt antal HCV QS RNA-molekyler tillsätts i varje prov tillsammans med lyseringsreagenset och magnetiska glaspartiklar. Därefter inkuberas blandningen och HCV RNA och HCV QS RNA binds till de magnetiska glaspartiklarnas yta. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära föroreningar tas bort när de magnetiska glaspartiklarna tvättas. När partiklarna har separerats och tvättningen är klar elueras de adsorberade nukleinsyrorna i förhöjd temperatur med en vattenbaserad lösning. Det extraherade provet, som både innehåller de magnetiska glaspartiklarna samt det frigjorda HCV DNA och HCV QS RNA, läggs till i amplifieringsblandningen och överförs till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48. HCV target RNA och HCV QS RNA genomgår därefter reverse transcription, amplifiering och detektion samtidigt genom klyvning av en målspecifik och en QS-specifik dubbelmärkt oligonukleotidprob. Reverse transcription och PCR-amplifiering Reverse transcription och PCR-amplifieringsreaktionen utförs med det värmebeständiga rekombinanta enzymet Thermus specie DNA-polymeras (Z05). Vid förekomst av mangan (Mn 2+ ) och under korrekta buffertförhållanden har Z05 både reverse transkriptas- och DNA-polymerasaktivitet 13,14. På så sätt kan både reverse transcription och PCR-amplifiering ske tillsammans med realtidsdetektion av amplicon. Extraherade prover tillsätts i amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (K-tubes) i vilka såväl reverse transcription som PCR-amplifiering sker. Reaktionsblandningen värms så att nedströmsprimern kan binda specifikt till HCV target RNA och till HCV QS RNA. Vid förekomst av Mn 2+ och överskott av deoxinukleotidtrifosfater (dntps), inklusive deoxiadenosin-, deoxiguanosin-, deoxicytidin- och deoxiuridintrifosfater förlänger Z05-polymeras bundna primers och bildar en DNA-sträng som är komplementär till RNA target. 05998212028-02SV 2 Doc Rev. 8.0

Amplifiering av target Efter reverse transcription av HCV target RNA och HCV QS RNA värms reaktionsblandningen av termocykeln i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 för att denaturera RNA:cDNA-hybriden och exponera de specifika primer-målsekvenserna. När blandningen svalnar binder primers till target DNA. Värmebeständigt Thermus specie Z05 DNA-polymeras (Z05) förlänger vid förekomst av Mn 2+ och överskott av deoxinukleosidtrifosfater (dntps), inklusive deoxiadenosin, deoxiguanosin, deoxicytidin och deoxiuridintrifosfater (istället för tymidin) bundna primers längs målmallarna och skapar en dubbelsträngad DNA-molekyl som kallas amplicon. Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 upprepar automatiskt proceduren ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Det erforderliga antalet cykler förprogrammeras i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48. Amplifiering sker endast i regionen för HCV-genomet mellan primers. Hela HCVgenomet amplifieras inte. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från provet kan göras med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet påvisar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 15, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA men finns däremot alltid i amplicon på grund av att deoxiuridintrifosfat används som en dntp i Master Mix-reagenset, varför endast amplicon innehåller deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzym före amplifiering av target DNA. Eventuella ickespecifika produkter som bildas efter den initiala aktiveringen av Master Mix genom mangan förstörs dessutom av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocykelsteget bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzymet är fortsatt inaktivt under en förlängd tidsperiod när det en gång har exponerats för temperaturer över 55 ºC, dvs. genom värmecykelstegen. Därför förstör inte enzymet target amplicon som bildas efter PCR-reaktion. Detektion av PCR-produkter i ett COBAS TaqMan -test I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test används PCR-teknik i realtid 16,17. Användning av prober märkta med två olika fluorokromer möjliggör realtidsdetektion av PCR-produktansamling genom övervakning av emissionsintensitet av reporterfluorokromer som frigörs under amplifieringen. Proberna består av HCVoch HCV QS-specifika oligonukleotidprober med en reporterfluorokrom och en quencherfluorokrom. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test märks HCV och HCV QS-proberna med olika reporterfluorokromer. Om proberna är intakta hämmas reporterfluorokromen av quencherfluorokromens närhet på grund av energiöverföringseffekter av Förster-typ. Medan PCR pågår hybridiseras proben till en målsekvens och klyvs med 5' 3' nukleasaktivitet hos värmebeständigt Z05 DNA-polymeras. När reporterfluorokromen och quencherfluorokromen har frigjorts och separerats avstannar quenching och den fluorescerande aktiviteten hos reporterfluorokromen ökar. Amplifiering av HCV RNA och HCV QS RNA mäts oberoende vid olika våglängder. Proceduren upprepas för ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt ökar emissionsintensiteten hos de enskilda reporterfluorokromerna, vilket ger oberoende identifiering av HCV RNA och HCV QS RNA. PCR-cykeln, där en tillväxtkurva startar exponentiell tillväxt, relateras till mängden startmaterial i början av PCR. Grundprinciper för COBAS TaqMan -testets kvantifiering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test är till sin natur kvantitativt i ett mycket dynamiskt intervall eftersom kontroll av amplicon sker under amplifieringens exponentiella fas. Ju högre provets HCV-titer är, desto tidigare når reporterfluorokromets flourescens i HCV-proben ovanför flourescensnivåns baslinje (se bild 1). Eftersom mängden HCV QS RNA är konstant mellan alla prover bör reporterflourokromens fluorescens i HCV QS-proben framträda under samma cykel för alla prover (se bild 2). I prover där QSfluorescensen påverkas justeras koncentrationen på motsvarande sätt. Framträdandet av de specifika fluorescenssignalerna rapporteras som ett kritiskt tröskelvärde (Ct). Ct definieras som det fraktionerade cykelnumret där reporterfluorokromens fluorescens överstiger en fastställd tröskel (angiven fluorescensnivå) och startar fasen med exponentiell tillväxt för signalen (se bild 3). Ett högre Ct-värde indikerar en låg titer hos det ursprungliga HCV-målmaterialet. En tvåfaldig ökning av titer korrelerar med en minskning med 1 Ct för target HCV RNA, medan en tiofaldig ökning av titer korrelerar med en minskning med 3,3 Ct. 05998212028-02SV 3 Doc Rev. 8.0

I bild 1 visas måltillväxtkurvan för en spädningsserie över ett 5-log 10 -intervall. När viruskoncentrationen ökar växlar tillväxtkurvorna till tidigare cykler. Därför motsvarar tillväxtkurvan längst till vänster den högsta virustiternivån medan tillväxtkurvan längst till höger motsvarar den lägsta virustiternivån. Bild 1 Normaliserad fluorescens Högsta titer Lägsta titer Cykelnummer I bild 2 visas Quantitation Standard-tillväxtkurvorna för prover från en virusspädningsserie som täcker ett 5-log 10 -intervall. Mängden Quantitation Standard som tillsätts i varje prov är konstant för varje reaktion. Ct-värdet för Quantitation Standard är likadant oberoende av virustitern. Bild 2 Normaliserad fluorescens Lägsta titer Högsta titer Cykelnummer 05998212028-02SV 4 Doc Rev. 8.0

I bild 3 visas ett exempel på hur fluorescensvärdena vid varje cykel normaliseras för varje tillväxtkurva. Det fraktionerade cykelnumret (Ct) beräknas där fluorescenssignalen korsar den angivna fluorescensnivån. Bild 3 Normaliserad fluorescens Angiven fluorescensnivå Ct-värde = 16,8 Cykelnummer HCV RNA-kvantifiering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test kvantifierar HCV-viralt RNA genom att utnyttja en andra målsekvens (HCV Quantitation Standard) som tillsätts i varje prov i känd koncentration. HCV QS är en icke smittbärande Armored RNA-konstruktion som innehåller fragment av HCV-sekvenser med primerbindningsregioner som är identiska med HCV-målsekvensen. HCV QS genererar en amplifieringsprodukt med samma längd- och baskomposition som HCV target RNA. Detektionsprobbindningsregionen för HCV QS har modifierats så att HCV QS -amplicon kan särskiljas från HCV target amplicon. Under annealingfasen för PCR-cykeln i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 belyses och exciteras proverna av filtrerat ljus och filtrerade emissionsfluorescensdata samlas in för varje prov. Avläsningarna från varje prov korrigeras sedan för instrumentella variationer. Fluorescensavläsningarna skickas automatiskt till AMPLILINK-programmet och sparas i en databas. Förkontroller används för att bestämma om HCV RNA- och HCV QS RNA-data motsvarar giltiga uppsättningar. Flaggor genereras när data ligger utanför de angivna gränserna. När alla förkontroller har utförts och avslutats startar fluorescensavläsningarna som genererar Ct-värden för HCV RNA och HCV QS RNA. De lotspecifika kalibreringskonstanterna som medföljer COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test används för beräkning av provernas och kontrollernas titervärde baserat på Ct-värdena för HCV RNA och HCV QS RNA. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test har standardiserats enligt WHO första internationella standard för hepatit C-virus RNA för NAT-testning (Nucleic Acid Amplification Technology Assays) (NIBSC 96/790) 18 och titerresultat rapporteras i internationella enheter (IU/ml). 05998212028-02SV 5 Doc Rev. 8.0

REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test (P/N: 03568547 190) HCV CS1 (Reagenskassett för HCV magnetiska glaspartiklar) Magnetiska glaspartiklar 93 % isopropanol Xi 93 % (viktprocent) isopropanol + HCMCAP 48 test 1 x 48 test Irriterande F h93 % (viktprocent) isopropanol Mycket brandfarligt HCV CS2 (HCV-lyseringsreagenskassett) Natriumcitrat-dihydrat 42,5 % guanidintiocyanat < 14 % polydokanol 0,9 % ditiotreitol Xn 42,5 % (viktprocent) guanidintiocyanat + 1 x 48 test Hälsoskadlig HCV CS3 HCV-multireagenskassett som innehåller: Pase (Proteinaslösning) Trisbuffert < 0,05 % EDTA Kaliumklorid Kalciumacetat 7,8 % proteinas Glycerol Xn 7,8 % (viktprocent) proteinas + 1 x 48 test 1 x 3,8 ml Hälsoskadlig EB 1 x 7,0 ml (Elueringsbuffert) Tris-bas-buffert 0,2 % metylparaben HCV CS4 1 x 48 test HCV-testspecifik reagenskassett som innehåller: HCV QS 1 x 3,6 ml (HCV kvantifieringsstandard) Trisbuffert EDTA < 0,002 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % Armored HCV RNA-konstruktion innehållande HCV-primerbindningssekvenser samt en unik probbindningsregion (icke smittbärande RNA i MS2-bakteriofag) 0,05 % natriumazid 05998212028-02SV 6 Doc Rev. 8.0

HCV MMX 1 x 2,5 ml (HCV huvudblandning) Tricinbuffert Kaliumacetat Kaliumhydroxid < 20 % dimetylsulfoxid Glycerol < 0,004 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,002 % uppströms- och nedströms-hcv-primers i 5'UTR-regionen av HCV < 0,001 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för HCV och HCV Quantitation Standard < 0,001% oligonukleotid-aptamer < 0,05 % Z05 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1% AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) 0,09 % natriumazid CAP/CTM Mn 2+ 1 x 19,8 ml (CAP/CTM manganlösning) < 0,5 % manganacetat Isättika 0,09 % natriumazid HCV H(+)C 4 x 1,0 ml (HCV-högpositiv kontroll) < 0,001 % Armored HCV RNA-konstruktion som innehåller HCV-sekvenser (icke-smittbärande RNA i MS2-bakteriofag) Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24-antigen och HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3-on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on + Irriterande R36/38: Irriterar ögonen och huden. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. HCV L(+)C (HCV-lågpositiv kontroll) < 0,001 % Armored HCV RNA-konstruktion som innehåller HCV-sekvenser (icke-smittbärande RNA i MS2-bakteriofag) Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24-antigen och HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3-on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on + 4 x 1,0 ml Irriterande R36/38: Irriterar ögonen och huden. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. 05998212028-02SV 7 Doc Rev. 8.0

CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (human plasma)] Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, HIV p24-antigen och HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3-on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on + 4 x 1,0 ml Irriterande R36/38: Irriterar ögonen och huden. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. HCV H(+)C Clip (HCV-högpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) HCV L(+)C Clip (HCV-lågpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) HCV ( ) C Clip (HCV-negativ kontroll, streckkodsmärkt klämma) 1 x 4 klämmor 1 x 4 klämmor 1 x 4 klämmor COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -tvättbuffert (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -tvättbuffert) Natriumcitrat-dihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Detta test är avsett att användas med humant serum eller plasma som samlats i EDTAantikoagulantia. C. Pipettera inte med munnen. D. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagenser. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagenser. E. Undvik mikrobiell och ribonukleassmitta av reagenserna när portioner tas från kontrollflaskor. F. Användning av sterila engångspipetter och RNase-fria pipettspetsar rekommenderas. G. Sammanför inte kontroller från olika loter eller från olika flaskor i samma lot. H. Blanda inte reagenskassetter eller kontroller från olika kit. I. Öppna inte kassetter från COBAS AmpliPrep eller byt ut, blanda, ta bort eller lägg till flaskor. J. Kassera oanvända reagenser, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. K. Använd inte kit efter utgångsdatum. L. Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla informationsblad om materialsäkerhet (MSDS). M. Prover och kontroller ska behandlas som smittbärande material i enlighet med exempelvis de laboratorierutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 19 och i CLSI-dokument M29-A3 20. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. OBS! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. N. VARNING: CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C innehåller human plasma som härstammar från humant blod. Källmaterialet har testats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikropp mot HIV-1/2 och HCV samt HIV p24-antigen. Testning av negativ human plasma med PCR-metoder visade inte något detekterbart HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Det finns inga 05998212028-02SV 8 Doc Rev. 8.0

testmetoder som ger fullständig säkerhet för att produkter från humant blod inte kan överföra smitta. Allt material av humant ursprung ska därför anses som potentiellt smittsamt. CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C ska hanteras som smittbärande material i enlighet med exempelvis de laboratorierutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 19 och i CLSI-dokument M29-A3 20. Rengör och desinficera noggrant alla arbetsytor med en färsk lösning som består av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. O. HCV QS, CAP/CTM Mn 2+ och HCV MMX innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. P. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar reagenser. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagenser ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. Q. Se till att inte HCV CS2 och vätskeavfall från instrumentet COBAS AmpliPrep som innehåller guanidintiocyanat kommer i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Dessa blandningar kan bilda en mycket giftig gas. R. Undvik all kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel) när använda COBAS AmpliPrep-SPU (Sample Processing Units) kasseras. Dessa blandningar kan bilda en mycket giftig gas. FÖRVARING OCH HANTERING A. Reagenser och kontroller får inte frysas. B. Förvara HCV CS1, HCV CS2, HCV CS3 och HCV CS4 i 2 8 ºC. Oanvända är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. Efter användning är reagenserna hållbara i 28 dagar i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. HCV CS1, HCV CS2, HCV CS3 och HCV CS4 kan användas för högst 4 instrumentcykler, upp till 64 timmar sammanlagt i instrumentet COBAS AmpliPrep. Reagenser ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentcykler. C. Förvara HCV H(+)C, HCV L(+)C och CTM ( ) C i 2 8 ºC. Dessa kontroller är hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska en eventuellt oanvänd del av innehållet kasseras. D. Förvara streckkodsmärkta klämmor [HCV H(+)C Clip, HCV L(+)C Clip och HCV ( ) C Clip] i 2 30 C. E. Förvara PG WR i 2 30 C. PG WR är hållbart till angivet utgångsdatum. Efter att förpackningen öppnats är reagenset hållbart i 28 dagar i 2 30 C, dock längst till angivet utgångsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test (P/N: 03568547 190) HCV CS1 (Reagenskassett för HCV magnetiska glaspartiklar) HCV CS2 (HCV-lyseringsreagenskassett) HCV CS3 (HCV-multireagenskassett) HCV CS4 (HCV-testspecifik reagenskassett) HCV H(+)C (HCV-högpositiv kontroll) HCV L(+)C (HCV-lågpositiv kontroll) CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (human plasma)] HCV H(+)C Clip (HCV-högpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) HCV L(+)C Clip (HCV-lågpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) HCV ( ) C Clip (HCV-negativ kontroll, streckkodsmärkt klämma) HCMCAP 05998212028-02SV 9 Doc Rev. 8.0

B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -tvättbuffert (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan -tvättbuffert) PG WR MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Instrument och programvara Instrumentet COBAS AmpliPrep Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 Tillval: Docking Station Tillval: Instrumentet cobas p 630 Programmet AMPLILINK, version 3.2-serien eller 3.3-serien Datastation för programmet AMPLILINK, med skrivare Om datastationen för programmet AMPLILINK installeras med programmet AMPLILINK, v3.2 eller v3.3-serien, ska följande handböcker användas: Instrumenthandbok till instrumentet COBAS AmpliPrep avsedd att användas med analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller instrumentet cobas p 630 samt programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan (plus tillvalet Docking Station) avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.2-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller Applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.3-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och instrumentet cobas p 630 Tillval: Användarhandbok till instrumentet cobas p 630, programversion 2.2 Engångsartiklar Sample Processing Units: SPUs S-tubes (Sample input tubes) med streckkodsklämmor (P/N: 03137040001) Rack för K-tips (P/N: 03287343001) K-tube, förpackning med 12 x 96 (P/N: 03137082001) ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Provrack (SK 24 rack) (P/N: 28122172001) Reagensrack (P/N: 28122199001) SPU-rack (P/N: 28122806001) K-tube-öppnare/tillslutare, motordriven (P/N: 03516539001) K-tube-öppnare/tillslutare (P/N: 03339874001) K-carrier (P/N: 28150397001) K-carrier-transportör (P/N: 03517519001) K-carrier-rack (P/N: 03286436001) Pipetter med RNase-fria spetsar och aerosolbarrär eller positiv förskjutning (kapacitet 1000 µl)* Engångshandskar, puderfria Vortexmixer * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. RNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas då så anges för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. 05998212028-02SV 10 Doc Rev. 8.0

PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. A. Provtagning COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test är avsett att användas med serum- eller plasmaprover. Blod ska uppsamlas i serumseparationsrören SST eller i sterila rör med EDTA (lila kork) som antikoagulant. Förvara helblod i 2 25 C i högst 6 timmar. Separera serum eller plasma från helblod inom 6 timmar efter provtagning genom centrifugering vid 800 1600 x g i 20 minuter i rumstemperatur. Överför serum eller plasma till ett sterilt polypropylenrör. I bild 4 och 5 visas stabilitetsdata från provtagningsstudier. Studierna utfördes med testet COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, version 2.0 (v2.0). Bild 4 HCV-stabilitet i helblod (serum) 7 < 1 timme 2-8 C Medelresultat HCV RNA Logg HCV RNA (UI/ml) 10 6 5 4 3 2 1 6 timmar 2-8 C 24 timmar 2-8 C 48 timmar 2-8 C 72 timmar 2-8 C < 1 timme 20-25 C 6 timmar 20-25 C 24 timer 20-25 C 48 timmar 20-25 C 0 1 2 3 4 5 Provnummer 72 timmar 20-25 C Bild 5 HCV-stabilitet i helblod (EDTA-plasma) Medelresultat HCV RNA Logg HCV RNA (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 < 1 timme 2-8 C 6 timmar 2-8 C 24 timmar 2-8 C 48 timmar 2-8 C 72 timmar 2-8 C < 1 timme 20-25 C 6 timmar 20-25 C 24 timer 20-25 C 48 timmar 20-25 C 0 11 12 13 14 15 Provnummer 72 timmar 20-25 C 05998212028-02SV 11 Doc Rev. 8.0

B. Transport av prover Vid transport av helblod, serum eller plasma ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas 21. Helblod ska transporteras i 2 25 C och centrifugeras inom 6 timmar efter provtagning. Serum eller plasma kan transporteras i 2 8 C eller fryst i 70 C eller kallare. C. Förvaring av prover Serum och plasmaprover kan förvaras i 2 8 C i högst 3 dygn eller frysas i 70 C eller kallare. Vi rekommenderar att prover förvaras i portioner om 1100 1200 µl i sterila 2,0 ml-polypropylenrör med skruvkork (t.ex. Sarstedt 72.694.006). I bild 6 och 7 visas stabilitetsdata från provförvaringsstudier. Studierna utfördes med testet COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. Bild 6 HCV-stabilitet i serum Medelresultat HCV RNA Logg HCV RNA (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 < 1 timme 2-8 C 72 timmar 2-8 C 120 timmar 2-8 C 168 timmar 2-8 C 240 timmar 2-8 C < 1 timme 20-25 C 72 timmar 20-25 C 120 timer 20-25 C 168 timmar 20-25 C 0 1 2 3 4 5 Provnummer 240 timmar 20-25 C Bild 7 HCV-stabilitet i EDTA-plasma Medelresultat HCV RNA Logg HCV RNA (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 0 11 12 13 14 15 Provnummer < 1 timme 2-8 C 72 timmar 2-8 C 120 timmar 2-8 C 168 timmar 2-8 C 240 timmar 2-8 C < 1 timme 20-25 C 72 timmar 20-25 C 120 timer 20-25 C 168 timmar 20-25 C 240 timmar 20-25 C Serum- och plasmaprover kan frysas och tinas högst två gånger utan förlust av HCV RNA. I tabell 1 visas data från dessa frys-tiningsstudier som utfördes med COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0. 05998212028-02SV 12 Doc Rev. 8.0

Tabell 1 Log 10 Skillnader i HCV-koncentration från cykel 0 för serum och EDTA-plasma som har frysts och tinats i 5 cykler Matris Stabilitet Frys-tiningscykler Provnr Cykel 0 Cykel 1 Cykel 2 Cykel 3 Cykel 4 Cykel 5 Serum 1 0,000 0,052 0,238 0,179 0,670 0,277 2 0,000 0,293 0,228 0,206 0,338 0,175 3 0,000 0,270 0,023 0,430 0,008 0,229 4 0,000 0,071 0,516 0,295 0,564 0,670 5 0,000 0,342 0,031 0,344 0,436 0,277 Genomsnitt serum 0,000 0,077 0,021 0,239 0,400 0,246 EDTA- 1 0,000 0,006 0,043 0,143 0,159 0,140 plasma 2 0,000 0,329 0,375 0,234 0,642 0,265 3 0,000 0,056 0,248 0,371 0,395 0,142 4 0,000 0,186 0,066 0,034 0,241 0,084 5 0,000 0,120 0,111 0,055 0,250 0,217 Genomsnitt EDTA-plasma 0,000 0,065 0,151 0,167 0,237 0,170 BRUKSANVISNING OBS! Detaljerad information om användning, vilka konfigurationer som kan väljas, utskrift av resultat samt tolkning av flaggor, kommentarer och felmeddelanden finns i (1) instrumenthandboken till instrumentet COBAS AmpliPrep avsedd att användas med analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller instrumentet cobas p 630 samt programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien; (2) instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan (plus tillvalet Docking Station) avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien; (3) instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien; (4) applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 och analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.3-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och instrumentet cobas p 630; (5) tillval: användarhandboken till instrumentet cobas p 630, programversion 2.2. Gruppstorlek: Varje kit innehåller reagenser som räcker till 48 test som kan utföras i grupper om 12 till 24 test. Minst en kontroll vardera av CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C måste ingå i varje grupp (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Arbetsflöde: Körningen med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 måste startas inom 120 minuter efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. OBS! De extraherade proverna och kontrollerna FÅR varken FRYSAS eller FÖRVARAS i 2 8 C. 05998212028-02SV 13 Doc Rev. 8.0

Prov- och kontrollextraktion OBS! Om frysta prover används ska proverna placeras i rumstemperatur tills de är helt tinade och vortexas i 3 5 sekunder innan de används. Kontrollerna ska tas bort från förvaringen i 2 8 C och värmas till rumstemperatur innan de används. Installera instrumentet COBAS AmpliPrep Del A. Underhåll och prime A1. Instrumentet COBAS AmpliPrep är färdigt att användas i standbyläge. A2. Slå på datastationen (ON) med programmet AMPLILINK. Förbered datastationen så här: a. Logga in på Windows XP. b. Dubbelklicka på programikonen AMPLILINK. c. Logga in på AMPLILINK-programmet genom att ange ditt användar-id och lösenord. A3. Kontrollera förrådet av PG WR med hjälp av fönstret Status och byt om det behövs. A4. Utför det underhåll som anges på fliken Due. Instrumentet COBAS AmpliPrep utför automatiskt prime på systemet. Del B. Ladda reagenskassetter OBS! Alla reagenskassetter ska tas bort från förvaringen i 2 8 C, omedelbart sättas in i instrumentet COBAS AmpliPrep och ekvilibreras till rumstemperatur i instrumentet i minst 30 minuter innan det första provet bearbetas. Ställ inte reagenskassetterna utanför instrumentet när de ska uppnå rumstemperatur eftersom kondens kan bildas på streckkodsetiketterna. Torka inte av kondensen om sådan uppstår på streckkodsetiketterna. B1. Placera HCV CS1 i ett reagensrack. Placera HCV CS2, HCV CS3 och HCV CS4 i ett separat reagensrack. B2. Ladda det reagensrack som innehåller HCV CS1 i rackposition A i instrumentet COBAS AmpliPrep enligt anvisningarna i instrumenthandboken till instrumentet COBAS AmpliPrep. B3. Ladda det reagensrack som innehåller HCV CS2, HCV CS3 och HCV CS4 i rackposition B, C, D eller E i instrumentet COBAS AmpliPrep (mer information finns i tabell 2). Del C. Ladda engångsartiklar OBS! Fastställ hur många COBAS AmpliPrep reagenskassetter, SPU (Sample Processing Units), Input Sample tubes (S-tubes), K-tips och K-tubes som behövs. En SPU, ett Input S-tube, en K-tip och ett K-tube behövs för varje prov eller kontroll. Du kan välja bland flera konfigurationer för användning av instrumentet COBAS AmpliPrep med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48. Se tabell 2 nedan. Sätt in det antal reagenskassettrack, provrack med Input S-tubes, SPU-rack, K-tip-rack, K-tube-rack och K-carriers i K-carrier-rack som krävs för aktuell konfiguration i respektive rackposition i instrumentet COBAS AmpliPrep (mer information finns i tabell 2). C1. Placera SPU i SPU-racken och ladda racken i rackposition J, K eller L i instrumentet COBAS AmpliPrep. C2. Ladda fyllda K-tube-rack i rackposition M, N, O eller P enligt aktuell konfiguration i instrumentet COBAS AmpliPrep. C3. Ladda fyllda K-tip-rack i rackposition M, N, O eller P i instrumentet COBAS AmpliPrep enligt anvisningarna i instrumenthandboken till instrumentet COBAS AmpliPrep. C4. Om konfiguration 3 till 5 används med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 ska K-carriers laddas i K-carrier-rack i rackposition M, N, O eller P i instrumentet COBAS AmpliPrep. 05998212028-02SV 14 Doc Rev. 8.0

1. 2. 3. & 4. 5. Tabell 2 Möjliga konfigurationer för användning av instrumentet COBAS AmpliPrep med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 Konfiguration Instrumentet COBAS AmpliPrep plus Docking Station plus analysinstrumentet COBAS TaqMan Instrumentet COBAS AmpliPrep plus analysinstrumentet COBAS TaqMan Instrumentet COBAS AmpliPrep plus 1-2 analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Instrumentet COBAS AmpliPrep plus analysinstrumentet COBAS TaqMan plus analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Överföringsläge till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 Automatisk överföring av K-carrier Manuell överföring av K-tubes via provrack till analysinstrumentet COBAS TaqMan Manuell överföring av K-carrier via K-carrier-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Manuell överföring av K-tubes i prov-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan. Manuell överföring av K-carrier via K-carrier-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Rack, carriers och engångsartiklar K-tubes i fulla K-tube-rack K-tips i fulla K-tip-rack Input S-tubes som innehåller patientprover och kontroller i provrack SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack CS2, CS3, CS4 i kassettrack K-tubes i fulla K-tube-rack K-tips i fulla K-tip-rack Input S-tubes i provrack SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack CS2, CS3, CS4 i kassettrack När provextraktionen har slutförts: K-tubes i provrack (färdiga för manuell överföring) K-tubes i provrack K-tips i fulla K-tip-rack Input S-tubes i provrack SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack CS2, CS3, CS4 i kassettrack Tom K-carrier med streckkod i K-carrier-rack När provextraktionen har slutförts: K-tubes i K-carrier i K-carrier-rack Samma som konfiguration 2 och 3 Position i instrumentet COBAS AmpliPrep M-P M-P F-H J-L A B-E M-P M-P F-H J-L A B-E Samma som ovan (F H) F-H M-P F-H J-L A B-E M-P Samma som ovan (M-P) Samma som konfiguration 2 och 3 05998212028-02SV 15 Doc Rev. 8.0

Del D. Beställa och ladda prover D1. Bered provrack på följande sätt: Fäst en streckkodsklämma i de provrackspositioner där ett prov (S-tube) ska placeras. Anslut en av de specifika streckkodsklämmorna för kontroller [CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C] till de provrackspositioner där kontrollerna (S-tube) ska placeras. Streckkodsklämmorna för kontroller ska ha samma kontrollotsnummer som lotnumret på kontrollflaskorna i kitet. Var noga med att tilldela varje kontroll positionen med motsvarande kontrollstreckkodsklämma. Placera ett Input S-tube i varje position som är märkt med en streckkodsklämma. D2. Skapa provbeställningar för varje prov och kontroll på fliken Sample i fönstret Orders i programmet AMPLILINK. Välj lämplig testfil och avsluta genom att spara. D3. Tilldela prov- och kontrollbeställningarna rackpositioner på fliken Sample Rack i fönstret Orders. Provracksnumret måste gälla det rack som bereddes i steg D1. D4. Skriv ut Sample Rack Order som ett arbetsblad. D5. Bered prov- och kontrollrack i det område som är avsett för överföring av prover och kontroller på följande sätt: Vortexa varje prov och kontroll [CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C] i 3 till 5 sekunder. Undvik att förorena handskarna när du hanterar prover och kontroller. D6. Överför 1000 till 1050 µl av varje prov och kontroll [CTM ( ) C, HCV L(+)C och HCV H(+)C] i rätt streckkodsmärkta Input S-tube med hjälp av en mikropipett med RNase-fri spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Undvik att överföra partiklar och/eller fibrinkoagel från ursprungsproverna till Input S-tube. Prover och kontroller ska överföras till de rörpositioner som tilldelats och antecknats på arbetsbladet i steg D4. Streckkodsklämmorna för kontroller ska ha samma kontrollotsnummer som lotnumret på kontrollflaskorna i kitet. Tilldela varje kontroll positionen med motsvarande kontrollstreckkodsklämma. Undvik att kontaminera den övre delen av S-tube med prover eller kontroller. D7. Läs användarhandboken till instrumentet cobas p 630 om du använder cobas p 630 för extraktion. D8. Om konfiguration 1 eller 2 används ska provracken som är fyllda med Input S-tubes placeras i rackpositionen F, G eller H i instrumentet COBAS AmpliPrep. D9. Om konfiguration 3 till 5 används med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 ska provracken laddas med Input S-tubes och K-tubes (ett för varje Input S-tube, i rätt position intill Input S-tubes) i rackposition F, G eller H i instrumentet COBAS AmpliPrep. Del E. Starta körning med instrumentet COBAS AmpliPrep E1. Starta instrumentet COBAS AmpliPrep med hjälp av programmet AMPLILINK. Del F. Avsluta körning med instrumentet COBAS AmpliPrep och överföring till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 (endast för konfiguration 2 5) F1. Kontrollera om det finns flaggor eller felmeddelanden. F2. Ta bort extraherade prover och kontroller från instrumentet COBAS AmpliPrep, antingen i provrack (för analysinstrumentet COBAS TaqMan utan Docking Station) eller i K-carrier-rack (för analysinstrumentet COBAS TaqMan 48) enligt aktuell konfiguration (mer information finns i del G). F3. Avlägsna avfall från instrumentet COBAS AmpliPrep. OBS! Alla extraherade prover och kontroller ska skyddas mot ljus efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. 05998212028-02SV 16 Doc Rev. 8.0

Amplifiering och detektion Installera analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 Körningen med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 måste startas inom 120 minuter efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. OBS! De extraherade proverna och kontrollerna FÅR varken FRYSAS eller FÖRVARAS i 2 8 C. Del G. Ladda bearbetade prover G1. Överför K-tubes till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 genom att utföra de steg som krävs för den instrumentkonfiguration som används: Konfiguration 1: Automatisk överföring av K-carrier via Docking Station till analysinstrumentet COBAS TaqMan. Det krävs inga manuella insatser. Konfiguration 2 och 5: Manuell överföring av K-tubes i provrack till analysinstrumentet COBAS TaqMan Konfiguration 3, 4 och 5: Manuell överföring av K-carrier i K-carrier-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Manuell överföring av K-carriers till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 med hjälp av K-Carriertransportören. Del H. Starta körning med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 H1. Starta analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 med ett av alternativen nedan beroende på vilken konfiguration som används: Konfiguration 1: Inga insatser krävs. Konfiguration 2 och 5: Automatisk start av analysinstrumentet COBAS TaqMan efter insättning av provrack. Konfiguration 3, 4 och 5: Fyll K-carrier med tomma K-tubes om det finns färre än 6 K-tubes på K-carriern. Du får information om hur det ska göras av programmet AMPLILINK. Öppna termocykelskyddet, sätt in K-carriern i termocykeln och stäng locket. Starta körningen med COBAS TaqMan 48 Analyzer. Del I. Avsluta körning med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 I1. När körningen i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48 har slutförts ska resultatrapporten skrivas ut. Kontrollera om det finns flaggor eller felmeddelanden i resultatrapporten. Hur prover med flaggor och kommentarer ska tolkas beskrivs i avsnittet Resultat. Efter att data har godkänts ska de sparas. I2. Ta bort använda K-tubes från analysinstrumentet COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48. RESULTAT HCV RNA-koncentrationen för proverna och kontrollerna fastställs automatiskt i COBAS TaqMan Analyzer eller COBAS TaqMan 48 Analyzer. HCV RNA-koncentrationen uttrycks i internationella enheter (IU)/ml. Programmet AMPLILINK: Bestämmer cykeltröskelvärdet (Ct) för HCV RNA och HCV QS RNA. Fastställer HCV RNA-koncentrationen baserat på Ct-värdena för HCV RNA och HCV QS RNA samt de lotspecifika kalibreringskoefficienter som anges på kassettens streckkod. Fastställer att beräknat IU/ml för HCV L(+)C och HCV H(+)C ligger inom tilldelat intervall. Gruppvalidering AMPLILINK version 3.2-serien Försäkra dig om att gruppen är giltig genom att kontrollera om det förekommer flaggor eller kommentarer i utskriften eller i resultatfönstret i programmet AMPLILINK. För kontrollbeställningar utförs en kontroll för att bestämma om kontrollens IU/ml-värde ligger inom dess angivna intervall. Om kontrollens IU/ml-värde ligger utanför intervallet genereras en flagga som visar att kontrollen har misslyckats. Gruppen är giltig om inga flaggor visas för någon av kontrollerna [HCV L(+)C, HCV H(+)C och CTM ( ) C]. 05998212028-02SV 17 Doc Rev. 8.0

Gruppen är inte giltig om någon av följande flaggor visas för HCV-kontrollerna: Negativ kontroll: Flagga Resultat Betydelse Ett ogiltigt resultat eller ett N_NC_INVALID Invalid giltigt resultat som inte var negativt för HCV target HCV-lågpositiv kontroll: Flagga Resultat Betydelse L_LPCINVALID < 1.50E+01 IU/mL Kontrollen under intervallet L_LPCINVALID Target Not Detected Kontrollen under intervallet L_LPCINVALID En numerisk titer, X.XXE+XX IU/mL Kontrollen utanför intervallet L_LPCINVALID > 6.90E+07 IU/mL Kontrollen över intervallet L_LPCINVALID Invalid Ett ogiltigt resultat HCV-högpositiv kontroll: Flagga Resultat Betydelse H_HPCINVALID < 1.50E+01 IU/mL Kontrollen under intervallet H_HPCINVALID Target Not Detected Kontrollen under intervallet H_HPCINVALID En numerisk titer, X.XXE+XX IU/mL Kontrollen utanför intervallet H_HPCINVALID > 6.90E+07 IU/mL Kontrollen över intervallet H_HPCINVALID Invalid Ett ogiltigt resultat Om gruppen är ogiltig måste du upprepa hela körningen inklusive prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion. Gruppvalidering AMPLILINK version 3.3-serien Försäkra dig om att gruppen är giltig genom att kontrollera om det förekommer flaggor eller kommentarer i utskriften eller i resultatfönstret i programmet AMPLILINK. För kontrollbeställningar utförs en kontroll för att bestämma om kontrollens IU/ml-värde ligger inom dess angivna intervall. Om kontrollens IU/ml-värde ligger utanför intervallet genereras en flagga som visar att kontrollen har misslyckats. Gruppen är giltig om inga flaggor visas för någon av kontrollerna [HCV L(+)C, HCV H(+)C, CTM ( ) C]. Gruppen är inte giltig om någon av följande flaggor visas för HCV-kontrollerna: Negativ kontroll: Flagga Resultat Betydelse Ett ogiltigt resultat eller ett giltigt NC_INVALID Invalid resultat som inte var negativt för HCV target HCV-lågpositiv kontroll Flagga Resultat Betydelse Ett ogiltigt resultat eller en kontroll LPCINVALID Invalid som ligger utanför intervallet 05998212028-02SV 18 Doc Rev. 8.0

HCV-högpositiv kontroll: Flagga Resultat Betydelse Ett ogiltigt resultat eller en kontroll HPCINVALID Invalid som ligger utanför intervallet Om gruppen är ogiltig måste du upprepa hela körningen inklusive prov- och kontrollextraktion, reverse transcription, amplifiering och detektion. Tolkning av resultat: För att hela gruppen ska anses vara giltig ska varje enskilt prov kontrolleras avseende flaggor eller kommentarer på resultatutskriften. Tolka resultaten så här: En giltig grupp kan innehålla båda giltiga och ogiltiga provresultat, beroende på om flaggor och/eller kommentarer erhålls för de enskilda proverna. Provresultaten tolkas på följande sätt: Titerresultat Target Not Detected Betydelse Ct-värde för HCV ovanför gränsen för analysen eller inget Ct-värde har erhållits för HCV. Rapportera resultat som HCV RNA inte detekterat. < 1.50E+01 IU/mL Beräknat IU/ml ligger under analysens detektionsgräns. Rapportera resultat som HCV RNA detekterat, mindre än 15 HCV RNA IU/ml. Beräknade IU/ml-resultat ligger under den lägre gränsen för analysens 1.50E+01 IU/mL och linjära intervall. Dessa resultat har en hög grad av variation och kan därför < 4.30E+01 IU/mL inte anses vara korrekta. Dessa resultat ska tolkas med försiktighet. 4.30E+01 IU/mL och Beräknade resultat som är större än eller lika med 43 IU/ml och mindre 6.90E+07 IU/mL än eller lika med 6,90E+07 IU/ml ligger inom analysens linjära intervall. > 6.90E+07 IU/mL Beräknat IU/ml ligger över analysens intervall. Rapportera resultat som större än 6,90E+07 HCV RNA IU/ml. Om kvantitativa resultat önskas ska det ursprungliga provet spädas med HCV-negativt humant serum eller EDTA-plasma beroende på det ursprungliga provets matris och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. OBS! OBS! OBS! Prover som ligger ovanför analysens intervall och som genererar ett ogiltigt resultat med flaggan QS_INVALID ska inte rapporteras som >6.90E+07 IU/mL. Det ursprungliga provet ska spädas med HCV-negativ human EDTA-plasma och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. Titerresultat Failed. Betydelse: Provet bearbetades inte på rätt sätt vid extraktionen i instrumentet COBAS AmpliPrep. Titerresultat Invalid. Betydelse: Ett ogiltigt resultat. KVALITETSKONTROLL En COBAS TaqMan negativ kontroll, en HCV-lågpositiv kontroll och en HCV-högpositiv kontroll måste ingå i varje testgrupp. Gruppen är giltig om inga flaggor visas för någon av kontrollerna [HCV L(+)C, HCV H(+)C och CTM ( ) C]. Det finns inga krav avseende kontrollernas position i provracket. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att gruppen är giltig. Negativ kontroll CTM ( ) C måste ge ett Target Not Detected -resultat. Om CTM ( ) C flaggas som ogiltig, är hela gruppen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Om CTM ( ) C är konsekvent ogiltig i flera grupper ska du kontakta din Roche-representant och begära teknisk hjälp. Positiva kontroller Det tilldelade värdet för HCV L(+)C och HCV H(+)C är unikt för varje reagenslot och anges på reagenskassettens streckkod i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test. HCV RNA IU/ml för HCV L(+)C och HCV H(+)C ska ligga inom tilldelat intervall. Om den ena eller båda av de positiva kontrollerna flaggas som ogiltig är hela gruppen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om HCV RNA-titern för en eller båda positiva kontrollerna konsekvent ligger utanför det tilldelade intervallet i flera grupper. 05998212028-02SV 19 Doc Rev. 8.0