72 Tests P/N: CMV Test. 5.1 Liters P/N: Wash Reagent

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent AVSEDD ANVÄNDNING Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV är ett in vitro-test baserat på nukleinsyraamplifiering för kvantifiering av cytomegalovirus DNA i human EDTA-plasma med instrumentet COBAS AmpliPrep för automatisk provextraktion och analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 för automatisk amplifiering och detektion. Med testet kan CMV DNA kvantifieras i intervallet kopior/ml. En kopia av CMV DNA (enligt definitionen i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) motsvarar 0,91 internationella enheter (IU) [1,1 kopior/iu] baserat på WHO:s första internationella standard för humant cytomegalovirus för NAT-testning (Nucleic Acid Amplification Techniques) (NIBSC 09/162) 40. Testet är avsett att användas i kombination med klinisk bedömning och andra laboratoriemarkörer vid diagnos och hantering av CMV-infektion hos patienter där risk för CMV-sjukdom föreligger. Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV är inte avsett att användas som screeningtest för förekomst av CMV i blod, blodprodukter eller som ett diagnostiskt test för att bekräfta förekomst av CMV-infektion. Resultaten från testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV måste tolkas med hänsyn till alla relevanta kliniska fynd och laboratoriefynd. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Humant cytomegalovirus (HCMV eller CMV) är en human viruspatogen som tillhör familjen herpesvirus och som finns både i det moderna industrisamhället och i isolerade urbefolkningar. 1,2 Det kan överföras via blod, saliv, urin, livmoders- och vaginasekret, sädesvätska, bröstmjölk, tårar och exkrement. 3-9 Primärinfektion med CMV hos immunkompetenta individer är vanligtvis asymptomatisk och ger ofta upphov till oupptäckta latenta infektioner. Perifera mononukleära blodceller och endotelceller framstår som de huvudsakliga infektionsställena. CMV förblir i en latent fas i monocyter/makrofager hos människor. 2 Kroniskt infekterade personer kan ha viruset i sina kroppsvätskor och på så sätt smitta andra. Personer med nedsatt immunförsvar, inklusive spädbarn, transplantationspatienter och AIDS-patienter, löper stor risk att utveckla allvarliga CMV-infektioner som kan leda till högre sjuk- och dödstal. 10 Allvarliga kliniska tecken på CMV-sjukdom innefattar CMV-syndrom, retinit, gastroenterit, hepatit, encefalit, esofagit, enterokolit, pankreatit och pneumoni Laboratoriemetoderna för diagnos av utbredd infektion och aktiv målorganskada på grund av humant cytomegalovirus omfattar isolering av virus genom odling från perifera vita blodkroppar (PBL), histologi av biopsier, serologiska metoder, mätning av pp65- antigen samt detektion av CMV DNA med PCR-teknik (Polymerase Chain Reaction). 14 Analysmetoder med cellodling har dåligt prediktivt värde; de kräver 48 timmar till 3 veckor för resultat och har begränsad nytta, i synnerhet för patienter med nedsatt immunförsvar. Antigenemi-analysen pp65 är arbetskrävande och fordrar att blodet bearbetas inom sex timmar efter provtagning på grund av minskad antigenemi vid förvaring. 15,22 Dessutom är pp65-analysen komplicerad att utföra på svårt neutropena patienter. Positiva resultat för CMV DNA i plasma med hjälp av PCR-teknik har visat sig korrelera väl med positivitet vid cellodling av vita blodkroppar och med ökad risk för utvecklande av CMV-sjukdom. Ett antal studier har visat sambandet mellan CMV-virusmängd och risken för utvecklande av CMV-sjukdom Risken för CMV-sjukdom kännetecknas av hög virusmängd, vilken understryker virusmängdens viktiga roll vid sjukdomspatogenes. 18,27,30,31 Studier om transplantationsmottagare samt AIDS-patienter har visat att PCR-detektion av CMV DNA har stor betydelse när det gäller att förutsäga påföljande sjukdomsutveckling och sjukdomens kliniska utfall. 17,23-26 Kvantitativa bedömningar av CMV DNA-nivåer har visat att höga virusmängder, samt ökning av virusmängd över tid, korrelerarar med en dålig klinisk prognos för ett antal CMV-risktillstånd. 18,27,28 Med kvantitativa PCR-analyser kan man även se hur effektiv antivirusbehandlingen är och indirekt bedöma virusresistansen. 26,29,30,32 Mätning av CMV-virusmängd rekommenderas enligt gällande behandlingsriktlinjer vid transplantationer av solida organ för att övervaka patienter med risk att utveckla CMV-sjukdom och med behov av förebyggande behandling och för att övervaka hur patienter med aktiv CMV-sjukdom svarar på behandling. 21,22 Det rekommenderas också som ett diagnoskriterium för identifikation av CMV-sjukdom hos personer som tar emot hematopoetiska stamceller vid transplantation. 33 Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet SV 1 Doc Rev. 5.0

2 ANVÄNDNINGSPRINCIPER Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV är ett nukleinsyraamplifieringstest för kvantifiering av cytomegalovirus (CMV) DNA i human plasma. Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV baseras på två grundläggande principer: (1) provextraktion för att isolera CMV DNA och (2) samtidig PCR-amplifiering av målsekvens-dna och detektion av klyvd dubbelmärkt oligonukleotiddetektionsprob som är målspecifika. Med testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV kan automatisk extraktion utföras följt av automatisk PCR-amplifiering och detektion av CMV målsekvens-dna och CMV QS (Quantitation Standard) DNA. Master Mix-reagenset innehåller primers och prober som är specifika både för CMV DNA och CMV QS DNA. Detektion av amplifierat DNA utförs med hjälp av målspecifika och kvantifieringsstandardspecifika dubbelmärkta oligonukleotidprober som tillåter oberoende identifiering av CMV-amplicon och CMV QS-amplicon. Kvantifieringen av CMV-virus DNA utförs med hjälp av CMV QS. Den kompenserar för hämningseffekter och kontrollerar extraktionen och amplifieringen så att kvantifieringen av CMV DNA blir korrekt i varje prov. CMV QS är en icke smittbärande DNA-konstruktion som innehåller likadana primerbindningsställen som CMV målsekvens-dna och en unik probbindningsregion som gör att CMV QS-amplicon kan särskiljas från CMV target amplicon. CMV QS tillsätts i varje prov med känt antal kopior och genomgår alla steg i extraktion, samtidig PCR-amplifiering och detektion av klyvda dubbelmärkta oligonukleotidprober. Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 beräknar CMV DNA-koncentrationen i testproverna genom att jämföra CMV-signalen med CMV QS-signalen för varje prov och kontroll. Val av målsekvens Generisk kiselbaserad extraktion används för isolering av CMV DNA och CMV QS DNA, och definierade oligonukleotider används som primers för amplifiering av CMV DNA och CMV QS DNA. En målspecifik och en QS-specifik dubbelmärkt oligonukleotidprob möjliggör oberoende identifiering av CMV-amplicon och CMV QS-amplicon. I testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV används två amplifieringsprimers för PCR. En signal som genererar dubbelmärkt prob hybridiserar till en av de två strängarna och klyvs av Z05 DNA-polymeras under primer-extension. Extraktion I testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV används en generisk kiselbaserad isoleringsteknik vid den automatiska extraktionen i instrumentet COBAS AmpliPrep. Vid proceduren krävs 500 μl plasma. CMV-viruspartiklarna lyseras genom inkubering i förhöjd temperatur med en proteas- och kaotropisk lyserings-/bindningsbuffert som frigör nukleinsyror och skyddar det frigjorda CMV DNA mot DNaser i plasma. Proteas och ett känt antal CMV QS DNA-molekyler tillsätts i varje prov tillsammans med lyseringsreagenset och magnetiska glaspartiklar. Därefter inkuberas blandningen och CMV DNA och CMV QS DNA binds till de magnetiska glaspartiklarnas yta. Obundna ämnen, t.ex. salter, proteiner och andra cellulära föroreningar tas bort när de magnetiska glaspartiklarna tvättas. När de magnetiska glaspartiklarna har separerats och tvättningen är klar elueras de adsorberade nukleinsyrorna i förhöjd temperatur med en vattenbaserad lösning. Det extraherade provet, som innehåller det frigjorda CMV DNA och CMV QS DNA, läggs till i amplifieringsblandningen och överförs till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. PCR-amplifiering PCR-amplifieringsreaktionen utförs med det värmebeständiga rekombinanta enzymet Thermus specie Z05 DNA-polymeras (Z05), som vid förekomst av magnesium (Mg 2+ ) och under lämpliga buffertförhållanden har DNA-polymerasaktivitet. 34 Detta gör att PCR-amplifiering kan ske tillsammans med realtidsdetektion av amplicon. Extraherade prover tillsätts till amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (K-tubes) där PCR-amplifiering sker. Vid förekomst av Mg 2+ och överskott av deoxinukleotidtrifosfater (dntps), inklusive deoxiadenosin-, deoxiguanosin-, deoxicytidin-, deoxiuridinoch deoxitymidintrifosfater förlänger Z05-polymeras bundna primers och bildar DNA-strängar. Målsekvensamplifiering Med termocyklern i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 värms reaktionsblandningen så att den dubbelsträngade DNA-kedjan denatureras och de specifika primer-målsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder primers till målsekvens-dna. I närvaro av Mg 2+ och överskott av deoxinukleotidtrifosfater (dntps), förlänger Z05 DNA-polymeras bundna primers längs måltemplatet och producerar dubbelsträngade DNA-molekyler som kallas amplicon. Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 upprepar automatiskt proceduren ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Det erforderliga antalet cykler förprogrammeras i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Amplifiering förekommer endast i regionen för CMV-genomet mellan primers; hela genomet amplifieras inte SV 2 Doc Rev. 5.0

3 Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från provet kan göras med testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet påvisar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 35, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA men finns däremot alltid i amplicon på grund av att deoxiuridintrifosfat används som en dntp i Master Mix-reagenset, varför endast amplicon innehåller deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzymet före amplifiering av målsekvens-dna. Eventuella ickespecifika produkter som bildas efter den initiala aktiveringen av Master Mix genom magnesium förstörs dessutom av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocyklersteget bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzymet förblir inaktivt under en förlängd tidsperiod när det en gång har exponerats för temperaturer över 55 C, dvs. genom termocyklerstegen, och förstör därför inte target amplicon som bildas under amplifiering. Detektion av PCR-produkter i ett COBAS TaqMan -test I testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV används realtids-pcr 36,37. Användning av prober märkta med två olika fluorokromer möjliggör realtidsdetektion av PCR-produktansamling genom monitorering av emissionsintensitet av reporterfluorokromer som frigörs under amplifieringen. Proberna består av CMV- och CMV QS-specifika oligonukleotidprober med en reporterfluorokrom och en quencherfluorokrom. I testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV märks CMV och CMV QSproberna med olika reporterfluorokromer. Om proberna är intakta hämmas reporterfluorokromen av quencherfluorokromens närhet på grund av energiöverföringseffekter av Förster-typ. Medan PCR pågår hybridiseras proben till en målsekvens och klyvs med 5' 3' nukleasaktivitet hos det värmestabila Z05 DNA-polymeraset. När reporterfluorokromen och quencherfluorokromen har frigjorts och separerats förhindras quenching och den fluorescerande aktiviteten hos reporterfluorokromen ökar. Amplifiering av CMV DNA och CMV QS DNA mäts oberoende vid olika våglängder. Proceduren upprepas för ett bestämt antal cykler, varvid varje cykel effektivt ökar emissionsintensiteten hos de enskilda reporterfluorokromerna, vilket ger oberoende identifiering av CMV DNA och CMV QS DNA. Den PCR-cykel där den exponentiella tillväxtkurvan startar korrelerar med mängden startmaterial i början av PCR. Grundprinciper för COBAS TaqMan -testets kvantifiering Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV är kvantitativt i ett mycket brett dynamiskt intervall eftersom monitorering av amplikon sker under amplifieringens exponentiella fas. Ju högre provets CMV-titer är, desto tidigare når reporterfluorokromets flourescens i CMV-proberna ovanför flourescensnivåns baslinje (se bild 1). Eftersom mängden CMV QS DNA är konstant i alla prover bör reporterfluorokromens fluorescens i CMV QS-proben framträda under en liknande cykel för alla prover (se bild 2). I prover där QS-fluorescensen påverkas justeras koncentrationen på motsvarande sätt. Framträdandet av de specifika fluorescenssignalerna rapporteras som ett kritiskt tröskelvärde (Ct). Ct definieras som det fraktionerade cykelnumret där reporterfluorokromens fluorescens överstiger en fastställd tröskel (angiven fluorescensnivå) och startar fasen med exponentiell tillväxt för signalen (se bild 3). Ett högre Ct-värde indikerar en låg titer hos det ursprungliga CMV-målmaterialet. En tvåfaldig ökning av titer korrelerar generellt med en minskning med 1 Ct för target CMV DNA, medan en tiofaldig ökning av titer korrelerar med en minskning med 3,3 Ct. I bild 1 visas exempel på måltillväxtkurvor för en spädningsserie över ett 5-log 10 -intervall. När viruskoncentrationen ökar växlar tillväxtkurvorna till tidigare cykler. Därför motsvarar tillväxtkurvan längst till vänster den högsta virustiternivån medan tillväxtkurvan längst till höger motsvarar den lägsta virustiternivån. Bild 1 Måltillväxtkurvor för en spädningsserie av virus som sträcker sig över ett 5-log 10 -intervall Normaliserad fluorescens Högsta titer Lägsta titer Cykelnummer SV 3 Doc Rev. 5.0

4 I bild 2 visas exempel på Quantitation Standard-tillväxtkurvor för prover från en virusspädningsserie som täcker ett 5-log 10 - intervall. Mängden Quantitation Standard som tillsätts i varje prov är konstant för varje reaktion. Ct-värdet för Quantitation Standard är likadant oberoende av virustitern. Bild 2 Quantitation Standard-tillväxtkurvor för en spädningsserie av virus som sträcker sig över ett 5-log 10 -intervall Normaliserad fluorescens Lägsta titer Högsta titer Cykelnummer I bild 3 visas ett exempel på hur fluorescensvärdena vid varje cykel normaliseras för varje tillväxtkurva. Det fraktionerade cykelnumret (Ct) beräknas där fluorescenssignalen korsar den angivna fluorescensnivån. Bild 3 Fluorescensvärdena vid varje cykel normaliseras för varje tillväxtkurva Normaliserad fluorescens Angiven fluorescensnivå Ct-värde = 27,3 Cykelnummer SV 4 Doc Rev. 5.0

5 CMV DNA-kvantifiering Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV kvantifierar viralt CMV DNA genom att utnyttja en andra målsekvens (CMV Quantitation Standard) som tillsätts i varje prov i känd koncentration. CMV QS är en icke smittbärande DNA-konstruktion som innehåller fragment av CMV-sekvenser med primerbindningsregioner som är identiska med CMV-målsekvensen. CMV QS innehåller CMV-primerbindningsregioner och genererar en amplifieringsprodukt med samma längd- och baskomposition som CMV target DNA. Detektionsprobbindningsregionen för CMV QS har modifierats så att CMV QS-amplicon kan särskiljas från CMV target-amplicon. Under bindningsfasen för PCR-cykeln i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 belyses och exciteras proverna av filtrerat ljus och filtrerade emissionsfluorescensdata samlas in för varje prov. Avläsningarna från varje prov korrigeras sedan för instrumentella variationer. Fluorescensavläsningarna skickas automatiskt till programmet AMPLILINK och sparas i en databas. Förkontroller används för att bestämma om CMV DNA- och CMV QS DNA-data motsvarar giltiga värden, och flaggor genereras när data ligger utanför de angivna gränserna. När alla förkontroller har utförts och avslutats startar fluorescensavläsningarna som genererar Ct-värden för CMV DNA och CMV QS DNA. De lotspecifika kalibreringskonstanterna som medföljer testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV används för beräkning av provernas och kontrollernas titervärde baserat på Ct-värdena för CMV DNA och CMV QS DNA. Titerresultat anges i internationella enheter/ml (IU/ml) eller kopior/ml (cp/ml). REAGENS COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (Reagenskassett för magnetiska glaspartiklar) Magnetiska glaspartiklar Tris-bas-buffert 0,09 % natriumazid 0,1 % metylparaben CMV CS2 (CMV-lyseringsreagenskassett) Natriumcitrat-dihydrat 42,5 % guanidintiocyanat 3,6 % polydokanol 1,8 % ditiotreitol Xn 42,5 % (viktprocent) guanidintiocyanat CMVCAP 72 test 1 x 72 test 1 x 72 test Hälsoskadlig R20/21/22-R52/53-R32: Farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Skadligt för vattenlevande organismer, kan orsaka skadliga långtidseffekter i vattenmiljön. Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. S24/25-S36/37/39-S61: Undvik kontakt med huden och ögonen. Använd lämpliga skyddskläder och skyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Undvik utsläpp till miljön. Läs särskilda instruktioner/varuinformationsblad SV 5 Doc Rev. 5.0

6 CMV CS3 CMV-multireagenskassett som innehåller: Pase (Proteinaslösning) Trisbuffert < 0,05 % EDTA Kaliumklorid Kalciumacetat 7,8 % proteinas Glycerol Xn 7,8 % (viktprocent) proteinas 1 x 72 test 1 x 3,8 ml Hälsoskadlig R36-R42: Irriterar ögonen. Kan ge allergi vid inandning. S23-S45: Undvik inandning av ånga. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. EB (Elueringsbuffert) Tris-bas-buffert Natriumhydroxid 0,09 % natriumazid CMV CS4 CMV-testspecifik reagenskassett som innehåller: CMV QS (CMV kvantifieringsstandard) Tris-HCl-buffert EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % icke smittbärande plasmid-dna (mikrobiell) innehållande CMVprimerbindningsekvenser och en unik probbindningsregion 0,05 % natriumazid CMV MMX (CMV Master Mix) Tricinbuffert Kaliumacetat Kaliumhydroxid < 20 % dimetylsulfoxid Glycerol < 0,05 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01 % uppströms- och nedströms-cmv-primers < 0,01 % oligonukleotid-aptamer < 0,01 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för CMV och CMV Quantitation Standard < 0,05 % Z05 DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) 0,09 % natriumazid MgCl 2 (CAP/CTM magnesiumlösning) < 0,6 % magnesiumklorid 0,09 % natriumazid 1 x 8,1 ml 1 x 72 test 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml SV 6 Doc Rev. 5.0

7 CMV H(+)C (CMV-högpositiv kontroll) < 0,001 % lambda-fag innehållande CMV DNA Human plasma, icke-reaktiv enligt FDA-licensierade test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2 och HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg; CMV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3- on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Irriterande S24-S37: Undvik kontakt med huden. Använd lämpliga skyddshandskar. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. CMV L(+)C (CMV-lågpositiv kontroll) < 0,001 % lambda-fag innehållande CMV DNA med en genomsnittlig koncentration cirka 100-faldigt lägre än genomsnittlig koncentration av CMV DNA i CMV H(+)C Human plasma, icke-reaktiv enligt FDA-licensierade test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2 och HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg; CMV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3- on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Irriterande S24-S37: Undvik kontakt med huden. Använd lämpliga skyddshandskar. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. CMV ( ) C (CMV-negativ kontroll) Human plasma, icke-reaktiv enligt FDA-licensierade test för antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2 och HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg; CMV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Xi (3:1) blandning av 5-klor-2-metyl-2H-isothiazol-3- on och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Irriterande S24-S37: Undvik kontakt med huden. Använd lämpliga skyddshandskar. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. CMV H(+)C Clip (CMV-högpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) CMV L(+)C Clip (CMV-lågpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) CMV ( ) C Clip (CMV-negativ kontroll, streckkodsmärkt klämma) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan tvättreagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan tvättreagens) Natriumcitrat-dihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 1 x 6 klämmor 1 x 6 klämmor 1 x 6 klämmor 1 x 5,1 l SV 7 Doc Rev. 5.0

8 VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Detta test är avsett att användas med human plasma som samlats i EDTA-rör med antikoagulerande medel. C. Pipettera inte med munnen. D. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagens. E. Undvik mikrobiell och nukleaskontaminering av reagens när alikvoter tas från kontrollflaskor. F. Användning av sterila engångspipetter och DNase-fria pipettspetsar rekommenderas. G. Sammanför inte kontroller från olika loter eller från olika flaskor i samma lot. H. Blanda inte reagenskassetter eller kontroller från olika kit. I. Öppna inte kassetter från COBAS AmpliPrep eller byt ut, blanda, ta bort eller lägg till flaskor. J. Kassera oanvända reagens, avfall och prover enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. K. Använd inte kit efter utgångsdatum. L. Kontakta närmaste Roche-kontor om du vill erhålla informationsblad om materialsäkerhet (MSDS). M. Prover och kontroller ska hanteras som smittbärande material. Använd säkra laboratorierutiner enligt Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 och enligt CLSI dokument M29-A3. 39 Rengör och desinficera alla arbetsytor ordentligt med en färsk lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. Obs! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. N. VARNING: CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C innehåller human plasma som härstammar från humant blod. Källmaterialet har testats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikropp mot HIV-1/2 och HCV samt HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA. Testning av negativ human plasma med PCR-metoder visade inte något detekterbart CMV DNA. Det finns inga testmetoder som ger fullständig säkerhet för att produkter från humant blod inte kan överföra smitta. Allt material av humant ursprung ska därför anses som potentiellt smittsamt. CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C ska hanteras som smittbärande material. Använd säkra laboratorierutiner enligt Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 och enligt CLSI dokument M29-A3. 39 Rengör och desinficera alla arbetsytor ordentligt med en färsk lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. O. MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 och CMV MMX innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. P. Använd ögonskydd, laboratorierock och engångshandskar när du hanterar reagens. Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. Q. Se till att inte CMV CS2 och vätskeavfall från instrumentet COBAS AmpliPrep som innehåller guanidintiocyanat kommer i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Dessa blandningar kan bilda en mycket giftig gas. R. Undvik all kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel) när använda COBAS AmpliPrep-SPU (Sample Processing Units) kasseras. Dessa blandningar kan bilda en mycket giftig gas SV 8 Doc Rev. 5.0

9 FÖRVARING OCH HANTERING A. Reagens och kontroller får inte frysas. B. Förvara CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 och CMV CS4 i 2 8 C. Oanvända är dessa reagens hållbara till angivet utgångsdatum. Efter användning är dessa reagens hållbara i 70 dagar i 2 8 C, dock längst till angivet utgångsdatum. CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 och CMV CS4 kan användas för högst 6 instrumentkörningar, upp till 100 timmar sammanlagt i instrumentet COBAS AmpliPrep. Reagens ska förvaras i 2 8 C mellan instrumentkörningar. C. Förvara CMV H(+)C, CMV L(+)C och CMV ( ) C i 2 8 C. Dessa kontroller är hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska eventuella oanvända delar av innehållet kasseras. D. Förvara streckkodsmärkta klämmor [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip och CMV ( ) C Clip] i 2 30 C. E. Förvara PG WR i 2 30 C. PG WR är hållbart till angivet utgångsdatum. Efter att förpackningen öppnats är reagenset hållbart i 28 dagar i 2 30 C, dock längst till angivet utgångsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMVCAP CMV CS1 (Reagenskassett för CMV-magnetiska glaspartiklar) CMV CS2 (CMV-lyseringsreagenskassett) CMV CS3 (CMV-multireagenskassett) CMV CS4 (CMV-testspecifik reagenskassett) CMV H(+)C (CMV-högpositiv kontroll) CMV L(+)C (CMV-lågpositiv kontroll) CMV ( ) C (CMV-negativ kontroll) CMV H(+)C Clip (CMV-högpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) CMV L(+)C Clip (CMV-lågpositiv kontroll, streckkodsmärkt klämma) CMV ( ) C Clip (CMV-negativ kontroll, streckkodsmärkt klämma) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan tvättreagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan tvättreagens) SV 9 Doc Rev. 5.0

10 MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Instrument och programvara Instrumentet COBAS AmpliPrep Analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Tillval: Docking Station Tillval: Instrumentet cobas p 630 Programmet AMPLILINK, version 3.3-serien Datastation för programmet AMPLILINK, med skrivare. Engångsartiklar Programmet AMPLILINK v3.3-serien, handböcker: Instrumenthandbok till instrumentet COBAS AmpliPrep avsedd att användas med analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller instrumentet cobas p 630 samt programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan (plus tillvalet Docking Station) avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Instrumenthandbok till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien Applikationshandbok till programmet AMPLILINK version 3.3-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och instrumentet cobas p 630 Tillval: Användarhandbok till instrumentet cobas p 630, programversion 2.2 SPU (Sample Processing Unit) S-tubes (Sample input tubes) med streckkodsklämmor Rack för K-tips Rack för K-tubes ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Provrack (SK 24 rack) Reagensrack SPU-rack K-carrier K-carrier-transportör K-carrier-rack (krävs endas för användning med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48) Pipetter med DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning (kapacitet μl)* Engångshandskar, puderfria Vortexmixer * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas när så anges, för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon SV 10 Doc Rev. 5.0

11 PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER Obs! Hantera alla prover och kontroller som potentiellt smittbärande. Obs! Detta test har endast validerats för användning med human plasma som samlats i EDTA-rör med antikoagulerande medel. Testning av andra provtyper kan resultera i felaktiga resultat. A. Provtagning Testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV ska användas med plasmaprover. Blod ska uppsamlas i sterila rör med EDTA (lila kork) som antikoagulant och blandas enligt provrörstillverkarens instruktioner. B. Transport av prover Förvara helblod i 2 25 C i högst 6 timmar. Separera plasma från helblod inom 6 timmar efter provtagning genom centrifugering i x g i 20 minuter i rumstemperatur. Överför plasman till ett sterilt polypropylenrör. Vid transport av helblod eller plasma ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas. 41 Helblod ska transporteras i 2 25 C och centrifugeras inom 6 timmar efter provtagning. Plasma kan transporteras i 2 8 C eller frusen i 20 C. C. Förvaring av prover Plasmaprover kan förvaras i 2 8 C i upp till 7 dagar. Plasmaprover visade sig vara hållbara i 6 veckor om de förvaras frysta i 20 C. Vi rekommenderar att prover förvaras i portioner om μl i sterila, 2,0 ml polypropylenrör med skruvkork (till exempel Sarstedt ). I bild 4 visas provstabilitetsdata från provförvaringsstudier som utförts med testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. 3,50 Bild 4 CMV-stabilitet i EDTA-plasma Titer log 10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prov 2 8 ºC 0d 2 8 ºC 3d 2 8 ºC 7d 20 ºC 6v Plasmaprover kan frysas och tinas upp till 3 gånger utan signifikant förlust av CMV DNA. I bild 5 visas data från en tiningsstudie som utförts med testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV SV 11 Doc Rev. 5.0

12 Bild 5 CMV-resultat efter upp till 3 tiningscykler (F-T) (EDTA-plasma) 3,50 Titer log10 (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prov 0x frysning/tining 2x frysning/tining 1x frysning/tining 3x frysning/tining BRUKSANVISNING Obs! Detaljerad information om användning, vilka konfigurationer som kan väljas, utskrift av resultat samt tolkning av flaggor, kommentarer och felmeddelanden finns i (1) instrumenthandboken till instrumentet COBAS AmpliPrep avsedd att användas med analysinstrumentet COBAS TaqMan, analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR eller instrumentet cobas p 630 och programmet AMPLILINK, version 3.3-serien; (2) instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan (plus tillvalet Docking Station) avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien; (3) instrumenthandboken till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 avsedd att användas med applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.2- och 3.3-serien; (4) applikationshandboken till programmet AMPLILINK, version 3.3-serien avsedd att användas med instrumentet COBAS AmpliPrep, analysinstrumentet COBAS TaqMan och analysinstrumentet COBAS TaqMan 48, analysinstrumentet COBAS AMPLICOR och instrumentet cobas p 630; (5) tillval: användarhandboken till instrumentet cobas p 630, programversion 2.2. Omgångsstorlek Varje kit innehåller reagens som räcker till 72 test som kan utföras i omgångar om 12 till 24 test. Minst ett replikat vardera av CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C måste ingå i varje omgång (se avsnittet "Kvalitetskontroll"). Arbetsgång Körningen med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 måste startas inom 120 minuter efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. Obs! De extraherade proverna och kontrollerna får inte frysas eller förvaras i 2 8 C SV 12 Doc Rev. 5.0

13 Prov- och kontrollextraktion Obs! Om frysta prover används ska proverna placeras i rumstemperatur tills de är helt tinade och vortexas i 3-5 sekunder innan de används. Kontrollerna ska tas bort från förvaringen i 2 8 C och värmas till rumstemperatur innan de används. Arbetsgång för instrumentet COBAS AmpliPrep Del A. Underhåll och rengöring A1. Instrumentet COBAS AmpliPrep är färdigt att användas i standbyläge. A2. Slå PÅ datastationen med programmet AMPLILINK. Förbered datastationen så här: a. Logga in på operativsystemet Windows XP. b. Dubbelklicka på programikonen AMPLILINK. c. Logga in på AMPLILINK-programmet genom att ange ditt användar-id och lösenord. A3. Kontrollera förrådet av PG WR med hjälp av fönstret Status och byt om det behövs. A4. Utför det underhåll som anges på fliken Due. Instrumentet COBAS AmpliPrep utför automatiskt prime på systemet. Del B. Ladda reagenskassetter Obs! Alla reagenskassetter ska tas bort från förvaringen i 2 8 C, omedelbart sättas in i instrumentet COBAS AmpliPrep och ekvilibreras till rumstemperatur i instrumentet i minst 30 minuter innan det första provet bearbetas. Ställ inte reagenskassetterna utanför instrumentet när de ska uppnå rumstemperatur eftersom kondens kan bildas på streckkodsetiketterna. Torka inte av kondensen om sådan uppstår på streckkodsetiketterna. B1. Placera CMV CS1 i ett reagensrack. Placera CMV CS2, CMV CS3 och CMV CS4 i ett separat reagensrack. B2. Ladda det reagensrack som innehåller CMV CS1 i rackposition A i instrumentet COBAS AmpliPrep. B3. Ladda det reagensrack som innehåller CMV CS2, CMV CS3 och CMV CS4 i rackposition B, C, D eller E i instrumentet COBAS AmpliPrep. Ytterligare information finns i tabell 1. Del C. Ladda engångsartiklar Obs! Fastställ hur många COBAS AmpliPrep reagenskassetter, SPU (Sample Processing Units), Input Sample tubes (S-tubes), K-tips och K-tubes som behövs. En SPU, ett Input S-tube, en K-tip och ett K-tube behövs för varje prov eller kontroll. Du kan välja bland flera arbetsgångar vid användning av instrumentet COBAS AmpliPrep med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Mer information finns i tabell 1. Sätt in det antal reagenskassettrack, provrack med Input S-tubes, SPU-rack, K-tip-rack, K-tube-rack och K-carriers i K-carrier-rack som krävs för den arbetsgång som valts, i respektive rackposition i instrumentet COBAS AmpliPrep (ytterligare information finns i tabell 1). C1. Placera SPU i SPU-racken och ladda racken i rackposition J, K eller L i instrumentet COBAS AmpliPrep. C2. Ladda fyllda K-tube-rack i rackposition M, N, O eller P enligt vald arbetsgång i instrumentet COBAS AmpliPrep. C3. Ladda fyllda K-tip-rack i rackposition M, N, O eller P i instrumentet COBAS AmpliPrep. C4. Vid arbetsgång 3, när analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 används, ska K-carriers laddas i K-carrier-rack i rackposition M, N, O eller P i instrumentet COBAS AmpliPrep SV 13 Doc Rev. 5.0

14 Tabell 1 Möjliga arbetsgångar när instrumentet COBAS AmpliPrep används med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Arbetsgång Överföringsläge till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Rack, carriers och engångsartiklar Position i instrumentet COBAS AmpliPrep K-tubes i fulla K-tube-rack M P 1 Instrumentet COBAS AmpliPrep plus Docking Station plus analysinstrumentet COBAS TaqMan Automatisk överföring av K-carrier K-tips i fulla K-tip-rack Input S-tubes som innehåller patientprover och kontroller i provrack SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack M P F H J L A CS2, CS3, CS4 i kassettrack B E K-tubes i fulla K-tube-rack M P K-tips i fulla K-tip-rack M P 2 Instrumentet COBAS AmpliPrep plus analysinstrumentet COBAS TaqMan Manuell överföring av K-tubes via provrack till analysinstrumentet COBAS TaqMan Input S-tubes som innehåller patientprover och kontroller i provrack SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack F H J L A CS2, CS3, CS4 i kassettrack B E När provextraktionen har slutförts: K-tubes i provrack (färdiga för manuell överföring) Samma som ovan (F H) K-tubes i provrack F H K-tips i fulla K-tip-rack M P Input S-tubes som innehåller patientprover och kontroller i provrack F H 3 Instrumentet COBAS AmpliPrep plus analysinstrument(en) COBAS TaqMan 48 Manuell överföring av K-carrier via K-carrier-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 SPU i SPU-rack CS1 i kassettrack CS2, CS3, CS4 i kassettrack J L A B E Tom K-carrier med streckkod I K-carrier-rack M P När provextraktionen har slutförts: K-tubes i K-carrier i K-carrier-rack Samma som ovan (M P) SV 14 Doc Rev. 5.0

15 Del D. Beställa och ladda prover Obs! Läs användarhandboken till instrumentet cobas p 630 om du använder cobas p 630 för extraktion. D1. Bered provrack på följande sätt: Fäst en streckkodsklämma i de provrackspositioner där ett prov (S-tube) ska placeras. Anslut en av de specifika streckkodsklämmorna för kontroller [CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C] till de provrackspositioner där kontrollerna (S-tube) ska placeras. Streckkodsklämmorna för kontroller ska ha samma kontrollotsnummer som lotnumret på kontrollflaskorna i kitet. Var noga med att tilldela varje kontroll positionen med motsvarande kontrollstreckkodsklämma. Placera ett Input S-tube i varje position som är märkt med en streckkodsklämma. D2. Skapa provbeställningar för varje prov och kontroll på fliken Sample i fönstret Orders i programmet AMPLILINK. Välj lämplig testfil och avsluta genom att spara. D3. Tilldela prov- och kontrollbeställningarna rackpositioner på fliken Sample Rack i fönstret Orders. Provracksnumret måste vara samma rack som bereddes i steg D1. D4. Skriv ut rapporten för provracksbeställning (Sample Rack Order) som ett arbetsblad. D5. Bered prov- och kontrollrack i det område som är avsett för överföring av prover och kontroller på följande sätt: Vortexa varje prov och kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C] i 3 till 5 sekunder. Undvik att förorena handskarna när du hanterar prover och kontroller. D6. Överför 500 μl av varje prov och kontroll [CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C] i rätt streckkodsmärkta Input S-tube med hjälp av en mikropipett med DNase-fri spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Undvik att överföra partiklar och/eller fibrinkoagel från ursprungsproverna till Input S-tube. Prover och kontroller ska överföras till de rörpositioner som tilldelats och antecknats på arbetsbladet i steg D4. Streckkodsklämmorna för kontroller ska ha samma kontrollotsnummer som lotnumret på kontrollflaskorna i kitet. Tilldela varje kontroll positionen med motsvarande kontrollstreckkodsklämma. Undvik att kontaminera den övre delen av S-tube med prover eller kontroller. D7. Om arbetsgång 1 eller 2 används ska provracken som är fyllda med Input S-tubes placeras i rackpositionen F, G eller H i instrumentet COBAS AmpliPrep. D8. Om arbetsgång 3 används med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 ska provracken laddas med Input S-tubes och K-tubes (ett för varje Input S-tube, i den högra positionen intill Input S-tubes) i rackposition F, G eller H i instrumentet COBAS AmpliPrep. Del E. Starta körning med instrumentet COBAS AmpliPrep E1. Starta instrumentet COBAS AmpliPrep med hjälp av programmet AMPLILINK. Del F. Avsluta körning med instrumentet COBAS AmpliPrep och överföring till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 (endast för arbetsgång 2 och 3) F1. Kontrollera om det finns flaggor eller felmeddelanden. F2. Ta bort extraherade prover och kontroller från instrumentet COBAS AmpliPrep, antingen i provrack (för analysinstrumentet COBAS TaqMan utan Docking Station) eller i K-carrier-rack (för analysinstrumentet COBAS TaqMan 48) enligt aktuell arbetsgång (mer information finns i del G). F3. Avlägsna avfall från instrumentet COBAS AmpliPrep. Obs! Alla extraherade prover och kontroller ska skyddas mot ljus efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. Amplifiering och detektion Arbetsgång för analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 Körningen med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 måste startas inom 120 minuter efter att prov- och kontrollextraktionen har slutförts. Obs! De extraherade proverna och kontrollerna får inte frysas eller förvaras i 2 8 C SV 15 Doc Rev. 5.0

16 Del G. Ladda bearbetade prover G1. Överför K-tubes till analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 genom att utföra de steg som krävs för den arbetsgång som används: Arbetsgång 1: Automatisk överföring av K-carrier via Docking Station till analysinstrumentet COBAS TaqMan. Det krävs inga manuella insatser. Arbetsgång 2: Manuell överföring av K-tubes i provrack till analysinstrumentet COBAS TaqMan Arbetsgång 3: Manuell överföring av K-carrier i K-carrier-rack till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Manuell överföring av K-carriers till analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 med hjälp av K-carrier-transportören. Del H. Starta körning med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 H1. Starta analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 med ett av alternativen nedan beroende på vilken arbetsgång som används: Arbetsgång 1: Inga insatser krävs. Arbetsgång 2: Automatisk start av analysinstrumentet COBAS TaqMan efter insättning av provrack. Arbetsgång 3: Fyll K-carriern med tomma K-tubes om det finns färre än 6 K-tubes på K-carriern. Du får information om hur det ska göras av programmet AMPLILINK. Öppna termocyklerskyddet, sätt in K-carriern i termocyklern och stäng locket. Starta körningen med analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. Del I. Avsluta körning med analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 I1. När körningen i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48 har slutförts ska resultatrapporten skrivas ut. Kontrollera om det finns flaggor eller felmeddelanden i resultatrapporten. Hur prover med flaggor och kommentarer ska tolkas beskrivs i avsnittet "Resultat". Efter att data har godkänts ska de sparas. I2. Ta bort använda K-tubes från analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. RESULTAT CMV DNA-koncentrationen för proverna och kontrollerna fastställs automatiskt i analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan 48. CMV DNA-koncentrationen uttrycks i kopior (cp)/ml. Omvandlingsfaktorn mellan CMV DNA kopior/ml (enligt definitionen i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) och internationella enheter (IU)/ml är 1,1 kopior/iu [0,91 IU/kopia], vid användning av WHO:s första internationella standard för humant cytomegalovirus för NAT-testning (Nucleic Acid Amplification Techniques) (NIBSC 09/162) 40. Omvandlingsfaktorn mellan "kopior" och "IU" behöver inte vara densamma för andra CMV-DNA-analyser. Programmet AMPLILINK: Fastställer cykeltröskelvärdet (Ct) för CMV DNA och CMV QS DNA. Fastställer CMV DNA-koncentrationen baserat på Ct-värdena för CMV DNA och CMV QS DNA samt de lotspecifika kalibreringskoefficienter som anges på kassettens streckkod. Fastställer att beräknat antal kopior/ml för CMV L(+)C och CMV H(+)C ligger inom fastställda intervall. Validering av omgång AMPLILINK version 3.3-serien Försäkra dig om att omgången är giltig genom att kontrollera om det förekommer flaggor eller kommentarer i utskriften eller i resultatfönstret i programmet AMPLILINK. För kontrollbeställningar utförs en kontroll för att bestämma om kontrollens kopior/ml-värde ligger inom dess fastställda intervall. Om kontrollens kopior/ml-värde ligger utanför intervallet genereras en flagga som visar att kontrollen har misslyckats. Omgången är giltig om inga flaggor visas för någon av kontrollerna [CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C] SV 16 Doc Rev. 5.0

17 Omgången är inte giltig om någon av följande flaggor visas för CMV-kontrollerna: Negativ kontroll Flagga Resultat Betydelse NC_INVALID Invalid Ett ogiltigt resultat eller ett "giltigt" resultat som inte var negativt för CMV target CMV-lågpositiv kontroll Flagga Resultat Betydelse LPCINVALID Invalid Ett ogiltigt resultat eller en kontroll som ligger utanför intervallet CMV-högpositiv kontroll Flagga Resultat Betydelse HPCINVALID Invalid Ett ogiltigt resultat eller en kontroll som ligger utanför intervallet Om omgången är ogiltig måste du upprepa hela körningen inklusive prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion. Tolkning av resultat För en giltig omgång ska varje enskilt prov kontrolleras avseende flaggor eller kommentarer på resultatutskriften. Tolka resultaten så här: En giltig omgång kan innehålla båda giltiga och ogiltiga provresultat, beroende på om flaggor och/eller kommentarer erhålls för de enskilda proverna. Provresultaten tolkas på följande sätt: Titerresultat Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml Betydelse Rapportera resultat som "CMV DNA not detected". Beräknat antal kopior/ml ligger under analysens nedre kvantifieringsgräns. Rapportera resultat som "CMV DNA detected, less than 150 CMV DNA cp/ml". Kopior/ml 1.50E+02 cp/ml och 1.00E+07 cp/ml Beräknade resultat som är större än eller lika med 150 CMV DNAkopior/ml och mindre än eller lika med 1,00E+07 CMV DNA kopior/ml ligger inom analysens linjära intervall. > 1.00E+07 cp/ml Beräknat antal kopior/ml ligger över analysens intervall. Rapportera resultat som "greater than 1.00E+07 CMV DNA cp/ml". Om kvantitativa resultat önskas ska det ursprungliga provet spädas med CMV-negativ human EDTA-plasma och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. Internationella enheter/ml <1.37E+02 IU/mL 1.37E+02 IU/mL och 9.10E+06 IU/mL >9.10E+06 IU/mL Beräknat antal IU/ml ligger under analysens nedre kvantifieringsgräns. Rapportera resultat som "CMV DNA detected, less than 137 CMV DNA IU/mL". Beräknade resultat som är större än eller lika med 137 CMV DNAIU/ml och mindre än eller lika med 9,10E+06 CMV DNA IU/ml ligger inom analysens linjära intervall. Beräknat antal IU/ml ligger över analysens intervall. Rapportera resultat som "greater than 9.10E+06 CMV DNA IU/mL". Om kvantitativa resultat önskas ska det ursprungliga provet spädas med CMV-negativ human EDTA-plasma och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. Obs! Prover som ligger ovanför analysens intervall och som genererar ett ogiltigt resultat med flaggan QS_INVALID ska inte rapporteras som > 9.10E+06 IU/mL eller som > 1.00E+07 cp/ml. Det ursprungliga provet ska spädas med CMV-negativ EDTA-plasma och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. Obs! Titerresultat "Failed". Betydelse: Provet bearbetades inte på rätt sätt. Obs! Titerresultat "Invalid". Betydelse: Ett ogiltigt resultat SV 17 Doc Rev. 5.0

18 KVALITETSKONTROLL Ett replikat vardera av COBAS TaqMan negativ kontroll, CMV-lågpositiv kontroll och CMV-högpositiv kontroll måste ingå i varje testomgång. Omgången är giltig om inga flaggor visas för någon av kontrollerna [CMV ( ) C, CMV L(+)C och CMV H(+)C]. Kontrollera om det finns flaggor och kommentarer i utskriften så att du säkerställer att omgången är giltig. Negativ kontroll CMV ( ) C måste ge ett "Target Not Detected"-resultat. Om CMV ( ) C flaggas som ogiltig, är hela omgången ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Om CMV ( ) C är konsekvent ogiltig i flera omgångar ska du kontakta din Roche-representant och begära teknisk hjälp. Positiva kontroller De fastställda titer-intervallen för CMV L(+)C och CMV H(+)C anges i reagenskassettens streckkod i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. CMV DNA kopior/ml för CMV L(+)C och CMV H(+)C ska ligga inom tilldelat intervall. Om den ena eller båda av de positiva kontrollerna flaggas som ogiltig är hela omgången ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och detektion). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om CMV DNA-titern för en eller båda positiva kontrollerna konsekvent ligger utanför det fastställda intervallet i flera omgångar. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratorieteknik för att denna analys ska fungera korrekt. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Detta test har endast validerats för användning med human plasma som samlats i EDTA-rör med antikoagulerande medel. Testning av andra provtyper kan resultera i felaktiga resultat. 2. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och behandling av prover. 3. Förekomsten av AmpErase-enzym i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Master Mix minskar risken för amplicon-kontaminering. Smitta från CMV-positiva kontroller och kliniska prover kan dock endast undvikas om god laboratoriesed iakttas och de förfaranden som beskrivs i denna bipacksedel noga följs. 4. Endast personal med erfarenhet av PCR-teknik bör använda produkten. 5. Denna produkt kan endast användas tillsammans med instrumentet COBAS AmpliPrep och analysinstrumentet COBAS TaqMan eller analysinstrumentet COBAS TaqMan Mutationer inom de maximalt konserverade regionerna på det virusgenom som täcks av primers och/eller prober för testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV är visserligen sällsynta, men kan göra att ett lägre kvantifieringsresultat erhålls eller att viruset inte kan detekteras. 7. Detektion av CMV DNA är beroende av antalet viruspartiklar i provet och kan påverkas av provtagningsmetoder och patientfaktorer (t.ex. ålder, förekomst av symptom och/eller infektionsstadium). 8. På grund av skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. 9. Några trösklar för kliniska beslut avseende virusmängden i internationella enheter/ml (IU/ml) har inte fastställts. Läkare rekommenderas att använda lämplig omvandlingsfaktor från IU/ml till kopior/ml (cp/ml) när kliniska beslut ska tas med hjälp av resultat som anges i IU/ml SV 18 Doc Rev. 5.0

19 INTERFERERANDE ÄMNEN Förhöjda nivåer av triglycerider (upp till mg/dl), konjugerat bilirubin (upp till 20 mg/dl), okonjugerat bilirubin (upp till 20 mg/dl), hemoglobin (upp till 200 mg/dl) och humant DNA (upp till 0,4 mg/dl) i prover samt förekomst av autoimmuna sjukdomar eller respektive markörer, t.ex. systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och antinukleära antikroppar (ANA) har visat sig inte interferera med kvantifiering av CMV DNA eller påverka specificiteten hos testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Utvärderingen utfördes enligt riktlinjerna CLSI EP7-A2 41 med en reagenslot i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Följande läkemedelsföreningar som testats 3 gånger vid topplasmanivå (Cmax) har visat sig inte interferera med kvantifiering av CMV DNA eller påverka specificiteten hos testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV: Immunhämmande Azatioprin Cyklosporin Mykofenolat mofetil Natriummykofenolat Sirolimus Tacrolimus Everolimus Prednison Anti-CMV Ganciklovir Valganciclovir Cidofovir Foskarnet Antibiotika Sulfametoxazol Trimetoprim Cefotetan Piperacillin Tazobactam sodium Kaliumklavulanat Ticarcillin Disodium Vankomycin Anti-fungal Flukonazol SV 19 Doc Rev. 5.0

20 ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING A. Spårbarhet till WHO:s första internationella standard för humant cytomegalovirus Flera standarder och kontroller har använts vid utvecklingen av det här testet för att åstadkomma spårbarhet till WHO:s standard [WHO:s första internationella standard för humant cytomegalovirus för NAT-testning (Nucleic Acid Amplification Techniques) (NIBSC 09/162)]. 40 De standarder som använts vid utvecklingen av det här testet omfattar CMV WHO-standard, sekundär RMS CMV-standard, källmaterial från sekundär RMS CMV-standard och RMS CMV-kalibreringspanel (Lambda CMA1.2). Standarderna, kalibreringspanelen och ett oberoende CMV-positivt kliniskt prov testades på samma nivåer. Det koncentrationsintervall som testades för CMV WHO-standarden låg från 5,00E+02 IU/ml till 5,00E+05 IU/ml (2,70 5,70 log 10 IU/ml), källmaterial från den sekundära RMS CMV-standarden testades från 5,00E+02 IU/ml till 1,00E+07 IU/ml (2,70 7,00 log 10 IU/ml), RMS CMVkalibreringspanelen testades från 5,23E+02 till 9,30E+06 IU/ml (2,72 6,97 log 10 IU/ml) och det oberoende CMV-positiva kliniska provet testades från 5,00E+02 IU/ml till IU/ml (2,70 4,36 log 10 IU/ml). Alla material uppträdde på liknande sätt och uppvisade kolinjära spädningsegenskaper över hela det linjära intervallet i testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV (CAP/CTM CMV) (bild 6). Bild 6 Spårbarhet hos testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV till WHO:s första internationella standard för humant cytomegalovirus Genomsnittligt Ct-värde för target Log 10 WHO-standardbaserad koncentration (IU/ml) WHO-standard: y = -3,9472x + 45,64; R 2 = 0,9971 Kliniskt prov: y = -3,8549x + 45,386; R 2 = 0,9979 CMV SS-källa: y = -3,9358x + 45,514; R 2 = 0,9987 CAP/CTM CMV-kalibreringspanel: y = -3,8574x + 45,383; R 2 = 0,9955 CMV WHO-standard Kliniskt prov # N SS-källmaterial AD169 CAP/CTM CMV-kalibreringspanel CMV SS, ren SV 20 Doc Rev. 5.0