cobas HCV För in vitro-diagnostisk användning Kvantitativt nukleinsyratest för användning på cobas 4800-systemet 120 Tests P/N:

Transkript

1 Kvantitativt nukleinsyratest för användning på cobas 4800-systemet För in vitro-diagnostisk användning cobas HCV 120 Tests P/N: cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 10 Sets P/N: cobas 4800 System Sample Preparation Kit 2 cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 Tests 960 Tests 240 Tests 960 Tests P/N: P/N: P/N: P/N: cobas 4800 System Specimen Diluent Tests P/N: cobas 4800 System Lysis Kit Tests 960 Tests P/N P/N

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING Avsedd användning Sammanfattning och förklaring av testet Bakgrund... 4 Princip för HCV-testning... 4 Förklaring av testet... 5 Användningsprinciper... 5 Material och reagens Reagens... 6 Förvaring och hantering av reagens Extramaterial som behövs Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer Försiktighetsåtgärder och information om hantering Varningar och säkerhetsåtgärder God laboratoriesed Reagenshantering Kontamination Integritet Avfallshantering Spill och rengöring Provtagning, transport och förvaring av prover Bruksanvisning Resultat Provtagning Förvaring och stabilitet för prover under transport Körning av testet Provbearbetningsvolym Körningsstorlek Arbetsflöde Kvalitetskontroll och giltighet för resultaten Kontrollflaggor Tolkning av resultat Testets begränsningar Icke-klinisk egenskapsutvärdering Viktiga egenskaper WHO:s internationella standard Doc. Rev

3 Linjärt intervall Precision inom laboratoriet Verifiering av genotyp Specificitet Metodkorrelation Matrisekvivalens EDTA-plasma jämfört med serum Felfrekvens inom hela systemet Korskontamination Ytterligare information Viktiga analysegenskaper Symboler Tillverkare och distributörer Varumärken och patent Copyright Referenser Revidering av dokumentet Doc. Rev

4 Avsedd användning cobas HCV är ett in vitro-test för nukleinsyraamplifiering för både detektion och kvantifiering av hepatit C-virus (HCV) RNA i human EDTA-plasma eller serum från HCV-infekterade personer. Prover som innehåller HCV-genotyperna 1 till 6 är validerade för detektion och kvantifiering i analysen. Testet är avsett som hjälpmedel vid diagnos av HCV-infektion hos följande populationer: personer med evidens på antikroppar mot HCV med evidens på leversjukdom, personer med evidens på antikroppar mot HCV som misstänks vara aktivt infekterade och personer med antikroppar mot HCV som riskerar att drabbas av HCV-infektion. Detektion av HCV RNA indikerar att viruset replikeras och därför är tecken på en aktiv infektion. Detta test är avsett som hjälpmedel vid hantering av patienter med HCV-infektion som genomgår antiviral behandling. Analysen mäter HCV RNA-nivåerna vid baseline och under behandling och kan användas för att förutsäga bestående och icke-bestående virologisk respons på HCV-behandling. Resultaten måste tolkas med hänsyn till alla relevanta kliniska fynd och laboratoriefynd. Sammanfattning och förklaring av testet Bakgrund HCV betraktas som det huvudsakliga etiologiska agenset som ansvarar för 90 till 95 % av fallen av hepatit i samband med blodtransfusion. 1 4 HCV är ett enkelsträngat, positivt RNA-virus med ett genom på cirka nukleotider som kodar för aminosyror. Som blodburet virus kan HCV överföras via blod eller blodprodukter. En utbredd användning av HCVscreeningtest för blod har märkbart minskat risken för transfusionsrelaterad hepatit. Risken för HCV-infektion är störst i samband med intravenöst drogmissbruk och i mindre utsträckning i samband med annan perkutan exponering. 4 Kvantifiering av HCV RNA för mätning av baseline-virusmängder och för kontroll under pågående behandling är en etablerad metod för att påvisa effektiviteten av antiviralt svar på kombinationsbehandling med pegylerat interferon och ribavirin (pegifn/rbv). 5-9 I riktlinjerna för hantering och behandling av HCV 10,11 rekommenderas kvantitativ testning av HCV RNA innan antiviral behandling påbörjas, vid angivna tidsintervall under behandling (responsstyrd behandling) och 12 veckor eller senare efter avslutad behandling. Målet med behandlingen är avsaknad av detekterbart HCV RNA i ett sensibilitetstest 12 veckor efter avslutad behandling, vilket indikerar att ett kvarstående virologiskt svar (Sustained Virologic Response, SVR) har uppnåtts. 10 Bestämning av den virologiska kinetiken under behandling har använts för att ytterligare individanpassa behandlingens längd med de nyligen godkända direktverkande antivirala medlen (DAAs), proteashämmarna telaprevir och boceprevir Princip för HCV-testning Förekomst av HCV-antikroppar indikerar att en person har infekterats med HCV. En positiv status för HCV-antikroppar särskiljer dock inte mellan akut, kronisk och utläkt infektion. Detektion av HCV RNA i serum eller plasma indikerar pågående virusreplikering och används därför för att identifiera patienter med bestående HCV-infektion. Antalet högeffektiva HCV-specifika direktverkande antivirala medel (DAAs) ökar kontinuerligt, till exempel andra generationens proteashämmare, polymerashämmare och NS5A-hämmare, och det görs ständigt nya framsteg inom forskningen vad gäller läkemedel för framtida HCV-behandlingar. I denna dynamiska miljö framstår övervakning av virusmängden, som det, även i fortsättningen, viktigaste laboratorietestet för att bekräfta att SVR har uppnåtts med DAAbaserad behandling Doc. Rev

5 Sammanfattningsvis är cobas HCV ett kvantitativt test för detektion av HCV RNA, diagnos av aktiv infektion och bestämning av den virologiska kinetiken, för användning i laboratorier för både kliniska undersökningar och som en del av den medicinska rutinen vid behandling av HCV-patienter. Förklaring av testet cobas HCV är ett kvantitativt nukleinsyratest som utförs på cobas 4800-systemet. cobas HCV möjliggör detektion och kvantifiering av HCV RNA i EDTA-plasma eller serum hos smittade patienter. Dubbla prober används till att detektera och kvantifiera men inte diskriminera HCV-genotyperna 1 till 6. Virusmängden kvantifieras mot en icke-hcv RNAkvantifieringsstandard (RNA QS) som tillsätts i varje prov under provberedningen. RNA QS fungerar även som en intern kontroll för övervakning av hela provberednings- och PCR-amplifieringsprocessen. Dessutom används tre externa kontroller i testet: en positiv med hög titer, en positiv med låg titer och en negativ kontroll. Användningsprinciper cobas HCV är baserat på helt automatisk provberedning (extraktion och rening av nukleinsyra) följt av PCR-amplifiering och detektion. cobas 4800-systemet består av instrumentet cobas x 480 och analysinstrumentet cobas z 480. Automatisk datahantering utförs av cobas 4800-programmet som tilldelar testresultat för alla tester enligt följande: target not detected, < LLoQ (nedre kvantifieringsgräns), > ULoQ (övre kvantifieringsgräns) eller HCV RNA detekterat, ett värde i det linjära intervallet LLoQ x ULoQ. Resultaten kan visas direkt i systemfönstret, exporteras eller skrivas ut som en rapport. Nukleinsyror från patientprover, externa kontroller och tillsatta armored RNA-QS-molekyler extraheras samtidigt. Sammanfattningsvis frisätts virala nukleinsyror genom tillsats av proteinas och lyseringsreagens i provet. De frisatta nukleinsyrorna binder till kiselytan på de tillsatta magnetiska glaspartiklarna. Obundna substanser och föroreningar, till exempel denaturerade proteiner, cellrester och potentiella PCR-hämmare, tas bort med efterföljande tvättbuffertsteg, och renade nukleinsyror elueras från de magnetiska glaspartiklarna med hjälp av elueringsbuffert vid förhöjd temperatur. Selektiv amplifiering av mål-nukleinsyror från patientprovet uppnås genom användning av virussekvensspecifika forwardoch reverse-primers som väljs från maximalt konserverade regioner i HCV-genomet. Selektiv amplifiering av RNA QS uppnås genom användning av sekvensspecifika forward- och reverse-primers som väljs för att inte ha någon homologi med HCV-genomet. Ett värmebeständigt DNA-polymeras används för både reverse transcription och PCR-amplifiering. I master-mixarna ingår deoxiuridintrifosfat (dutp) istället för deoxitymidintrifosfat (dttp), som inkorporerats i det nyligen syntetiserade DNA:t (amplikon) Eventuellt kontaminerande amplikon från tidigare PCR-körningar inaktiveras som PCR-mallar av AmpErase (ingår i master-mixarna) innan det första denatureringssteget för PCR. AmpErase katalyserar avlägsnandet av uracil från DNA men har ingen aktivitet på RNA eller naturligt förekommande DNA, som inte innehåller uracil. Amplikon som bildas under efterföljande cykler av PCR inaktiveras inte eftersom AmpErase är inaktivt vid bindnings- och denatureringstemperaturerna för PCR. cobas HCV-master-mixen innehåller två detektionsprober som är specifika för HCV-målsekvenserna och en detektionsprob som är specifik för RNA QS. Proberna är märkta med målspecifika fluorescerande reporterfluorokromer som möjliggör samtidig detektion av HCV och RNA QS i två olika detektionskanaler. 25,26 Fluorescenssignalerna för de intakta proberna hämmas av en quencherfluorokrom när de inte är bundna till målsekvensen. Under PCR-amplifieringssteget hybridiserar proberna specifikt till respektive mål på det enkelsträngade DNA:t, vilket resulterar i klyvning med proben genom 5'-till-3'-nukleasaktiviteten i DNA-polymeraset, vilket i sin tur resulterar i separation av reporter- och quencherfluorokromen och gör att en fluorescenssignal genereras. För varje PCR-cykel genereras ökande mängder klyvda prober, och som en följd av detta ökar den sammanlagda signalen för reporterfluorokromen. Realtidsdetektion och urskiljning av PCR-produkter uppnås genom att mäta fluorescensen i de frisläppta reporterfluorokromerna för de virala målen och RNA QS. Doc. Rev

6 Material och reagens Reagens Alla oöppnade reagens och kontroller ska förvaras enligt rekommendationerna i tabellen Förvaring och hantering av reagens. Kit Ingredienser i komponenter och reagens Kvantitet per kit Säkerhetssymbol och varning a MMX R1 N/A (cobas master mix-reagens 1) Manganacetat, kaliumhydroxid, < 0,1 % natriumazid 10 1,75 ml HCV MMX R2 N/A (cobas HCV master mix-reagens 2) cobas HCV 120 test (P/N: ) Tricinbuffert, kaliumacetat, 18 % dimetylsulfoxid, glycerol, < 0,1 % Tween 20, EDTA, < 0,12 % datp, dctp, dgtp, dutp, < 0,01 % HCV-primers, < 0,01 % forward- och reverse-primers för kvantifieringsstandard, < 0,01 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för HCV och kvantifieringsstandarden, < 0,01 % oligonukleotid-aptamer, < 0,01 % Z05D DNA-polymeras (mikrobiellt), < 0,01 % AmpErase-enzym (uracil-nglykosylas) (mikrobiellt), < 0,1 % natriumazid 10 0,5 ml RNA QS N/A (cobas RNA-kvantifieringsstandard) Trisbuffert, < 0,05 % EDTA, < 0,001 % icke- HCV-relaterad armored RNA-konstrukt som innehåller primer- och probspecifika sekvensregioner (ej infektiöst RNA i MS2- bakteriofag), < 0,1 % natriumazid 10 1,75 ml Doc. Rev

7 Kit Ingredienser i komponenter och reagens Kvantitet per kit Säkerhetssymbol och varning a HBV/HCV/HIV-1 L(+)C (cobas HBV/HCV/HIV-1 lågpositiv kontroll) < 0,001 % syntetiskt (armored) HIV-1 grupp M- RNA inkapslat i MS2-bakteriofagens skalprotein, < 0,001 % syntetiskt (plasmid) HBV DNA inkapslat i Lambda-bakteriofagens skalprotein, < 0,001 % syntetiskt (armored) HCV RNA inkapslat i MS2-bakteriofagens skalprotein, normal human plasma, icke-reaktiv enligt licensierade test för antikropp mot HIV 1/2, antikropp mot HCV, HBsAg, antikropp mot HBc; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel 10 0,75 ml Varning H317 Kan orsaka allergisk hudreaktion. P261 Undvik att inandas damm/rök/gaser/ dimma/ångor/sprej. P272 Nedstänkta arbetskläder får inte avlägsnas från arbetsplatsen. P280 Använd skyddshandskar. P333 + P313 Vid hudirritation eller utslag: Sök läkarhjälp. P362 + P364 Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. P501 Innehållet/behållaren lämnas till en godkänd avfallsanläggning. cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 10 set (P/N: ) HBV/HCV/HIV-1 H(+)C (cobas HBV/HCV/HIV-1 högpositiv kontroll) < 0,001 % syntetiskt (armored) HIV-1 grupp M- RNA inkapslat i MS2-bakteriofagens skalprotein, < 0,001 % syntetiskt (plasmid) HBV DNA inkapslat i Lambda-bakteriofagens skalprotein, < 0,001 % syntetiskt (armored) HCV RNA inkapslat i MS2-bakteriofagens skalprotein, normal human plasma, icke-reaktiv enligt licensierade test för antikropp mot HIV 1/2, antikropp mot HCV, HBsAg, antikropp mot HBc; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 10 0,75 ml blandning av: 5-klor-2-metyl- 4-isothiazolin-3-on [EC-nr ] och 2-metyl-2H-isothiazol-3-on [EC-nr ] (3:1) 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel ( ) C (negativ kontroll 2 för cobas ) Normal human plasma, icke-reaktiv enligt licensierade test för antikropp mot HIV 1/2, antikropp mot HCV, HBsAg, antikropp mot HBc; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA och HBV DNA som inte PCR-metoder kan detektera. 10 0,75 ml < 0,1 % ProClin 300 konserveringsmedel Doc. Rev

8 Kit Ingredienser i komponenter och reagens Kvantitet per kit Säkerhetssymbol och varning a cobas 4800 System Sample Preparation Kit test (P/N: ) MGP 2 (cobas 4800 MGP-reagens 2) Magnetiska glaspartiklar, Trisbuffert, 0,1 % metyl-4 hydroxybensoat, < 0,1 % natriumazid EB 2 (cobas 4800 elueringsbuffert 2) Trisbuffert, 0,2 % metyl-4 hydroxybensoat 10 8 ml ml N/A cobas 4800 System Sample Preparation Kit test (P/N: ) MGP 2 (cobas 4800 MGP-reagens 2) Magnetiska glaspartiklar, Trisbuffert, 0,1 % metyl-4 hydroxybensoat, < 0,1 % natriumazid EB 2 (cobas 4800 elueringsbuffert 2) Trisbuffert, 0,2 % metyl-4 hydroxybensoat ml ml N/A cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 test (P/N: ) WB Natriumcitrat-dihydrat, 0,05 % N-metylisotiazolon-HCl ml N/A cobas 4800 System Wash Buffer Kit 960 test (P/N: ) WB Natriumcitrat-dihydrat, 0,05 % N-metylisotiazolon-HCl ml N/A cobas 4800 System Specimen Diluent test (P/N: ) SD 2 Trisbuffert, 0,1 % metyl-4 hydroxybensoat, < 0,1 % natriumazid 10 8 ml N/A Doc. Rev

9 Kit Ingredienser i komponenter och reagens Kvantitet per kit Säkerhetssymbol och varning a Fara P 2 (proteas 2 för cobas 4800) Trisbuffert, < 0,05 % EDTA, kalciumklorid, kalciumacetat, 8 % (vikt/volym) proteinas 10 1,0 ml H302+H332 Skadligt vid förtäring eller inandning. H315 Irriterar huden. H318 Orsakar allvarliga ögonskador. H334 Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. H412 Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. cobas 4800 System Lysis Kit 2 EUH032 Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. 240 test (P/N: ) P261 Undvik att inandas damm/rök/gaser/ dimma/ångor/sprej. P280 Använd skyddshandskar/ögonskydd/ ansiktsskydd. LYS 2 (lyseringsbuffert 2 för cobas 4800) 43 % (vikt/vikt) guanidintiocyanat, 5 % (vikt/volym) polydokanol, 2 % (vikt/volym) ditiotreitol, natriumdivätecitrat ml P284: Använd andningsskydd. P305 + P351 + P338 + P310 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. P342 + P311 Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONS- CENTRALEN/läkare. P362 + P364 Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. Doc. Rev

10 Kit Ingredienser i komponenter och reagens Antal per test Säkerhetssymbol och varning a cobas 4800 System Lysis Kit test (P/N: ) P 2 (proteas 2 för cobas 4800) Trisbuffert, < 0,05 % EDTA, kalciumklorid, kalciumacetat, 8 % (vikt/volym) proteinas LYS 2 (lyseringsbuffert 2 för cobas 4800) 43 % (vikt/vikt) guanidintiocyanat, 5 % (vikt/volym) polydokanol, 2 % (vikt/volym) ditiotreitol, natriumdivätecitrat a Produktsäkerhetsmärkningen följer huvudsakligen EU:s GHS-system 10 1,0 ml ml Fara H302+H332 Skadligt vid förtäring eller inandning. H315 Irriterar huden. H318 Orsakar allvarliga ögonskador. H334 Kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning. H412 Skadliga långtidseffekter för vattenlevande organismer. EUH032 Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. P261 Undvik att inandas damm/rök/gaser/ dimma/ångor/sprej. P280 Använd skyddshandskar/ ögonskydd/ansiktsskydd. P284: Använd andningsskydd. P305 + P351 + P338 + P310 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. Kontakta genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. P342 + P311 Vid besvär i luftvägarna: Kontakta GIFTINFORMATIONS- CENTRALEN/läkare. P362 + P364 Nedstänkta kläder tas av och tvättas innan de används igen. Doc. Rev

11 Förvaring och hantering av reagens Reagens Förvaringstemperatur Förvaringstid cobas HCV 2 8 C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit 2 8 C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. cobas 4800 System Sample Preparation Kit C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. cobas 4800 System Wash Buffer Kit C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. cobas 4800 System Specimen Diluent C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. cobas 4800 System Lysis Kit C Hållbart till det angivna utgångsdatumet. Frys inte reagens. Extramaterial som behövs Material P/N Extraktionsplatta (djupbrunn) 2,0 ml till cobas 4800-systemet AD-platta (mikrotiter) 0,3 ml till cobas 4800-systemet Skyddsfilmapplikator CORE-spetsar, 1000 µl, rack med ml-reagensbehållare ml-reagensbehållare Rack med 24 positioner Rack med 32 positioner Påse för fast avfall (liten) eller (stor) Hamilton STAR avfallsnedkast Engångshandskar, puderfria Alla puderfria engångshandskar är godkända. Vortexmixer (ett rör) Alla typer av vortexmixer är godkända. Centrifug försedd med en swing bucket-rotor med RCF på minst Alla lämpliga centrifuger är godkända. Kontakta din Roche-representant om du vill ha mer information om material som säljs separat. Doc. Rev

12 Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer Instrument och programvara som behövs men som inte medföljer cobas 4800-systemet Instrumentet cobas x 480 Analysinstrumentet cobas z 480 Kontrollenhet Applikationsprogrammet (Core) version eller högre till cobas 4800-systemet cobas HCV AP v1.0.0 eller högre till cobas 4800-systemet I användarhandboken till cobas 4800-systemet, programversion 2.1 eller högre för cobas HCV för användning på cobas 4800-systemet (kallas fortsättningsvis för användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV) finns mer information om primär- och sekundärrör som kan användas på instrumenten. Obs! Kontakta Roche kundsupport om du vill ha en detaljerad beställningslista över provrack, spetsrack, reagensrack och plattrack som kan användas på instrumenten. Försiktighetsåtgärder och information om hantering Varningar och säkerhetsåtgärder Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratoriesed för att denna analys ska fungera korrekt. Med hänsyn till testets höga analytiska känslighet är noggrannhet nödvändig så att reagens-, prov- och amplifieringsblandningarna hålls rena. Endast för in vitro-diagnostisk användning. cobas HCV har inte utvärderats för användning som ett screeningtest för förekomst av HCV i blod eller blodprodukter. Alla patientprover ska hanteras som smittbärande material i enlighet med säkra laboratorierutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories och i CLSI-dokumentet M29-A4. 27,28 Endast personal som har erfarenhet av att hantera smittbärande material och att använda cobas HCV och cobas 4800-systemet får utföra denna procedur. Allt material av humant ursprung ska betraktas som potentiellt smittbärande och hanteras enligt allmänna säkerhetsföreskrifter. cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit innehåller plasma som härstammar från humant blod. Källmaterialet har testats med ett licensierat antikroppstest och befunnits icke-reaktivt för förekomst av antikropp mot HCV, antikropp mot HIV-1/2, antikropp mot HBsAg och antikropp mot HBc. Testning med PCR-metoder visade inte något detekterbart HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA och HBV DNA. Det finns inga testmetoder som garanterar att produkter från humant blod inte kan överföra smitta. Se till att MGP inte exponeras för magnetiska fält. Frys inte helblod eller prover som sparas i primärrör. Använd endast de förbrukningsartiklar som medföljer eller efterfrågas för att säkerställa optimal testprestanda. Säkerhetsdatablad (SDS) erhålls på begäran från er Roche-representant. Följ noga de rutiner och riktlinjer som medföljer för att säkerställa att testet utförs korrekt. Avvikelse från rutinerna och riktlinjerna kan göra att testets prestanda inte blir optimal. Doc. Rev

13 Obs! cobas HCV Falskt positiva resultat kan förekomma om kontrollen av carryover mellan prover är otillräcklig vid provhantering och -bearbetning. Ytterligare varningar, försiktighetsåtgärder och procedurer för att minska kontaminationsrisken för instrumentet cobas x 480 eller analysinstrumentet cobas z 480 finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Om du misstänker att kontamination förekommer ska du utföra rengöring och åtgärder för veckovis underhåll enligt beskrivningen i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV och i systemhandboken till cobas 4800-systemet. Utförliga instruktioner finns i Provtagning, transport och förvaring av prover. God laboratoriesed Pipettera inte med munnen. Ät, drick eller rök inte i laboratoriet. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och kitets reagens, och efter att du har tagit av dig handskarna. Använd engångshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon vid hantering av reagens. Undvik att reagensen kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Om spill förekommer, späd med vatten innan spillet torkas upp. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor i laboratoriet med en nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i destillerat eller avjoniserat vatten (hushållsblekmedel utspätt 1:10). Torka därefter av ytan med 70-procentig etanol. Reagenshantering Hantera alla reagens, kontroller och prover enligt god laboratoriesed för att förhindra carryover mellan prover eller kontroller. Kontrollera varje reagensflaska och -behållare före användning och försäkra dig om att det inte finns tecken på läckage. Använd inte material om det finns tecken på läckage. cobas 4800-lyseringsbuffert 2 innehåller guanidintiocyanat, en potentiellt farlig kemikalie. Undvik att reagens kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med rikliga mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. cobas HCV, Sample Preparation Kit 2 för cobas 4800-systemet och Specimen Diluent 2 för cobas systemet innehåller natriumazid som konserveringsmedel. Undvik att reagens kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med rikliga mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagens, späd med vatten innan spillet torkas upp. Låt inte cobas 4800-lyseringsbuffert 2, som innehåller guanidintiocyanat, komma i kontakt med natriumhypokloritlösning (blekmedel). Denna blandning kan bilda en mycket giftig gas. Kontamination Handskar ska användas och måste bytas mellan hantering av prover och cobas HCV-reagens för att undvika kontamination. Undvik att förorena handskarna när du hanterar prover och kontroller. Använd laboratoriehandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagens. Undvik mikrobiell kontamination och ribonukleaskontamination av reagens. Falskt positiva resultat kan förekomma om carryover mellan prover inte förhindras vid provhantering. Doc. Rev

14 Integritet Använd inte kit efter utgångsdatum. Blanda inte reagens. Använd inte engångsartiklar efter utgångsdatum. Alla engångsartiklar är avsedda att användas en gång. Återanvänd dem inte. All utrustning ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner. Avfallshantering cobas HCV, Sample Preparation Kit 2 för cobas 4800-systemet och Specimen Diluent 2 för cobas systemet innehåller natriumazid (se Varningar och säkerhetsåtgärder ). Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket kallt vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. Obs! Kassera oanvända reagens och avfall enligt gällande nationella, regionala och lokala föreskrifter. Information om hantering av vätskeavfall finns i motsvarande systemhandbok till cobas 4800-systemet. Spill och rengöring cobas 4800-lyseringsbuffert 2 innehåller guanidintiocyanat. Utspilld vätska som innehåller guanidintiocyanat torkas upp med lämplig laboratoriedetergent och vatten. Om den utspillda vätskan innehåller potentiellt smittbärande agenser ska det aktuella området FÖRST rengöras med laboratoriedetergent och vatten, och därefter med 0,5 % natriumhypoklorit. Om spill förekommer på instrumentet cobas x 480 ska anvisningarna i motsvarande systemhandbok till cobas 4800-systemet följas vid rengöringen. Använd inte natriumhypokloritlösning (blekmedel) vid rengöring av instrumentet cobas x 480 eller analysinstrumentet cobas z 480. Rengör instrumentet cobas x 480 eller analysinstrumentet cobas z 480 enligt anvisningarna i motsvarande systemhandbok till cobas 4800-systemet. Provtagning, transport och förvaring av prover Obs! Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. Förvara alla prover vid de angivna temperaturerna. Provernas hållbarhet påverkas vid förhöjda temperaturer. Om du använder frusna prover i sekundärrör placerar du proverna i rumstemperatur (15 30 C) tills de är helt tinade, och sedan blandar du dem en kort stund (t.ex. genom att vortexa 3 5 sekunder) och centrifugerar dem för att samla hela provvolymen i botten av röret. Provtagning Blod ska samlas upp i SST -serumseparationsrör, BD Vacutainer PPT -plasmapreparationsrör för molekylärdiagnostiska testmetoder eller i sterila rör med EDTA som antikoagulant. Obs! Användaren måste följa provrörstillverkarens instruktioner vid serum-/plasmapreparation. Doc. Rev

15 Förvaring och stabilitet för prover under transport Helblod som samlats in i SST -serumseparationsrör, BD Vacutainer PPT -plasmapreparationsrör för molekylärdiagnostiska testmetoder eller i sterila rör med EDTA som antikoagulant kan förvaras och/eller transporteras i upp till 24 timmar i 2 C till 25 C innan plasma-/serumpreparation och efterföljande testning. Plasma-/serumprover kan förvaras i sekundärrör i upp till 24 timmar i 2 C till 25 C, upp till 72 timmar i 2 C till 8 C eller upp till 6 veckor i 18 C. Separerade plasma-/serumprover i sekundärrör är hållbara i upp till tre frys/tiningscykler om de fryses i 18 C. Om prover ska transporteras ska de förpackas och etiketteras i enlighet med nationella och/eller internationella föreskrifter för transport av prover och etiologiska agens. Bruksanvisning Körning av testet Provbearbetningsvolym Standard-provbearbetningsvolymen för cobas HCV är 400 µl. För prover med låg volym kan en provbearbetningsvolym på 200 µl väljas. Det är endast i detta fall som Specimen Diluent 2 för cobas 4800-systemet måste tillsättas som ett ytterligare reagens i systemet. Användaren uppmanas att göra detta av programguiden om provtypen Diluted serum or plasma valdes när arbetsbeställningen skapades. Bild 1: Arbetsflöde för cobas HCV 1 Starta systemet 2 Utför underhåll av instrumentet 3 Ta ut prover och reagens från förvaringen 4 Starta körningen 5 Läs in parameterkorten 6 Ladda prover 7 Med LIS: bekräfta arbetsbeställning Utan LIS: skapa arbetsbeställning 8 Ladda förbrukningsartiklarna (djupbrunnsplatta, mikrotiterplatta, spetsrack) 9 Ladda reagens 10 Starta provpreparationen 11 Mata ut och förslut mikrotiterplattan 12 Ladda mikrotiterplattan i analysinstrumentet Obs! 13 Ta bort prover, använda reagens och djupbrunnsplattan 14 Granska resultat 15 Med LIS: skicka resultaten till LIS 16 Utför utmatning från analysinstrumentet Detaljerad information om användning finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Doc. Rev

16 Körningsstorlek De generiska provpreparationsreagensen (Sample Preparation Kit 2 för cobas 4800-systemet, Lysis Kit 2 för cobas systemet och Wash Buffer Kit för cobas 4800-systemet) finns i två kitstorlekar, som var och en räcker till 10 körningar med upp till antingen 24 eller 96 prover (inklusive kontrollerna och proverna som ska köras). cobas HCV finns i en kitstorlek som räcker för att testa upp till 120 (10 12) prover, inklusive kontroller och prover. cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit finns i en kitstorlek som kan användas med alla körningskonfigurationer. En lågpositiv kontroll för HBV/HCV/HIV-1, en högpositiv kontroll för HBV/HCV/HIV-1 och en negativ kontroll måste användas för varje testomgång. Maximalt 93 prover och 3 kontroller är tillåtna i en och samma testkörning. En detaljerad beskrivning av testproceduren finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Proceduren sammanfattas i Bild 1. Obs! Arbetsflöde För optimal användning av reagens kan de generiska provpreparationsreagensen användas för en körning som innehåller 1 21 prover (storlek på testkit 10 24) eller 1 93 prover (storlek på testkit 10 96). Olika kitstorlekar på Wash Buffer Kit för cobas 4800-systemet, Sample Preparation Kit 2 för cobas 4800-systemet och Lysis Kit 2 för cobas 4800-systemet kan dock inte kombineras. Om till exempel en reagensflaska med tvättbuffert för 96 test skannas när körningen startar måste reagens med storlek för 96 tester från de andra provpreparationskiten också användas. cobas HCV utförs med det fullständiga arbetsflödet i cobas 4800-programmet. Det består av provpreparation i instrumentet cobas x 480 följt av amplifiering/detektion i analysinstrumentet cobas z 480. Körningen kan vara enbart HCV, eller i ett fleranalysformat med tester som har samma process för automatisk provextraktion och samma PCR-profil för amplifiering och detektion. Programmet visar tester som är kompatibla för fleranalyskörningar med cobas HCV vid steget för val av test. Mer information finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Obs! 1. Utför systemstart och underhåll genom att följa anvisningarna i avsnittet Utföra underhåll av instrumentet i systemhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. 2. Ta fram alla reagens och förbrukningsartiklar som behövs. Alla reagens utom HCV MMX R2 och MMX R1 ska ha rumstemperatur innan de laddas i instrumentet cobas x 480. Reagensen HCV MMX R2 och MMX R1 kan tas direkt från förvaring i 2 8 C eftersom de hinner ekvilibreras till rumstemperatur i instrumentet cobas x 480 innan de används i processen. Alla reagens och reagensbehållare har streckkod och är avsedda för engångsbruk. cobas 4800-programmet registrerar användningen av reagens och reagensbehållare och matar ut tidigare använda reagens eller reagensbehållare. 3. Starta en ny körning och välj arbetsflödestypen HCV. En arbetsbeställning kan skapas på tre sätt: Genom att använda provredigeraren innan provracket laddas i instrumentet cobas x 480 (knappen Editor till höger i huvudmenyn). Arbetsbeställningar kan sparas, redigeras och matas in igen om det behövs. Genom att följa programguiden för den nya körningen och ladda proverna på instrumentet cobas x 480 vid uppmaning. Provernas streckkoder skannas automatiskt och de begärda resultaten för varje prov måste definieras. Genom att använda LIS-systemet på din arbetsplats. Mer information finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Markera HCV när du väljer de begärda resultaten. 4. Ladda proverna och definiera/välj arbetsbeställning eller använd LIS. Minsta provvolym beror på rörtyp och -storlek. Mer information finns i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Doc. Rev

17 Obs! Obs! Obs! cobas HCV 5. Följ programguiden och ladda förbrukningsartiklarna. Ladda inte och ta inte heller bort enskilda spetsar i ett delvis använt spetsrack, eftersom programmet registrerar antalet kvarvarande spetsar. Om det inte finns tillräckligt många spetsar för att körningen ska kunna genomföras kommer programmet att varna användaren om detta. 6. Ladda provpreparationsreagensen i de streckkodsmärkta reagensbehållarna. Reagensbehållarna finns i två storlekar: 200 ml och 50 ml. Följ programguiden och välj rätt storlek på reagensbehållarna. Reagensbehållarnas streckkoder måste vara vända åt höger i reagensracket. Använd scan-scan-pour-place -metoden för att ladda provpreparationsreagensen: Skanna reagensflaskans streckkod. Skanna reagensbehållarens streckkod. Häll reagenset i behållaren. Placera den fyllda reagensbehållaren på avsedd plats i reagensracket. cobas 4800-systemet har en intern klocka som övervakar den tid som reagensen finns i instrumentet. Efter att LYS 2 eller WB har skannats har man 1 timme på sig att utföra laddningen och klicka på Start -knappen. Ett tidur visas som räknar ned tiden på fliken Workplace. Systemet tillåter inte att körningen startar om tiden som reagensen finns i instrumentet har gått ut. Säkerställ noggrann överföring av MGP genom att vortexa eller kraftigt skaka MGP-flaskan omedelbart före dispensering i reagensbehållaren. 7. Ladda flaskor med amplifierings-/detektionsreagens (HCV MMX R2, MMX R1 och RNA QS), kontrollflaskor [HBV/HCV/HIV-1 L(+)C, HBV/HCV/HIV-1 H(+)C och ( ) C] och flaskor med generiskt reagens (P2 och SD2 efter behov) direkt i reagensracket. För att förhindra onödiga avbrott i körningen samt kontamination måste du försiktigt knacka reagensröret mot bordet för att undvika vätskedroppar/vätskefilm på kanten, och du måste även byta handskar efter hantering av positiva kontroller. 8. Efter att provpreparationskörningen slutförts blir knapparna Sample Preparation results och Unload tillgängliga. Välj knappen Sample Preparation results om du vill granska resultaten och välj sedan Unload för att mata ut plattracken. Alternativt kan du välja Unload för att mata ut plattracket utan att granska resultaten. Se användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. 9. Följ anvisningarna i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV för att försluta mikrotiterplattan, transportera plattan till analysinstrumentet cobas z 480 och starta amplifierings- och detektionskörningen. cobas 4800-systemet har en intern klocka som övervakar tiden efter tillsats av de preparerade proverna till aktiverad master mix. Amplifiering och detektion ska startas så snart som möjligt men senast 40 minuter efter att körningen i instrumentet cobas x 480 avslutats. Ett tidur visas som räknar ned tiden på fliken Workplace. Systemet avbryter körningen om tiden har gått ut. 10. När amplifierings- och detektionskörningen är klar ska mikrotiterplattan matas ut från analysinstrumentet cobas z Följ anvisningarna i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV för att granska och godkänna resultaten. Doc. Rev

18 Resultat cobas 4800-systemet fastställer automatiskt HCV RNA-koncentrationen för proverna och kontrollerna. HCV RNAkoncentrationen uttrycks i internationella enheter per milliliter (IU/ml). Kvalitetskontroll och giltighet för resultaten En negativ kontroll ( ) C och två positiva kontroller, en lågpositiv kontroll HBV/HCV/HIV-1 L(+)C och en högpositiv kontroll HBV/HCV/HIV-1 H(+)C bearbetas i varje provomgång. Kontrollera giltigheten för provomgången i cobas 4800-programmet och/eller i rapporten. Ogiltigförklarande av resultat utförs automatiskt av cobas 4800-programmet baserat på misslyckade negativa och positiva kontroller. Kontrollflaggor Tabell 1: Kontrollflaggor för negativa och positiva kontroller Negativ kontroll Flagg-id Resultat Betydelse ( ) C R4803, R4804 (Misslyckad kontrollbatch) Invalid Ett ogiltigt resultat eller det beräknade titerresultatet för den negativa kontrollen är inte negativt. Positiv kontroll Flagg-id Resultat Betydelse HBV/HCV/HIV-1 L(+)C R4803, R4804 (Misslyckad kontrollbatch) Invalid Ett ogiltigt resultat eller det beräknade titerresultatet för den lågpositiva kontrollen ligger inte inom det tilldelade intervallet. HBV/HCV/HIV-1 H(+)C R4803, R4804 (Misslyckad kontrollbatch) Invalid Ett ogiltigt resultat eller det beräknade titerresultatet för den högpositiva kontrollen ligger inte inom det tilldelade intervallet. Om omgången är ogiltig måste du upprepa testningen av hela omgången inklusive prover och kontroller. Doc. Rev

19 Tolkning av resultat Obs! Obs! All analys- och omgångsvalidering bestäms av cobas 4800-programmet. En giltig omgång kan innehålla båda giltiga och ogiltiga provresultat. Om omgången är giltig tolkas provresultaten enligt Tabell 2. Tabell 2: Tolkning av resultat för enskilda mål cobas HCV Target Not Detected < Titer Min Titer HCV RNA inte detekterat. Resultatrapport och tolkning Rapportera resultat som HCV not detected. Beräknad titer ligger under analysens nedre kvantifieringsgräns (LLoQ). Rapportera resultat som HCV detected, less than (Titer Min). Titer min = 1,50E+01 IU/ml (400 µl) Titer min = 2,50E+01 IU/ml (200 µl) Beräknad titer ligger inom analysens linjära intervall större än eller lika stor som Titer Min och mindre än eller lika stor som Titer Max. Rapportera resultat som (Titer) of HCV detected. Beräknad titer ligger över analysens övre kvantifieringsgräns (ULoQ). Rapportera resultat > Titer Max a som HCV detected, greater than (Titer Max). Titer max = 1,00E+08 IU/ml (400 µl och 200 µl) a Provresultat > Titer Max hänvisar till HCV-positiva prover som detekterats med titrar över analysens övre kvantifieringsgräns (ULoQ). Om ett kvantitativt resultat önskas ska det ursprungliga provet spädas med HCV-negativ EDTA-plasma eller serum, beroende på det ursprungliga provets typ, och testet upprepas. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. Testets begränsningar 1. cobas HCV har endast validerats för användning tillsammans med cobas HBV/HCV/HIV-1 Control Kit, Sample Preparation Kit 2 för cobas 4800-systemet, Lysis Kit 2 för cobas 4800-systemet, System Wash Buffer Kit för cobas 4800-systemet och Specimen Diluent 2 för cobas 4800-systemet. 2. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och behandling av prover. Följ procedurerna i bruksanvisningen (kallas även bipacksedel) och i användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. 3. Detta test har endast validerats för användning med EDTA-plasma och serum. Testning av andra provtyper kan resultera i felaktiga resultat. 4. Kvantifiering av HCV RNA är beroende av antalet viruspartiklar i provet och kan påverkas av provtagningsmetoder, patientfaktorer (dvs. ålder, förekomst av symptom) och/eller infektionsstadium. 5. I sällsynta fall kan mutationer inom de maximalt konserverade regionerna på ett virusgenom som täcks in av cobas HCV påverka primer- och/eller probbindning, vilket resulterar i för låg kvantifiering av virus eller misslyckad detektering av förekomst av virus. 6. Det prediktiva värdet för en analys beror på sjukdomens prevalens i en viss population. 7. Tillsats av AmpErase-enzym i cobas HCV-master mix möjliggör selektiv amplifiering av mål-nukleinsyra. Kontamination av reagens och av amplifieringsblandningarna kan dock endast undvikas om god laboratoriesed tillämpas och om de procedurer som beskrivs i den här bruksanvisningen följs noga. 8. Produkten får endast användas av personal med utbildning i PCR-teknik och användning av cobas 4800-systemet. Doc. Rev

20 9. Endast instrumentet cobas x 480 och analysinstrumentet cobas z 480 har validerats för att användas tillsammans med denna produkt. Inga andra provpreparationsinstrument eller PCR-system kan användas med denna produkt. 10. På grund av inneboende skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. Användarna ska följa sina egna specifika regler och procedurer. 11. Korskontamination kan orsaka falskt positiva resultat. Procenttalet för korskontamination mellan prover för cobas HCV har fastställts till 0,0 % i en icke-klinisk studie. Korskontamination mellan körningar har inte observerats. 12. cobas HCV är inte avsett för användning som ett screeningtest för förekomst av HCV i blod eller blodprodukter. Icke-klinisk egenskapsutvärdering Viktiga egenskaper Detektionsgräns (LoD) WHO:s internationella standard Detektionsgränsen för cobas HCV fastställdes genom analys av seriella spädningar av WHO:s fjärde internationella standard för HCV RNA för NAT-testning (Nucleic Acid Amplification Technology), genotyp 1a, erhållet från NIBSC, i HCV-negativ EDTA-plasma eller serum med provbearbetningsvolymer på 400 µl och 200 µl. Paneler med sex koncentrationsnivåer plus ett negativt prov testades med tre loter av cobas HCV-reagens under flera körningar och dagar och med olika användare och instrument. Resultaten för EDTA-plasma och serum från båda provbearbetningsvolymerna visas i Tabell 3 till Tabell 6. Studien visar att cobas HCV detekterade HCV RNA vid en koncentration på 9,2 IU/ml i EDTA-plasma och 7,6 IU/ml i serum med en träffsannolikhet på 95 % med PROBIT för provbearbetningsvolymen 400 µl och vid en koncentration på 15,2 IU/ml i EDTA-plasma och 15,3 IU/ml i serum med en träffsannolikhet på 95 % med PROBIT för provbearbetningsvolymen 200 µl. Tabell 3: Detektionsgräns i EDTA-plasma (400 µl) Input-koncentration för titer (HCV RNA IU/ml) Antal giltiga replikat Antal positiva Träffsannolikhet 42, ,0 % 21, ,0 % 15, ,4 % 9, ,4 % 5, ,8 % 3, ,0 % 0, ,0 % Detektionsgräns genom PROBIT vid 95 % träffsannolikhet 9,2 IU/ml 95 % konfidensintervall: 7,8 11,5 IU/ml Doc. Rev

21 Tabell 4: Detektionsgräns i serum (400 µl) Input-koncentration för titer (HCV RNA IU/ml) Antal giltiga replikat Antal positiva Träffsannolikhet 42, ,0 % 21, ,0 % 15, ,0 % 9, ,2 % 5, ,3 % 3, ,3 % 0, ,0 % Detektionsgräns genom PROBIT vid 95 % träffsannolikhet 7,6 IU/ml 95 % konfidensintervall: 6,5 9,5 IU/ml Tabell 5: Detektionsgräns i EDTA-plasma (200 µl) Input-koncentration för titer (HCV RNA IU/ml) Antal giltiga replikat Antal positiva Träffsannolikhet 60, ,0 % 45, ,0 % 25, ,0 % 18, ,0 % 10, ,1 % 5, ,7 % 0, ,0 % Detektionsgräns genom PROBIT vid 95 % träffsannolikhet 15,2 IU/ml 95 % konfidensintervall: 13,1 18,5 IU/ml Tabell 6: Detektionsgräns i serum (200 µl) Input-koncentration för titer (HCV RNA IU/ml) Antal giltiga replikat Antal positiva Träffsannolikhet 60, ,0 % 45, ,0 % 25, ,6 % 18, ,2 % 10, ,1 % 5, ,4 % 0, ,0 % Detektionsgräns genom PROBIT vid 95 % träffsannolikhet 15,3 IU/ml 95 % konfidensintervall: 13,1 18,7 IU/ml Doc. Rev

22 Linjärt intervall Linjäriteten för cobas HCV fastställdes genom analys av en spädningsserie bestående av 13 panelprover med den dominerande HCV-genotypen (GT 1a) som täckte in analysens linjära intervall. Panelprover med hög titer preparerades från en armored RNA-stam (arrna) med hög titer, medan panelprover med låg titer preparerades från ett kliniskt prov. Linjäritetspanelen utformades så att den hade en ungefärlig överlappning om 2 log 10 titer mellan de två materialkällorna. Med provbearbetningsvolymen 400 µl är cobas HCV linjär för EDTA-plasma och serum från 15,0 IU/ml till 1,0E+08 UI/ml och visar en maximal avvikelse från den bättre passande icke-linjära regressionen på mindre än ± 0,08 log 10. Över hela det linjära intervallet var noggrannheten för testet inom ± 0,20 log 10 för EDTA-plasma och inom ± 0,23 log 10 för serum. Med provbearbetningsvolymen 200 µl är cobas HCV linjär för EDTA-plasma och serum från 25 IU/ml till 1,0E+08 UI/ml och visar en maximal avvikelse från den bättre passande icke-linjära regressionen på mindre än ± 0,09 log 10. Över hela det linjära intervallet var noggrannheten för testet inom ± 0,20 log 10för EDTA-plasma och inom ± 0,25 log 10för serum. I Bild 2 till Bild 5 visas representativa resultat. Bild 2: Linjäritet i EDTA-plasma (400 µl) Observerad log-titer [koncentrationsenheter] Observationer I det specificerade intervallet Regressionslinje Kvadratisk modell Övre avvikelsegräns Nedre avvikelsegräns Tilldelad log-titer [koncentrationsenheter] Doc. Rev

23 Bild 3: Linjäritet i serum (400 µl) Observerad log-titer [koncentrationsenheter] Observationer I det specificerade intervallet Regressionslinje Kvadratisk modell Övre avvikelsegräns Nedre avvikelsegräns Tilldelad log-titer [koncentrationsenheter] Bild 4: Linjäritet i EDTA-plasma (200 µl) Observerad log-titer [koncentrationsenheter] Observationer I det specificerade intervallet Regressionslinje Kubisk modell Övre avvikelsegräns Nedre avvikelsegräns Tilldelad log-titer [koncentrationsenheter] Doc. Rev

24 Bild 5: Linjäritet i serum (200 µl) Observerad log-titer [koncentrationsenheter] Observationer I det specificerade intervallet Regressionslinje Kubisk modell Övre avvikelsegräns Nedre avvikelsegräns Tilldelad log-titer [koncentrationsenheter] Precision inom laboratoriet Precisionen för cobas HCV bestämdes genom analys av seriella spädningar av kliniska HCV-prover (genotyp 1a) och av armored RNA HCV (arrna) i HCV-negativ EDTA-plasma och serum. Fem spädningsnivåer testades i 72 replikat för varje nivå, matris och provbearbetningsvolym över tre loter av cobas HCV-reagens med två instrument och tre användare under 12 dagar. Varje prov genomgick hela cobas HCV-proceduren på cobas 4800-systemet. Därför representerar den precision som anges här alla aspekter av testproceduren. Resultaten visas i Tabell 7 till Tabell 10. cobas HCV visade hög precision för tre reagensloter som testades i ett koncentrationsintervall från 1,0E+02 IU/ml till 1,0E+08 IU/ml med både 200 µl och 400 µl provbearbetningsvolym. Tabell 7: Precision inom laboratoriet för cobas HCV (EDTA-plasmaprover provbearbetningsvolym 400 µl)* Nominell koncentration (IU/ml) Tilldelad koncentration (IU/ml) Källmaterial EDTA-plasma Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alla loter SD SD SD Poolad SD 1,0E+08 8,5E+07 arrna 0,05 0,06 0,05 0,06 1,0E+07 8,5E+06 arrna 0,06 0,06 0,06 0,06 4,0E+05 3,4E+05 arrna 0,06 0,05 0,06 0,06 1,0E+04 9,9E+03 Kliniska prover 0,10 0,10 0,10 0,10 1,0E+03 9,9E+02 Kliniska prover 0,09 0,08 0,07 0,08 * Titerdata anses ha fördelats log-normalt och analyseras efter omvandling enligt log 10. I kolumnerna för standardavvikelse (SD) visas totalvärdet för den log-omvandlade titern för var och en av de tre reagensloterna. Doc. Rev

25 Tabell 8: Precision inom laboratoriet för cobas HCV (serumprover provbearbetningsvolym 400 µl)* Nominell koncentration (IU/ml) Tilldelad koncentration (IU/ml) Källmaterial Serum Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alla loter SD SD SD Poolad SD 1,0E+08 6,5E+07 arrna 0,07 0,12 0,14 0,12 1,0E+07 6,5E+06 arrna 0,07 0,07 0,09 0,08 4,0E+05 2,6E+05 arrna 0,07 0,06 0,07 0,07 1,0E+04 7,9E+03 Kliniska prover 0,07 0,05 0,08 0,07 1,0E+03 7,9E+02 Kliniska prover 0,07 0,05 0,06 0,06 * Titerdata anses ha fördelats log-normalt och analyseras efter omvandling enligt log 10. I kolumnerna för standardavvikelse (SD) visas totalvärdet för den log-omvandlade titern för var och en av de tre reagensloterna. Tabell 9: Precision inom laboratoriet för cobas HCV (EDTA-plasma provbearbetningsvolym 200 µl)* Nominell koncentration (IU/ml) Tilldelad koncentration (IU/ml) Källmaterial EDTA-plasma Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alla loter SD SD SD Poolad SD 1,0E+08 8,5E+07 arrna 0,07 0,09 0,06 0,07 1,0E+07 8,5E+06 arrna 0,05 0,05 0,05 0,05 4,0E+05 3,4E+05 arrna 0,04 0,05 0,07 0,05 1,0E+04 9,9E+03 Kliniska prover 0,06 0,06 0,07 0,06 1,0E+03 9,9E+02 Kliniska prover 0,06 0,07 0,05 0,06 * Titerdata anses ha fördelats log-normalt och analyseras efter omvandling enligt log 10. I kolumnerna för standardavvikelse (SD) visas totalvärdet för den log-omvandlade titern för var och en av de tre reagensloterna. Tabell 10: Precision inom laboratoriet för cobas HCV (serum provbearbetningsvolym 200 µl)* Nominell koncentration (IU/ml) Tilldelad koncentration (IU/ml) Källmaterial Serum Lot 1 Lot 2 Lot 3 Alla loter SD SD SD Poolad SD 1,0E+08 6,5E+07 arrna 0,05 0,06 0,06 0,06 1,0E+07 6,5E+06 arrna 0,07 0,07 0,05 0,06 4,0E+05 2,6E+05 arrna 0,08 0,05 0,07 0,07 1,0E+04 7,9E+03 Kliniska prover 0,04 0,04 0,04 0,04 1,0E+03 7,9E+02 Kliniska prover 0,04 0,06 0,05 0,05 * Titerdata anses ha fördelats log-normalt och analyseras efter omvandling enligt log 10. I kolumnerna för standardavvikelse (SD) visas totalvärdet för den log-omvandlade titern för var och en av de tre reagensloterna. Doc. Rev

26 Verifiering av genotyp Prestandan för cobas HCV på HCV-genotyper utvärderades genom: Verifiering av detektionsgränsen för genotyp 1b till 6 Verifiering av linjäriteten för genotyp 1b till 6 Titertilldelning utfördes med hjälp av cobas HCV. Verifiering av detektionsgräns för genotyp 1b till 6 Kliniska HCV RNA-prover för sex olika genotyper (1b, 2, 3, 4, 5, 6) späddes i EDTA-plasma och serum till LODkoncentrationen i EDTA-plasma för den dominerande genotypen (HCV GT 1a) baserat på LoD-analys med 95 % träffsannolikhet (15,0 IU/ml). Analys av träffsannolikheten utfördes med 42 replikat för varje genotyp och provmatris. De här resultaten bekräftar att cobas HCV detekterade HCV för HCV-genotyperna 1b, 2, 3, 4, 5 och 6 vid koncentrationen 15 IU/ml med ett övre ensidigt 95-procentigt konfidensintervall som var större än den förväntade träffsannolikheten på 95 %. Tabell 11: LoD-verifiering av HCV-genotyperna 1b 6 i 400 µl EDTA-plasma Genotyp Träffsannolikhet Övre ensidigt 95 % konfidensintervall GT 1b 95,2 % 99,1 % GT 2 100,0 % 100,0 % GT 3 100,0 % 100,0 % GT 4 100,0 % 100,0 % GT 5 100,0 % 100,0 % GT 6 97,6 % 99,9 % Tabell 12: LoD-verifiering av HCV-genotyperna 1b 6 i 400 µl serum Genotyp Träffsannolikhet Övre ensidigt 95 % konfidensintervall GT 1b 100,0 % 100,0 % GT 2 100,0 % 100,0 % GT 3 100,0 % 100,0 % GT 4 100,0 % 100,0 % GT 5 100,0 % 100,0 % GT 6 100,0 % 100,0 % Doc. Rev

27 Verifiering av det linjära intervallet för genotyperna 1b till 6 Spädningsserierna som användes i studien för verifiering av linjäritet för genotyper i cobas HCV består av nio panelprover som täckte in det avsedda linjära intervallet. Panelprover med hög titer preparerades från en arrna-stam med hög titer, medan panelprover med låg titer preparerades från ett kliniskt prov med hög titer. Linjäritetspanelen utformades så att den hade en minimi-överlappning om 2 log 10 titer mellan de två materialkällorna. Det linjära intervallet för cobas HCV sträckte sig från LLoQ (15,0 IU/ml för en provbearbetningsvolym om 400 µl) till ULoQ (1,0E+08 IU/ml) och inkluderade minst två medicinska beslutspunkter. Tolv replikat per nivå testades i EDTA-plasma. Det linjära intervallet för cobas HCV verifierades för alla sex genotyperna (1b, 2, 3, 4, 5 och 6). Den maximala avvikelsen mellan den linjära regressionen och den bättre passande icke-linjära regressionen var lika stor som eller mindre än 0,14 log 10. Specificitet Specificiteten för cobas HCV bestämdes genom analys av HCV-negativa EDTA-plasmaprover och serumprover från enskilda blodgivare. Här testades 612 enskilda EDTA-plasmaprover och 613 enskilda serumprover (totalt resultat) med tre loter av cobas HCV-reagens. Resultatet var att 609 prover i EDTA-plasma och 613 prover i serum testades negativt för HCV RNA. I testpanelen var specificiteten för cobas HCV 99,5 % i plasma (95 % konfidensgräns: 98,7 %) och 100,0 % (95 % konfidensgräns: 99,5 %) i serum. Analytisk specificitet Den analytiska specificiteten för cobas HCV utvärderades genom att späda en panel med patogener (Tabell 13) med HCV RNA-positiv- och HCV RNA-negativ EDTA-plasma. Patogenerna tillsattes i negativ EDTA-plasma och testades med och utan HCV RNA. Negativa resultat erhölls med cobas HCV för alla patogena prover utan HCV-mål och positiva resultat erhölls för alla patogena prover med HCV-mål. Dessutom var den genomsnittliga log 10-titern för vart och ett av de positiva HCV-proverna som innehöll potentiellt korsreagerande organismer inom ± 0,09 log 10 för den genomsnittliga log 10-titern för den respektive positiva spikade kontrollen. Tabell 13: Patogener som testades för korsreaktivitet Virus Bakterier Svamp Adenovirus typ 5 Herpes simplex-virus typ 1 och 2 Propionibacterium acnes Candida albicans Cytomegalovirus Humant papillomavirus Staphylococcus aureus Dengue-virus typ 1, 2, 3 och 4 Influenza-virus A Epstein-Barr-virus Murray Valley-encefalitvirus FSME-virus (stam HYPR) St. Louis-encefalitvirus Hepatit A-virus Varicella-zoster-virus Hepatit B-virus Västra Nilen-virus Humant immunbristvirus 1 Gula febern-virus Humant T-cellymfotropvirus typ 1 och 2 Zika-virus Humant herpesvirus typ 6 Doc. Rev

28 Analytisk specificitet interfererande substanser Förhöjda nivåer av triglycerider (27,9 29,0 g/l), konjugerat bilirubin (0,18 0,22 g/l), okonjugerat bilirubin (0,19 0,2 g/l), albumin (57,8 60,6 g/l), hemoglobin (1,8 2,3 g/l) och humant DNA (2 mg/l) i proverna testades vid förekomst och avsaknad av HCV RNA. De testade substanserna visades inte interferera med testprestandan för cobas HCV. Dessutom testades förekomst av markörer för de autoimmuna sjukdomarna systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA) och antinukleära antikroppar (ANA). Läkemedelsföreningarna som listas i Tabell 14 testades även vid tre gånger Cmax vid förekomst och avsaknad av HCV RNA. Alla potentiellt interfererande substanser har visats inte interferera med testets prestanda. Negativa resultat erhölls med cobas HCV för alla prover utan HCV-mål och positiva resultat erhölls för alla prover med HCV-mål. Dessutom var den genomsnittliga log 10-titern för vart och ett av de positiva HCV-proverna som innehöll potentiellt interfererande substanser inom ± 0,04 log 10 för den genomsnittliga log 10-titern för den respektive positiva spikade kontrollen. Tabell 14: Läkemedelsföreningar testade för interferens med kvantifiering av HCV RNA med cobas HCV Läkemedelsgrupp Generiskt läkemedelsnamn Immunmodulatorer Peginterferon -2a Ribavirin HIV-inträdeshämmare Peginterferon -2b Maraviroc HIV-integrashämmare Elvitegravir/kobicistat Raltegravir Icke-nukleosid HIV reverse transkriptas-hämmare Efavirenz Etravirin Nevirapin Rilpivirin HIV-proteashämmare Atazanavir Nelfinavir HCV-proteashämmare Darunavir Fosamprenavir Lopinavir Boceprevir Simeprevir Ritonavir Sakvinavir Tipranavir Telaprevir Omvänt transkriptas- eller DNA polymeras-hämmare Föreningar för behandling av opportunistiska infektioner Abacavir Aciclovir Adefovir dipivoxil Cidofovir Emtricitabin Entecavir Foskarnet Azitromycin Klaritromycin Etambutol Flukonazol Isoniazid Ganciklovir Lamivudin Sofosbuvir Telbivudin Tenofovir Valganciclovir Zidovudin Pyrazinamid Rifabutin Rifampicin Sulfametoxazol Trimetoprim Doc. Rev

29 Metodkorrelation Egenskapsutvärdering av cobas HCV jämfört med testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative, v2.0 Prestandan för cobas HCV och testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative, v2.0 (testet TaqMan HCV, v2.0) jämfördes genom analys av serumprover och EDTA-plasmaprover från HCV-smittade patienter. Totalt 176 EDTA-plasmaprover och 176 serumprover för alla HCV-genotyper som analyserades i duplikat var giltiga och låg inom kvantifieringsintervallet för båda testen. Demings regressionsanalys utfördes. Medeltiteravvikelsen för proverna som testades med de två testen var 0,0 log 10 (95-procentigt konfidensintervall: -0,01; 0,01). Resultaten för Demings regressionsanalys visas i Bild 6. Symbolen * i bilderna visar den separata bestämningen. Färgen representerar genotypen. Bild 6: Regressionsanalys för cobas HCV jämfört med testet TaqMan HCV v2.0, EDTA-plasmaprover och serumprover Genomsnittlig log10-titer testet cobas 4800 HCV y = 1,02x 0,08 R 2 = 0,99 Genotyp Linjer Deming-regressionslinje Genomsnittlig log10-titer testet COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV v2.0 Doc. Rev

30 Matrisekvivalens EDTA-plasma jämfört med serum 114 parade EDTA-plasma- och serumprover analyserades med avseende på matrisekvivalens. Av dessa var 59 parade prover HCV-positiva prover. De HCV-positiva proverna täckte genotyperna 1 till 5 i det linjära intervallet. Medeltiteravvikelsen som uppmättes för de matchande EDTA-plasma- och serumproverna var 0,04 log 10 (95-procentigt konfidensintervall: 0,00; 0,08) (Bild 7). Bild 7: Utfall av utvärdering av matrisekvivalens mellan EDTA-plasma och serum Log10-titer testet cobas 4800 HCV, serum y = 0,98x + 0,11 R 2 = 0,99 Genotyp Linjer Deming-regressionslinje Log10-titer testet cobas 4800 HCV, matchande plasmaprover Felfrekvens inom hela systemet Felfrekvensen inom hela systemet för cobas HCV bestämdes genom testning av 100 replikat av EDTA-plasma spikat med HCV-mål. De här proverna testades vid en målkoncentration på ungefär 3 LLoQ (45,0 IU/ml). Resultaten i den här studien fastställde att samtliga replikat var giltiga och positiva för HCV, vilket gav en felfrekvens inom hela systemet på 0,0 %. Det tvåsidiga 95-procentiga exakta konfidensintervallet var 0,0 % för den nedre gränsen och 3,6 % för den övre gränsen [0,0 %: 3,6 %]. Korskontamination Nivån för korskontamination för cobas HCV bestämdes genom testning av 230 replikat av HCV-negativa EDTAplasmaprover och 235 replikat av ett HCV-prov med hög titer vid 1,8E+08 IU/ml. Sammanlagt fem körningar utfördes med positiva och negativa prover i en checkerboard-konfiguration. 229 av de 230 replikaten av de negativa proverna var giltiga och detekterat negativa, vilket gav en korskontaminationsnivå på 0,0 % med ett ensidigt 95-procentigt konfidensintervall på 1,3 %. Doc. Rev

31 Ytterligare information Viktiga analysegenskaper Provtyp Minsta mängd prov som krävs EDTA-plasma, serum Se användarhandboken till cobas 4800-systemet för cobas HCV. Provbearbetningsvolym 400 µl eller 200 µl Analytisk sensitivitet Linjärt intervall 9,2 IU/ml (400 µl) 15,3 IU/ml (200 µl) 400 µl: 15,0 IU/ml 1,0E+08 IU/ml 200 µl: 25,0 IU/ml 1,0E+08 IU/ml Specificitet 99,5 % (ensidigt 95-procentigt konfidensintervall: 98,7 %) Detekterade genotyper HCV-genotyp 1 6 Doc. Rev

32 Symboler Följande symboler används vid märkning av Roche PCR diagnostiska produkter. Tabell 15: Symboler som används vid märkning av Roche PCR diagnostiska produkter Stödprogramvara Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen Lägre gräns för tilldelat intervall Streckkodsdatablad Tillverkare Lotnummer Förvaras mörkt Biologisk risk Innehåller tillräckligt med reagens för <n> analyser Katalognummer Temperaturgräns Se bruksanvisningen Testdefinitionsfil Utrustningen innehåller Övre gräns för tilldelat intervall Distribueras av Utgångsdatum Endast för IVD-egenskapsutvärdering GTIN-nummer Denna produkt uppfyller kraven enligt det Europeiska direktivet 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik. Teknisk support för kunder i USA Doc. Rev

33 Tillverkare och distributörer Tabell 16: Tillverkare och distributörer Tillverkad i USA Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse Mannheim, Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, Boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Strasse 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal Varumärken och patent Se Copyright 2016 Roche Molecular Systems, Inc. Doc. Rev