LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

Transkript

1 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 Tests P/N: LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 Tests P/N: LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK 96 Tests P/N: Well Tray with Lid 1 Each P/N: AVSEDD ANVÄNDNING LINEAR ARRAY HPV (Human Papilloma Virus) Genotyping Test är ett kvalitativt in vitro-test för detektion av humant papillomavirus i kliniska prover. I testet används amplifiering av target DNA genom PCR-teknik (Polymerase Chain Reaction) och nukleinsyrahybridisering. Genom testet detekteras trettiosju anogenitala HPV DNA-genotyper [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 och CP6108] i cervixceller som tagits i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt -lösning. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Ihållande infektion med humant papillomavirus (HPV) är huvudorsaken till cervixcancer och dess förstadium CIN (cervical intraepitelial neoplasi) 1 3. HPV är involverat i mer än 99 % av cervixcancerfallen i världen 3. HPV är ett litet, dubbelsträngat DNA-virus utan hölje, med ett genom på cirka nukleotider. Det finns fler än 100 olika genotyper av HPV och cirka 40 olika HPV-genotyper som kan infektera människans genitala slemhinnor. Endast ett fåtal av de här sexuellt överförbara virusgenotyperna leder emellertid till höggradig cervixdysplasi och cervixcancer 3 5. Dessa kallas högrisk-hpv-genotyper, medan lågrisk-hpv-genotyper ofta leder till låggradiga intraepiteliala lesioner eller kondylom. Sexuellt överförd HPV-infektion är mycket vanligt; upp till 75 % av alla kvinnor uppskattas ha exponerats för HPV vid något tillfälle 6. Majoriteteten av alla HPV-infektioner går över av sig själv, men en ihållande infektion av högrisk- HPV utgör en betydande risk för utveckling av cervixcancer. I industriländer där det pågår screeningprogram mot cervixcancer har Pap smear (namngiven efter Dr. George Papanicolaou) sedan mitten av 1950-talet varit det huvudsakliga hjälpmedlet för att upptäcka tidiga förstadium till cervixcancer. Tack vare Pap smear har dödssiffrorna till följd av cervixcancer minskat dramatiskt i dessa länder. Metoden kräver dock att högutbildade cytopatologer tolkar resultaten som är relativt oprecisa med många falskt negativa resultat. Cytologiska abnormiteter som påvisas med Pap smear-metoden beror oftast på HPV-infektion; olika inflammatoriska variationer eller provtagnings - variationer kan emellertid resultera i falskt positiva Pap-resultat. För ett säkert resultat vid onormal Pap smear krävs upprepad testning, kolposkopi och biopsi. En histologiskt bekräftad höggradig lesion måste avlägsnas kirurgiskt för att förhindra utveckling av invasiv cervixcancer. Papillomavirus är mycket svårt att odla in vitro, och vissa av de patienter som är HPV-infekterade saknar ett påvisbart antikroppssvar. Därför är nukleinsyratestning (DNA) med PCR-teknik en känslig och icke-invasiv metod för att bestämma förekomst av pågående cervix-hpv-infektion. Rapporterade användningsområden för HPV-typningstest omfattar utvärdering av anskaffande och eliminering av specifika HPV-typer 7 ; övervakning av typspecifikt motstånd för genotyper som associeras med högre risk för cervixsjukdom och cervixkarcinogenicitet 8 ; hur effektiv kirurgisk behandling 9, strålnings - behandling 10 eller läkemedelsbehandling 11 är mot HPV-associerade lesioner (behandlingstest); genotypning i utvalda screeningprogram före och efter införandet av vaccination 12 ; samt förenkling av epidemiologiska undersökningar avseende naturlig historik för HPV-infektioner. ANVÄNDNINGSPRINCIPER LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test baseras på fyra grundläggande principer: extraktion, PCRamplifiering 13 av target DNA med hjälp av HPV-primers, hybridisering av de amplifierade produkterna till oligonukleotidprober samt detektion av de probbundna amplifierade produkterna genom kolorimetrisk bestämning. Avsnittet med information om revidering av dokumentet finns i slutet av det här dokumentet SV 1 Doc Rev. 11.0

2 En provextraktion som utförs med AmpliLute Liquid Media Extraction Kit ger HPV-target DNA och humant genomiskt DNA som är lämpligt för PCR-amplifiering. Master Mix-reagenset innehåller primers för amplifiering av DNA från 37 HPV-genotyper och den humana ß-globin-genen. Detektion och bestämning av genotyp utförs med hjälp av denaturerat amplifierat DNA och en array med oligonukleotidprober som möjliggör oberoende identifiering av enskilda HPV-genotyper. Extraktion HPV DNA frigörs genom att cervixcellprover lyseras vid denatureringsförhållanden med förhöjd temperatur. Lysering görs i närvaro av proteinas K, kaotropiskt agens och detergent, och följs av isolering och rening av DNA via en kolonn och eluering med elueringsreagens. ß-globin-genen isoleras samtidigt, och cellernas lämplighet, extraktion och amplifiering fastställs för varje enskilt extraherat prov. PCR-amplifiering Val av target I LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test används biotinylerade primers för att definiera en sekvens nukleotider inom den polymorfa L1-regionen av HPV-genomet som är ungefär 450 baspar lång. En pool av HPV-primers som är närvarande i Master Mix är utformade till att amplifiera HPV DNA från 37 HPVgenotyper 14 inklusive 13 högriskgenotyper* (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 och 68) 3 5. Captureprob-sekvenser finns i polymorfa regioner i L1, bundna av dessa primers. Ytterligare ett primerpar har den humana ß-globin-genen som mål så att cellämplighet, extraktion och amplifiering kontrolleras. Amplifiering av target AmpliTaq Gold DNA-polymeras används för hot start -amplifiering av HPV target DNA och ß-globinkontrollen. PCR-reaktionsblandningen upphettas först så att AmpliTaq Gold DNA-polymeras aktiveras. Virus-DNA och humant genomiskt DNA denatureras och primer-målsekvenserna exponeras. När blandningen svalnar binder primers (både uppströms- och nedströms-) till target DNA. AmpliTaq Gold DNA-polymeras förlänger, i närvaro av Mg 2+ och överskotts-dntp, bundna primers längs målsekvensen för att producera en cirka 450 baspars dubbelsträngad HPV target DNA-molekyl eller en 268 baspars ß-globin DNA-molekyl som kallas ett amplicon. Proceduren upprepas för ett antal cykler, där varje cykel effektivt fördubblar mängden amplicon-dna. Amplifiering förekommer endast i regionen för HPVgenomet eller ß-globin-genen mellan motsvarande primerpar. Hela genomet amplifieras inte. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av target-nukleinsyra från provet kan göras med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test genom användning av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) och deoxiuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet påvisar och katalyserar nedbrytning av DNA-strängar som innehåller deoxiuridin 15, men inte DNA som innehåller deoxitymidin. Deoxiuridin finns inte i naturligt förekommande DNA, men finns alltid i amplicon på grund av användningen av deoxiuridintrifosfat jämte deoxitymidintrifosfat i Master Mix-reagenset. Därför innehåller endast amplicon deoxiuridin. Deoxiuridin gör kontaminerande amplicon känsligt för nedbrytning av AmpErase-enzym före amplifiering av target DNA. AmpEraseenzym, som ingår i Master Mix-reagenset, katalyserar klyvning av DNA innehållande deoxiuridin vid deoxiuridinresterna genom att öppna deoxiriboskedjan vid C1-positionen. Vid uppvärmning i det första termocykelsteget vid alkaliskt ph för Master Mix, bryts amplicon-dna-kedjan vid deoxiuridinets position vilket ger icke amplifierbart DNA. AmpErase-enzym är inaktivt vid temperaturer över 55 C, dvs. genom värmecykelstegen, och förstör därför inte target amplicon. Efter amplifiering denatureras eventuellt resterande enzym genom tillsats av denatureringslösning, vilket förhindrar nedbrytning av targetamplicon. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifiering denatureras HPV och ß-globin-amplicon kemiskt, så att enkelsträngat DNA bildas genom tillsats av denatureringslösning. Delar av denaturerat amplicon överförs sedan till motsvarande brunn i den typningsbricka som innehåller hybridiseringsbuffert och en enda LINEAR ARRAY HPVgenotypningsremsa, som är täckt med s.k. probe lines, platser där proben är bunden till filtret med HPV och ß-globin. Biotinmärkt amplicon hybridiserar till oligonukleotidproberna endast om amplicon innehåller matchande sekvens för den komplementära proben. Dessutom är LINEAR ARRAY HPVgenotypningsremsan täckt med en korsreaktiv oligonukleotidprob som hybridiserar med HPV-genotyp 33, 35, 52 och 58. Amplicon som innehåller nästan matchande sekvenser (endast 1 till 3 felmatchningar) som kompletterar proben hybridiserar till aktuell plats där proben är bunden till filtret. * LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test detekterar HPV 66. Riskklassificeringen för HPV 66 är ofullständig. Klassificeringarna i fackgranskade publikationer överensstämmer inte ifråga om den här typen ska identifieras som lågrisk, medelstor risk eller högrisk. Analyser som använder HPV DNA-detektion vid screening för cervixcancer varierar också när det gäller typdetektion, där vissa inkluderar HPV 66 som en högrisktyp och andra exkluderar den SV 2 Doc Rev. 11.0

3 Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen tvättas LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsan noggrant så att obundet material avlägsnas. Streptavidin-HRP tillsätts därefter till remsan. Streptavidin-HRP binder till biotinmärkt amplicon som hybridiserar till oligonukleotidprober på remsan. Remsan tvättas för att ta bort eventuellt obundet streptavidin-hrp, och en substratlösning innehållande väteperoxid och 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) tillsätts för varje remsa. I närvaro av väteperoxid katalyserar partikelbundet streptavidin-hrp oxidation av TMB så att ett blåfärgat komplex bildas som skapar en utfällning vid de probpositioner där hybridisering inträffar. LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsan avläses sedan visuellt genom att mönstret av blå linjer jämförs med referensguiden för LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. REAGENSER AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 test AmpliLute extraktionskit för flytande medier P/N: CAR 1 x 310 µg (Bärar-RNA) Syntetiskt RNA, frystorkat (Tillsätt AVE) PK 1 x 1,25 ml (Proteinas K) Proteinas K, serinproteinas, tritirachium album Xn Proteinas K + Hälsoskadlig R: 36/37/38-42/43 Irriterar ögonen, andningsorganen och huden. Kan ge allergi vid inandning och hudkontakt. S: /37 Undvik inandning av ånga. Undvik kontakt med huden. Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder och skyddshandskar. AVE (Elueringsbuffert) RNase-fritt vatten < 0,09 % natriumazid AW2 (Tvättbuffert 2) Tris-HCl-buffert < 0,09 % natriumazid (Tillsätt absolut etanol) ATL (Vävnadslyseringsbuffert) EDTA 10 % natriumdodecylsulfat AL (Lyseringsbuffert) 50 % guanidin-hcl Xn % guanidin-hcl + 4 x 2 ml 1 x 13 ml 1 x 10 ml 1 x 33 ml Hälsoskadlig R: 22-36/38 Farligt vid förtäring. Irriterar ögonen och huden. S: Förvaras åtskilt från livsmedel och djurfoder. Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder. Vid förtäring, kontakta genast läkare och visa denna förpackning eller etiketten SV 3 Doc Rev. 11.0

4 EXT 50-pack (Kolonnförlängare, 3 ml) VC 50-pack (Vakuumkopplingar) ELT 50-pack (Elueringsrör, 1,5 ml) CLM 50-pack (QIAamp MinElute -kolonner) Kiselmembran LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 test LINEAR ARRAY HPV genotypningstest (P/N: ) HPV MMX 4 x 0,58 ml (LINEAR ARRAY HPV huvudblandning) Trisbuffert Kaliumklorid < 0,02 % AmpliTaq Gold DNA-polymeras (mikrobiellt) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylas) (mikrobiellt) < 0,001 % datp, dctp, dutp, dgtp, dttp < 0,001 % av uppströms- respektive nedströmsprimer (biotinylerade) 0,06 % natriumazid HPV Mg 2+ 4 x 0,125 ml (LINEAR ARRAY HPV magnesiumlösning) < 1 % magnesiumklorid Amarant-färgämne 0,05 % natriumazid HPV (+) C 4 x 0,5 ml (LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll) Tris-HCl-buffert EDTA < 0,002 % poly ra RNA (syntetiskt) < 0,001 % icke smittsamt plasmid-dna (mikrobiellt) innehållande HPV-sekvenser < 0,001 % icke smittsamt plasmid-dna (mikrobiellt) innehållande humana ß-globin-sekvenser 0,05 % natriumazid HPV ( ) C 4 x 0,5 ml (LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll) Tris-HCl-buffert EDTA < 0,002 % poly ra RNA (syntetiskt) 0,05 % natriumazid HPV Strip 4 x 12 test (LINEAR ARRAY HPV genotypningsremsa) Nylonremsa täckt med HPV DNA-prober och 1 human ß-globin-DNA-prob (med höga och låga probkoncentrationer) LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK 96 test LINEAR ARRAY detektionskit (P/N: ) DN 2 x 12 ml (Denatureringslösning) 1,6 % natriumhydroxid EDTA Tymolblått Xi 1,6 % (viktprocent) natriumhydroxid + Irriterande SV 4 Doc Rev. 11.0

5 SDS (SDS-koncentrat) 20 % natriumlaurylsulfat (SDS) 1 % ProClin 150 konserveringsmedel SSPE (SSPE-koncentrat) Natriumfosfatlösning Natriumklorid EDTA 1 % ProClin 150 konserveringsmedel SA-HRP (Streptavidin-HRP) Streptavidin-HRP ACES-buffert Natriumklorid 1 % ProClin 150 konserveringsmedel CIT (Citratkoncentrat) Citratlösning SUB A (Substrat A) Citratlösning 0,01 % väteperoxid 0,1 % ProClin 150 konserveringsmedel SUB B (Substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) T 40 % (viktprocent) dimetylformamid (DMF) 4 x 27 ml 2 x 160 ml 2 x 2 ml 2 x 36 ml 3 x 160 ml 3 x 40 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan ge fosterskador. Farligt vid inandning och hudkontakt. Irriterar ögonen. S: Undvik exponering Begär specialinstruktioner före användning. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Testet är avsett att användas med humana cervixceller som tagits i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning. C. Pipettera inte med munnen. D. Ät, drick eller rök inte i laboratorium. Använd engångshandskar, laboratorierock och ögonskydd när du hanterar prover och kitets reagenser. Tvätta händerna noga efter hantering av prover och testreagenser. E. Undvik mikrobiell smitta och DNA-smitta av reagenserna när portioner tas från reagensflaskor. Användning av sterila engångspipetter och DNA-fria och DNase-fria pipettspetsar rekommenderas. F. Sammanför inte reagenser från olika loter eller från olika flaskor i samma lot. G. Följ de allmänna bestämmelserna för hantering av oanvända reagenser och avfall. H. Använd inte kit efter utgångsdatum SV 5 Doc Rev. 11.0

6 I. Säkerhetsdatablad (SDS) kan erhållas på begäran hos närmaste Roche-kontor. J. Arbetsgången på laboratoriet ska börja i pre-amplifieringsområdet och fortsätta mot postamplifieringsområdet (amplifiering/detektion). Pre-amplifieringsarbetena ska börja med reagensberedning och fortsätta till provextraktion. Förbrukningsmaterial och utrustning ska speciellt tilldelas varje pre-amplifieringsarbete och får inte användas för andra arbeten eller flyttas mellan områden. Handskar ska användas i alla områden. Byt handskar innan ett område lämnas. Utrustning och förbrukningsmaterial som används för reagensberedning får inte användas för provextraktion eller för pipettering eller extraktion av amplifierat DNA eller andra källor för target DNA. Förbrukningsmaterial och utrustning för post-amplifiering ska alltid stanna kvar i postamplifieringsområdet. K. Prover ska behandlas som smittbärande i enlighet med säkra laboratorierutiner som exempelvis de rutiner som beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 och i CLSIdokument M29-A3 17. Rengör och desinficera noga alla arbetsytor med nyberedd lösning bestående av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. OBS! Vanliga hushållsblekmedel innehåller normalt 5,25 % natriumhypoklorit. En utspädning 1:10 med hushållsblekmedel ger en lösning med 0,5 % natriumhypoklorit. L. AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg 2+, HPV ( ) C och HPV (+) C innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- eller kopparrör och bilda mycket explosiva metallazider. Förhindra aziduppbyggnad genom att spola med mycket vatten om lösningar som innehåller natriumazid hälls ut i avloppet. M. Använd ögonskydd, laboratorierock och engångshandskar vid hantering av AL, PK, HPV MMX, HPV Mg 2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B och Working Substrate (blandat SUB A- och SUB B- reagens). Undvik att dessa material kommer i kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Tvätta omedelbart med stora mängder vatten vid eventuell kontakt. Brännskador kan annars uppstå. Vid spill av dessa reagenser ska du späda med vatten innan spillet torkas upp. N. SUB B och Working Substrate innehåller dimetylformamid som har rapporterats vara giftigt i höga orala doser och kan ge fosterskador. Undvik hudkontakt, inandning av rök och förtäring. Vid kontakt med huden, tvätta noga med tvål och vatten och kontakta omedelbart läkare. O. AL innehåller guanidinhydroklorid som kan bilda högreaktiva föreningar när det kombineras med blekmedel. Utspilld vätska, som innehåller den här bufferten, torkas upp med lämplig laboratoriedetergent och vatten. Om den utspillda vätskan innehåller potentiellt smittbärande agenser ska det aktuella området först rengöras med laboratoriedetergent och vatten, och därefter med 0,5 % natriumhypoklorit. Tillsätt inte blekmedel eller sura lösningar direkt i avfall som innehåller AL. P. Glas- eller plastbehållare som står under vakuum (undertryck) kan implodera under användning, vilket kan medföra personskador. Ögonskydd rekommenderas när glas- eller platsbehållare används vid partiellt vakuum (undertryck). Endast behållare som är särskilt anpassade till dessa användningsområden ska användas. Vid vakuumtillförsel får inte sådana behållare användas som inte är anpassade till att tåla vakuum; som uppvisar repor, hack eller sprickor; som är klämda på ett sådant sätt att tryck kan induceras; eller när du håller den i handen. Q. Använd endast LINEAR ARRAY HPV Master Mix tillsammans med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. AMPLICOR HPV Master Mix kan inte användas med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. FÖRVARING OCH HANTERING A. Frys inte reagenser om det inte anges. B. Förvara CLM och PK som ingår i AmpliLute Liquid Media Extraction Kit i 2 8 C. Förvara övriga reagenser som ingår i AmpliLute Liquid Media Extraction Kit i 2 25 C. När förpackningen öppnats kan eventuell oanvänd del av PK förvaras upp till 2 månader i 2-8 C, ATL och AL kan förvaras upp till 2 månader i 2-25 C, dock längst till angivet utgångsdatum. Efter spädning med AVE, kan CAR förvaras upp till 24 timmar i 2-8 C eller delas upp i portioner och förvaras i -20 C i högst 2 månader, dock längst till angivet utgångsdatum. Om absolut etanol tillsätts i AW2 kan oanvända delar av innehållet förvaras upp till 2 månader i 2-25 C, dock längst till angivet utgångsdatum. Efter att rekonstituerat CAR har tillsatts i AL kan Working AL förvaras i 2-8 C i högst 48 timmar. C. Förvara HPV MMX och HPV Mg 2+ i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska eventuella oanvända delar av innehållet kasseras. Working Master Mix (beredd genom tillsats av HPV Mg 2+ i HPV MMX) ska förvaras i 2 8 C och användas inom 6 timmar efter beredning. D. Förvara HPV ( ) C och HPV (+) C i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska eventuella oanvända delar av innehållet kasseras SV 6 Doc Rev. 11.0

7 E. Förvara HPV Strip i 2 8 C. Oöppnat är detta reagens hållbart till angivet utgångsdatum. När förpackningen öppnats ska eventuella oanvända remsor kasseras. F. Förvara DN i 2 25 C. Oöppnat är DN hållbart till angivet utgångsdatum. När förpackningen har öppnats är DN hållbart i 3 månader i 2 25 C (dock längst till angivet utgångsdatum). G. Förvara CIT, SA-HRP, SUB A och SUB B i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen har öppnats är reagenserna hållbara 1 månad i 2 8 C (dock längst till angivet utgångsdatum). H. Förvara SDS och SSPE i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser hållbara till angivet utgångsdatum. När förpackningen har öppnats är reagenserna hållbara 1 månad i 2 8 C (dock längst till angivet utgångsdatum). En fällning bildas i SDS och SSPE vid förvaring i 2 8 C. Värm i 53 C ± 2 C i högst 30 minuter och blanda noga så att det utfällda materialet löses upp innan användning. Working Hybridization Buffer och Wash Buffer, som beretts genom spädning av SDS och SSPE med destillerat eller avjoniserat vatten, ska förvaras i rumstemperatur i en ren, försluten behållare och är hållbart i 30 dagar från beredningsdatum. I. Working Conjugate ska beredas färskt genom blandning av SA-HRP och Working Ambient Wash Buffer. Det är hållbart i 3 timmar i rumstemperatur. J. Working Substrate ska beredas färskt genom blandning av SUB A och SUB B. Det är hållbart i 3 timmar i rumstemperatur i skydd mot ljus. Utsätt inte SUB A, SUB B eller Working Substrate för metaller, oxideringsmedel eller direkt ljus. K. Working Citrate Buffer, som beretts genom spädning av CIT med destillerat eller avjoniserat vatten, ska förvaras i rumstemperatur i en ren, försluten behållare och är hållbart i 30 dagar från beredningsdatum. MATERIAL SOM MEDFÖLJER A. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute extraktionskit för flytande medier (P/N: ) CAR (Bärar-RNA) PK (Proteinas K) AVE (Elueringsbuffert) AW2 (Tvättbuffert 2) ATL (Vävnadslyseringsbuffert) AL (Lyseringsbuffert) EXT (Kolonnförlängare, 3 ml) VC (Vakuumkopplingar) ELT (Elueringsrör, 1,5 ml) CLM (QIAamp MinElute -kolonner) EXTRN B. LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LINEAR ARRAY HPV genotypningstest (P/N: ) HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV huvudblandning) HPV Mg 2+ (LINEAR ARRAY HPV magnesiumlösning) HPV (+) C (LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll) HPV ( ) C (LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll) LA HPV GT SV 7 Doc Rev. 11.0

8 HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV genotypningsremsa) Referensguide (LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referensguide) C. LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY detektionskit LA DK (P/N: ) DN (Denatureringslösning) SDS (SDS-koncentrat) SSPE (SSPE-koncentrat) SA-HRP (Streptavidin-HRP) CIT (Citratkoncentrat) SUB A (Substrat A) SUB B (Substrat B) D. 24-Well Tray with Lid 24-brunnars bricka med lock (P/N: ) MATERIAL SOM BEHÖVS MEN SOM INTE MEDFÖLJER Pre-amplifiering reagensberedningsområde För Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 används MicroAmp -reaktionsrör (AB nr N ), kork (AB nr N eller AB nr N ), bricka/hållare (AB nr ) eller Ready-Pak MicroAmp Assembly (AB nr ) och bas (AB nr N ) Återförslutningsbar plastpåse Eppendorf Multipette -pipett* 1,0 ml eller 1,25 ml Eppendorf Combitip plus (steril, styckförpackad)* Pipetter (kapacitet 50 µl till 125 µl)* med DNA- och DNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning Engångshandskar, puderfria Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområde Eppendorf Multipette-pipett* 1,0 ml och 5,0 ml Eppendorf Combitip plus (steril, styckförpackad)* Pipetter (kapacitet 20 µl, 200 µl och 1000 µl)* med DNA- och DNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning Sterila 2,0 ml-rör med skruvkork (Sarstedt eller motsvarande) Rörrack (Sarstedt eller motsvarande) Absolut etanol uppfyller ACS-kraven Sterila koniska polypropylenrör; 15 ml och 50 ml: (Corning och eller motsvarande) Sterila serologiska engångspipetter (5 ml, 10 ml och 25 ml) Pipet-Aid (Drummond eller motsvarande) Mikrocentrifug (min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller motsvarande Vortexblandare 56 C ± 2 C och 70 C ± 2 C värmeblock Vakuummanifold (t.ex. QIAvac 24, kat.nr 19403; QIAvac 24 Plus, kat.nr med QIAvac Connecting System, kat.nr 19419) SV 8 Doc Rev. 11.0

9 Vakuumkälla [t.ex. en pump med kapaciteten -800 till -900 mbar, KNF Neuberger LABOPORT modellen UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) eller modellen N840.3FT.18 (230 V, 50 Hz), eller QIAGEN Vacuum Pump P/N: (110 V, 60 Hz), (115 V, 60 Hz) eller (230 V, 50 Hz)] med slang till manifolden Vakuumregulator (QIAGEN kat.nr 19530), tillval Provrör (2 ml, QIAGEN kat.nr 19201), tillval Engångshandskar, puderfria Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, P/N: ) Sterila serologiska engångspipetter av polystyren (5 ml, 10 ml och 25 ml) Flerkanalspipett (kapacitet 100 µl)* Pipetter (20 µl, 200 µl och 1000 µl)* med DNA- och DNase-fria spetsar och aerosolbarriär eller positiv förskjutning Vortexblandare Destillerat eller avjoniserat vatten 53 C ± 2 C skakvattenbad med ungefärlig kapacitet 60 RPM (Bellco Hotshaker Plus, P/N: (115 V, 60 Hz) eller P/N: (230 V, 50 Hz) eller motsvarande) 53 C ± 2 C vattenbad Orbital-shaker med ungefärlig kapacitet 60 RPM Tång, rostfritt stål (VWR #: eller motsvarande) Vatten-/kemikalie-/värmeresistent penna (Sharpie Industrial Super Permanent Marker, P/N: eller motsvarande) Apparatur för vakuumaspiration med lämplig vätskeuppsamlingsbehållare (tjockväggat reagensglas av PYREX, Corning P/N: L eller motsvarande) Flödesdelare/aspirator med 12 kanaler (Art Robbins Instruments, P/N: ) Blytyngd (1 pund, VWR #: eller motsvarande) Förvaringsflaskor eller -kolvar, 1 l, 2 l, 3 l Bägare, 100 ml, 250 ml, 500 ml Graderade cylindrar, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 l Eppendorf Multipette-pipett* 50 ml Eppendorf Combitip plus (steril, styckförpackad) Adapter 50 ml, Eppendorf Biopur (P/N: ) RBS35 brickrengöringslösning (VWR #: PI27952 / Pierce #: 27952) Engångshandskar, puderfria * Pipetterna ska ha en noggrannhet inom 3 % av angiven volym. DNA- och DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning ska användas när så anges, för att hindra överföring av smitta mellan prov och amplicon. PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. A. Provtagning Endast cervixcellprover som tagits i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning har validerats för användning med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. Följ tillverkarens instruktioner för cervixcellprovtagning i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning. B. Transport av prover Cervixcellprover som tagits i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning kan transporteras i 2 30 C. Vid transport av cervixcellprover ska gällande bestämmelser för transport av etiologiska agens följas 18. C. Förvaring av prover Cervixcellprover insamlade i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning kan förvaras i 2 30 C i högst 6 månader SV 9 Doc Rev. 11.0

10 BRUKSANVISNING OBS! Låt alla reagenser ekvilibreras till rumstemperatur (15 30 C) innan de används, om inget annat anges. Kontrollera att det finns tillräcklig volym av alla reagenser innan testet påbörjas. OBS! Cervixcellprover måste ha uppnått rumstemperatur (15 30 C) innan de används. OBS! Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att säkerställa selektiv amplifiering. Omgångsstorlek: Varje AmpliLute Liquid Media Extraction Kit innehåller reagenser som räcker till 50 test. Varje LINEAR ARRAY Detection Kit innehåller reagenser som räcker till 96 test. Varje LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test innehåller reagenser för fyra omgångar med 12 tester, vilka kan utföras separat eller samtidigt. Minst ett replikat vardera av LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll och LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll måste ingå i varje testomgång med upp till 22 prover (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifieringsreagenserna är förpackade i engångsflaskor för 12 test. LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll och LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll är förpackade i engångsflaskor. LINEAR ARRAY HPVgenotypningsremsorna är förpackade i engångspåsar för 12 test. Reagenserna utnyttjas bäst om prover och kontroller extraheras i omgångar som är multiplar av 12. Arbetsflöde: LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kan slutföras på en eller två dagar. Följ anvisningarna i del A till och med D i tur och ordning om testet ska slutföras på en arbetsdag. Om testet ska delas upp på två dagar kan förfarandet stoppas efter prov- och kontrollextraktion (del B) eller efter amplifiering (del C). Om prov- och kontrollextraktion ska utföras dag 1 och amplifiering och detektion dag 2, ska steg B.1 till B.29 utföras och de extraherade proverna och kontrollerna förvaras enligt anvisningarna i steg B.29. Börja med del A (reagensberedning) dag 2 och tina sedan de extraherade proverna och kontrollerna i rumstemperatur. Fortsätt med steg B.30. OBS! Extraherade prover och kontroller ska inte tinas mer än en gång. Om prov- och kontrollextraktion och amplifiering ska utföras dag 1 och detektion ska ske dag 2, utförs del A, (reagensberedning), del B (prov- och kontrollextraktion) samt del C (amplifiering) dag 1. Förvara denaturerat amplicon i 2 8 C enligt anvisningarna i steg C.6. Fortsätt med del D (Genotypsdetektion med LINEAR ARRAY HPV-remsan) dag 2. A. Reagensberedning Utförs i: Pre-amplifiering reagensberedningsområde 1. Fastställ det antal reaktionsrör som behövs för testning av prover och kontroller. Placera rören i MicroAmp-brickan och lås fast med hållare. 2. Bered Working Master Mix genom att tillsätta 125 µl HPV Mg 2+ i en flaska HPV MMX. Det är inte nödvändigt att mäta volymen Master Mix. Tillsätt 125 µl HPV Mg 2+ i hela flaskan HPV MMX. Sätt tillbaka korken på röret och blanda väl genom att vända röret gånger. Vortexa inte Working Master Mix. Det rosa färgämnet i HPV Mg 2+ används för visuell bekräftelse på att HPV Mg 2+ har tillsatts i HPV MMX. Kassera återstående HPV Mg Tillsätt 50 µl Working Master Mix i varje reaktionsrör med hjälp av en Multipette-pipett eller en pipett med spets som har aerosolbarriär eller positiv förskjutning. Sätt inte på korken på reaktionsrören ännu. 4. Placera brickan som innehåller Working Master Mix och rätt antal reaktionsrörskorkar i en återförslutningsbar plastpåse och förslut påsen noga. Gå vidare till Pre-amplifiering provoch kontrollextraktionsområdet. Förvara brickan (eller brickorna) med Working Master Mix i 2 8 C i pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområdet tills prov- och kontroll - extraktionen är klar. Working Master Mix är hållbar i 6 timmar i 2 8 C i reaktionsrör inneslutna i plastpåse. B. Prov- och kontrollextraktion Utförs i: Pre-amplifiering prov- och kontrollextraktionsområde 1. Ställ in ett värmeblocks temperatur på 56 C ± 2 C. 2. Ställ in ett annat värmeblocks temperatur på 70 C ± 2 C. 3. Ekvilibrera reagenser, prover och kontroller till rumstemperatur (minst 15 minuter). Om en fällning har bildats i ATL eller AL ska den lösas upp genom uppvärmning till 70 C och varsam omrörning. OBS! Steg B.4 B.6 kan utföras medan proverna/kontrollerna inkuberas med PK och ATL (steg B.10) SV 10 Doc Rev. 11.0

11 4. Lös upp frystorkad CAR genom att tillsätta 310 µl AVE. Vortexa i 10 sekunder. Märk flaskan med initialer och datum. OBS! Upplöst CAR håller i upp till 24 timmar om det förvaras i 2-8 C. Det kan också delas upp i portioner och frysas i -20 C i upp till 2 månader, dock längst till angivet utgångsdatum. Upplöst CAR ska inte tinas mer än 3 gånger 5. Tillsätt 30 ml absolut etanol i AW2. Märk flaskan med initialer och datum. Blanda utspädd AW2 genom att skaka. OBS! Utspädd AW2 kan förvaras i rumstemperatur i upp till 2 månader, dock längst till angivet utgångsdatum. 6. Bered Working AL genom att tillsätta lämplig mängd upplöst CAR i AL enligt tabell 1. Blanda varsamt genom att vända röret 10 gånger. Vortexa inte så undviks skumbildning. Tabell 1 Beredning av Working AL Antal prover/kontroller som ska extraheras Reagenser CAR (ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,20 0,25 AL (ml) 4,0 7,0 10,0 13,0 16,0 20,0 25,0 OBS! Working AL är hållbar i 2 8 C i högst 48 timmar. 7. Märk ett 2 ml-rör med skruvkork för varje prov och kontroll som ska extraheras. OBS! Använd INTE 1,5 ml-rör med skruvkork eller konformade rör eftersom värmeöverföringen vid inkubering då störs, vilket kan leda till ofullständig lysering. 8. Tillsätt 80 µl ATL i varje rör. 9. Vortexa varje prov och kontroll i 10 sekunder. Tillsätt 250 µl av varje prov och kontroll i rören med motsvarande märkning. 10. Tillsätt 20 µl PK i varje rör. Sätt kork på rören och vortexa i 10 sekunder. Inkubera rören i 56 C ± 2 C i 30 minuter i ett värmeblock. 11. Montera vakuummanifolden QIAvac 24 (eller QIAvac 24 Plus) från QIAGEN enligt handboken medan proverna och kontrollerna inkuberas. Ta bort en CLM för varje prov och kontroll från blisterförpackningarna och märk. Kassera inte avfallsprovrören. De ska användas i steg B.23. Öppna CLM och sätt in i VC. Sätt in EXT i CLM. 12. När inkuberingen i 56 C ± 2 C har slutförts, ska 250 µl Working Buffer AL tillsättas i varje rör. Sätt kork på rören och vortexa i 10 sekunder med maximal hastighet. OBS! En vit fällning kan bildas när Working AL tillsätts. Fällningen påverkar inte provoch kontrollextraktionen och löses upp vid efterföljande inkubering. 13. Inkubera rören i 70 C ± 2 C i 15 minuter i ett värmeblock. Vortexa proverna och kontrollerna då och då under hela inkuberingsperioden. 14. När inkuberingen av prover och kontroller i 70 C ± 2 C har slutförts, ska 300 µl absolut etanol tillsättas i varje rör. Sätt kork på rören och vortexa i 15 sekunder med maximal hastighet. 15. Inkubera rören i rumstemperatur i 5 minuter. Pulscentrifugera rören med en bordscentrifug i max. RPM. 16. Överför lysatet från varje rör till motsvarande CLM. Inkubera i minst 1 minut. 17. Slå på vakuumpumpen. Tillför vakuum till manifolden tills allt lysat har avlägsnats. Låt vakuumtillförseln pågå minst ytterligare 1 minut. Avbryt vakuumtillförseln enligt anvisningarna i handboken till QIAGEN-vakuummanifolden. OBS! Om lysatet från ett enskilt prov eller en enskild kontroll inte helt har passerat membranet, ska CLM appliceras i ett rent 2 ml-provrör. Förslut och centrifugera röret i maximal hastighet i 1 minut eller tills lysatet har passerat i sin helhet. Fler 2 ml-provrör kan köpas separat (se MATERIAL SOM BEHÖVS MEN SOM INTE MEDFÖLJER ). 18. Tillsätt 750 µl AW2 i varje CLM. Inkubera i minst 1 minut. 19. Slå på vakuumpumpen. Tillför vakuum till manifolden tills all vätska har avlägsnats. Låt vakuumtillförseln pågå minst ytterligare 1 minut. Avbryt vakuumtillförseln enligt anvisningarna i handboken till QIAGEN-vakuummanifolden SV 11 Doc Rev. 11.0

12 20. Tillsätt 750 µl absolut etanol i varje CLM. Inkubera i minst 1 minut. 21. Slå på vakuumpumpen. Tillför vakuum till manifolden tills all vätska har avlägsnats. Låt vakuumtillförseln pågå minst ytterligare 1 minut. Avbryt vakuumtillförseln enligt anvisningarna i handboken till QIAGEN-vakuummanifolden. 22. Ta försiktigt bort EXT från varje CLM. Kassera EXT. OBS! Se till att inte komma åt den närliggande CLM när EXT tas bort, så undviks kontaminering. 23. Applicera CLM i ett avfallsprovrör (från steg B.11) och förslut det. Centrifugera i max. RPM i 3 minuter. 24. Märk en ELT för varje prov och kontroll. 25. Kassera avfallsprovrören och applicera varje CLM i motsvarande ELT. 26. Ta bort korkarna på varje CLM och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter. 27. Tillsätt 120 µl AVE i varje CLM. Förslut varje rör. OBS! Se till att AVE ekvilibreras till rumstemperatur innan det tillsätts i varje CLM. 28. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter och centrifugera sedan i max. RPM i 1 minut. 29. Ta bort och kassera CLM och förslut rören. Amplifiera de extraherade proverna och kontrollerna omedelbart eller förvara dem i 2 8 C. De kan också frysas i -20 C. Extraherade prover och kontroller kan förvaras i rumstemperatur i högst 6 timmar, i 2 8 C i högst 7 dagar eller i minst -20 C i högst 8 veckor och får bara tinas en gång. Om provet/kontrollen tinas mer än en gång kan signalen gå förlorad. 30. Tillsätt 50 µl av varje prov och kontroll i respektive amplifieringsrör som innehåller Working Master Mix. Använd en ny pipettspets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning för varje prov och kontroll. Förslut amplifieringsrören. OBS! Om extraherade prover och kontroller förvaras frysta ska de tinas i rumstemperatur. När de extraherade proverna och kontrollerna har tinats ska de vortexas kraftigt i 10 sekunder. Om extraherade prover och kontroller förvaras i 2 8 C ska varje prov och kontroll vortexas kraftigt i 10 sekunder innan de tillsätts i Working Master Mix. OBS! Amplifiering i Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 måste påbörjas inom 45 minuter efter att de extraherade proverna och kontrollerna har tillsatts i Working Master Mix. 31. Överför de extraherade proverna och kontrollerna på amplifieringsbrickan till amplifierings-/ detektionsområdet. Återstoden av de extraherade proverna och kontrollerna ska förvaras enligt anvisningarna i steg B.29. C. Amplifiering Utförs i: Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde 1. Placera brick-/hållarenheten i termocykelblocket. 2. Programmera Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 för LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test på följande sätt: HOLD-programmet: 2 min 50 C HOLD-programmet: 9 min 95 C CYCLE-programmet (40 cykler): 30 s 95 C, 1 min 55 C, 1 min 72 C (ramphastighet = 50 %) HOLD-programmet: 5 min 72 C HOLD-programmet: 72 C obestämd tid I CYCLE-programmen ska ramphastigheten ställas in på 50 %. Tilldela önskat metodnamn och användarnamn. Ytterligare information om programmering och drift av termocykeln finns i bruksanvisningen till Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System Starta METHOD-programmet. Välj Max för Ramp Speed och 100 µl för Reaction Volume på skärmen Method Options. Tryck på START igen. Programmet tar omkring 3 timmar och 15 minuter. 4. Ta bort brickan från termocykeln inom 4 timmar sedan det slutliga HOLD-programmet startades, placera den i MicroAmp Base och fortsätt omedelbart med steg 5. Låt inte reaktionsrören stå kvar i termocykeln mer än 4 timmar. AMPLIFIERADE PROVER FÅR INTE FÖRAS IN I PRE- AMPLIFIERINGSOMRÅDET. AMPLIFIERADE KONTROLLER OCH PROVER SKA ANSES SOM EN BETYDANDE POTENTIELL SMITTKÄLLA SV 12 Doc Rev. 11.0

13 5. Ta försiktigt bort korkarna från reaktionsrören så att aerosoler inte skapas av amplifieringsprodukterna. Pipettera omedelbart 100 µl DN till den första kolumnen (eller raden) reaktionsrör med hjälp av en flerkanalspipett med aerosolbarriärspetsar och blanda genom att pipettera upp och ned fem gånger. Upprepa förfarandet för varje kolumn (eller rad) med ett nytt set spetsar. 6. Denaturerat amplicon kan förvaras i rumstemperatur i högst 5 timmar före detektion (del D). Om detektionsreaktionen inte kan utföras inom 5 timmar ska rören förslutas med nya korkar och denaturerat amplicon förvaras i 2 8 C i högst 7 dagar. D. Genotypsdetektion med LINEAR ARRAY HPV-remsan Utförs i: Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde OBS! Se till att prover inte skvätter mellan brunnarna under detektionen. Vatten från badet får inte heller skvätta ned i brunnarna. 24-brunnarsbrickorna får inte staplas. 1. Värm alla detektionsreagenser till rumstemperatur. 2. Förvärm ett vattenbad till 53 C ± 2 C. 3. Förvärm skakvattenbadet till 53 C ± 2 C, skakhastighet ca 60 RPM. Se till att det finns tillräckligt mycket vatten i badet för att värma 24-brunnarsbrickan, men det får inte vara så mycket att det skvätter in i brickan. Vattnet måste vara i kontakt med ungefär 1/4 av det yttre brunnsdjupet eller 0,5 cm av 24-brunnarsbrickan. OBS! Falskt positiva resultat kan uppstå om vattnet i vattenbadet inte har kontakt med 24-brunnarsbrickan på rätt sätt. 4. Bered Working Hybridization Buffer på följande sätt: Undersök SSPE och SDS och värm vid behov i vattenbad (53 C ± 2 C) så att eventuell fällning löses upp. Tillsätt 100 ml SSPE i 388 ml destillerat eller avjoniserat vatten. Blanda väl. Tillsätt 12,5 ml SDS och blanda väl. Working Hybridization Buffer räcker till 100 LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsor. Working Hybridization Buffer ska förvaras i rumstemperatur i en ren behållare och är hållbart i 30 dagar. 5. Bered Working Ambient Wash Buffer på följande sätt: Undersök SSPE och SDS och värm vid behov i vattenbad (53 C ± 2 C) så att eventuell fällning löses upp. Tillsätt 133 ml SSPE i 2520 ml destillerat eller avjoniserat vatten. Blanda väl. Tillsätt 13,3 ml SDS och blanda väl. Working Ambient Wash Buffer räcker till 100 LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsor. Working Ambient Wash Buffer ska förvaras i rumstemperatur i en ren behållare och är hållbart i 30 dagar. 6. Bered Working Stringent Wash Buffer på följande sätt: För varje remsa som ska testas tar du 5 ml Working Ambient Wash Buffer (som beretts i föregående steg) och tillsätter det i en ren flaska av lämplig storlek. (för en omgång med exempelvis 24 remsor ska 120 ml Working Ambient Wash Buffer tillsättas i flaskan.) Working Stringent Wash Buffer ska beredas färskt före varje omgång. 7. Värm Working Hybridization Buffer och Working Stringent Wash Buffer i vattenbad (53 C ± 2 C) i minst 15 minuter. Låt Working Hybridization Buffer och Working Stringent Wash Buffer vara kvar i vattenbadet tills det ska användas. 8. Bered Working Citrate Buffer på följande sätt: Undersök CIT och värm vid behov i vattenbad (53 C ± 2 C) så att eventuell fällning löses upp. Tillsätt 25 ml CIT i 475 ml destillerat eller avjoniserat vatten. Blanda väl. Working Citrate Buffer räcker till 100 LINEAR ARRAY HPVgenotypningsremsor. Working Citrate Buffer ska förvaras i rumstemperatur i en ren behållare och är hållbart i 30 dagar. 9. Ta upp önskat antal LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsor ur påsen HPV Strip med hjälp av en ren tång. 10. Märk varje HPV Strip med aktuellt prov- eller kontroll-id med en vatten-/kemikalie-/ värmeresistent penna. 11. Placera varje remsa, med platserna där proben är bunden till filtret uppåt, i lämplig brunn på 24-brunnarsbrickan. 12. Tillsätt 4 ml förvärmd Working Hybridization Buffer i varje brunn som innehåller en märkt remsa. 13. Använd en pipett med spets som har aerosolbarriär eller positiv förskjutning och tillsätt varsamt 75 µl denaturerat amplicon i aktuell brunn som innehåller en märkt remsa. Skaka brickan varsamt mellan varje tillsats. Använd en ny spets för varje amplicontillsats. 14. Täck över 24-brunnarsbrickan med locket och placera den i skakvattenbad (53 C ± 2 C). Placera en blytyngd (1 pund) på bricklocket så att 24-brunnarsbrickan hålls på plats i skakvattenbadet. Hybridisera i 30 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM SV 13 Doc Rev. 11.0

14 15. Bered Working Conjugate under hybridiseringen (steg 14) på följande sätt: Tillsätt 15 µl SA-HRP i 5 ml Working Ambient Wash Buffer för varje remsa som ska testas. Blanda väl. Working Conjugate ska förvaras i rumstemperatur i en ren behållare och är hållbart i 3 timmar. 16. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur skakvattenbadet och avlägsna Working Hybridization Buffer från brunnarna genom vakuumaspiration. 17. Tillsätt 4 ml Working Ambient Wash Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Skaka 24-brunnarsbrickan varsamt 3 4 gånger så att remsorna sköljs. Vakuumaspirera omedelbart därefter Working Ambient Wash Buffer från brunnarna. 18. Tillsätt 4 ml förvärmd Working Stringent Wash Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Torka av eventuell kondens från bricklocket med en ren pappershandduk, sätt locket på 24-brunnarsbrickan och sätt tillbaka brickan i skakvattenbadet (53 C ± 2 C). Placera en blytyngd (1 pund) på bricklocket så att 24-brunnarsbrickan hålls på plats i skakvattenbadet. Inkubera i 15 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 19. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur skakvattenbadet och avlägsna Working Stringent Wash Buffer från brunnarna genom vakuumaspiration. 20. Tillsätt 4 ml Working Conjugate i varje brunn som innehåller en remsa. Torka av eventuell kondens från bricklocket med en ren pappershandduk, sätt locket på 24-brunnarsbrickan och placera brickan i en rumstempererad orbital-shaker. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur (15 30 C) med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 21. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur orbital-shakern och avlägsna Working Conjugate från brunnarna genom vakuumaspiration. 22. Tillsätt 4 ml Working Ambient Wash Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Skaka 24-brunnarsbrickan varsamt 3 4 gånger så att remsorna sköljs. Vakuumaspirera omedelbart därefter Working Ambient Wash Buffer från brunnarna. 23. Tillsätt 4 ml Working Ambient Wash Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Torka av eventuell kondens från bricklocket med en ren pappershandduk, sätt locket på 24-brunnarsbrickan och placera brickan i en rumstempererad orbital-shaker i 10 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 24. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur orbital-shakern och avlägsna Working Ambient Wash Buffer från brunnarna genom vakuumaspiration. 25. Tillsätt 4 ml Working Ambient Wash Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Placera locket på 24-brunnarsbrickan och placera brickan på en rumstempererad orbital-shaker i 10 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 26. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur orbital-shakern och avlägsna Working Ambient Wash Buffer från brunnarna genom vakuumaspiration. 27. Tillsätt 4 ml Working Citrate Buffer i varje brunn som innehåller en remsa. Placera locket på 24-brunnarsbrickan och placera brickan på en rumstempererad orbital-shaker i 5 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 28. Bered Working Substrate på följande sätt: Tillsätt 4 ml SUB A i 1 ml SUB B för varje remsa som testas. Blanda väl. Working Substrate ska förvaras skyddat mot direkt ljus i rumstemperatur i en ren behållare och är hållbart i 3 timmar. 29. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur orbital-shakern och avlägsna Working Citrate Buffer från brunnarna genom vakuumaspiration. 30. Tillsätt 4 ml Working Substrate i varje brunn som innehåller en remsa. Placera locket på 24-brunnarsbrickan och placera brickan på en rumstempererad orbital-shaker i 5 minuter med den ungefärliga skakhastigheten 60 RPM. 31. Ta ut 24-brunnarsbrickan ur orbital-shakern och avlägsna Working Substrate från brunnarna genom vakuumaspiration. 32. Tillsätt 4 ml destillerat eller avjoniserat vatten i varje brunn som innehåller en remsa. 33. Ta bort remsorna från 24-brunnarsbrickan med hjälp av en ren tång, placera remsorna på en ren och torr yta och låt dem lufttorka i mellan 1 och 72 timmar i rumstemperatur innan resultatet tolkas SV 14 Doc Rev. 11.0

15 Rengöring av 24-brunnarsbrickor Utförs i: Post-amplifiering amplifierings-/detektionsområde OBS! 24-brunnarsbrickorna är engångsartiklar eller kan återanvändas. Om brickorna ska återanvändas måste de rengöras efter varje användning på följande sätt. 1. Bered en 10-procentig RBS35-lösning genom att blanda 1 del RBS35 med 9 delar destillerat eller avjoniserat vatten. 2. Fyll varje brunn med den 10-procentiga lösningen och låt stå över natten i rumstemperatur. 3. Skölj brickan noggrant med destillerat eller avjoniserat vatten. 4. Låt brickan torka helt innan den används. RESULTAT Försäkra dig om att den aktuella körningens kontrollresultat är giltiga (se avsnittet Kvalitetskontroll). Om körningen är ogiltig måste du upprepa hela körningen (extraktion, amplifiering och genotypsdetektion med LINEAR ARRAY HPV-remsan). Om körningen är giltig, tolka the LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsan genom att placera LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test-referensguiden över remsan i det utskurna området så att HPVgenotypningsreferenslinjerna syns på båda sidor av remsan. Se till att den svarta bläckreferenslinjen (REF) på guiden är i linje med den solida svarta linjen på HPV-remsan. Notera de positiva synliga banden och tolka HPV- och ß-globin (BG)-resultaten för varje remsa på följande sätt: HPVresultat Lågt BGresultat Högt BGresultat Tolkning Ogiltigt resultat. HPV DNA, om förekommande, kunde inte detekteras. Avsaknad av hög BG och låg BG tyder på olämplig provtagning, extraktion eller förekomst av hämmare. Extrahera en ny portion av det ursprungliga provet och upprepa testet. Om det ursprungliga provet inte finns tillgängligt måste ett nytt prov tas. Ogiltigt resultat. HPV DNA, om förekommande, kanske inte har detekterats. Avsaknad av låg BG tyder på olämplig provtagning, extraktion eller förekomst av hämmare. Extrahera en ny portion av det ursprungliga provet och upprepa testet. Om det ursprungliga provet inte finns tillgängligt måste ett nytt prov tas. HPV DNA ej detekterat. Ett negativt resultat utesluter inte förekomst av HPV-infektion eftersom resultaten är beroende av rätt provtagning, extraktion, avsaknad av hämmare och tillräckligt med HPV DNA. HPV DNA detekterat (rapportera genotyper). Provet är positivt för förekomst av HPV. Frånvaro av låg BG och hög BG tyder på olämplig provtagning, extraktion, förekomst av hämmare eller konkurrens med en HPV-target med hög titer. Ytterligare HPVgenotyper som inte detekterades kan förekomma. HPV DNA detekterat (rapportera genotyper). Provet är positivt för förekomst av HPV. Frånvaro av låg BG tyder på olämplig provtagning, extraktion, förekomst av hämmare eller konkurrens med en HPV-target med hög titer. Ytterligare HPV-genotyper som inte detekterades kan förekomma. HPV DNA detekterat (rapportera genotyper). Provet är positivt för förekomst av HPV. Förekomst av ytterligare HPV-genotyper i provet kan inte uteslutas SV 15 Doc Rev. 11.0

16 Tolkning av korsreaktiva prober LINEAR ARRAY HPV-genotypningsremsan innehåller en korsreaktiv prob som hybridiserar med HPVgenotyp 33, 35, 52 och 58. Positiva bandresultat för proben ska tolkas på följande sätt: Bandresultat Tolkning 33, 52/33/35/58 HPV 33* 35, 52/33/35/58 HPV 35* 58, 52/33/35/58 HPV 58* 52/33/35/58 HPV 52 * co-infektion med HPV-genotyp 52 kan inte uteslutas med dessa testresultat. KVALITETSKONTROLL Minst ett replikat av LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll och ett replikat av LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll måste extraheras vid varje körning med högst 22 prover. Liksom för alla nya laboratorieförfaranden bör nya användare överväga att använda ytterligare positiva och negativa kontroller varje gång testet utförs tills man har fått tillräcklig erfarenhet av testet. Det finns inga krav avseende kontrollernas position i MicroAmp-brickan. Prover och kontroller från olika extraktionsomgångar kan amplifieras och detekteras samtidigt. Varje separat provomgång valideras dock individuellt med hjälp av de kontroller som ingår i omgången. Därför kan en provomgång ogillas i en vanlig amplifierings- och/eller detektionskörning medan en annan omgång godkänns beroende på vilka egenskaper de kontroller har som extraheras med dessa prover. Alla testprover och kontroller som extraheras i samma omgång ska amplifieras och detekteras i angränsande positioner i termocykeln och på detektionsbrickan. Exakt hur proverna och kontrollerna placeras i termocykeln eller på detektionsbrickan är ej av avgörande betydelse. Negativ kontroll Analysresultatet för LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll får inte innehålla positiva band. Om positiva band är synliga är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och genotypsdetektion med LINEAR ARRAY HPV-remsan). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om LINEAR ARRAY HPV negativ kontroll genomgående ger resultat med positiva band. Positiv kontroll Analysresultatet för LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll måste ge ett positivt resultat, tolkat som HPV 16, ß-Globin high och ß-Globin low. Bandet ß-Globin low är svagt jämfört med bandet ß-Globin high men måste vara synligt för ögat. Om LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll inte ger exakt detta resultat är hela körningen ogiltig. Upprepa hela förfarandet (prov- och kontrollextraktion, amplifiering och genotyps - detektion med LINEAR ARRAY HPV-remsan). Kontakta din Roche-representant och begär teknisk hjälp om LINEAR ARRAY HPV positiv kontroll genomgående ger resultat som har ett annat mönster av positiva band. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER Liksom för alla testmetoder är det mycket viktigt att använda god laboratorieteknik för att denna analys ska fungera korrekt. Med hänsyn till testets höga analytiska sensitivitet är stor noggrannhet nödvändig så att kitets reagens- eller amplifieringsblandningar hålls rena. Renheten ska övervakas noga för alla reagenser. Kassera reagenset i tveksamma fall. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Testet har validerats för användning med humana cervixceller som tagits i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-lösning. Testning av andra provtyper kan ge falskt negativa eller falskt positiva resultat. 2. Testet har endast validerats för användning med AmpliLute Liquid Media Extraction Kit. Testning med andra extraktionsmetoder kan leda till felaktiga resultat. 3. Resultatens tillförlitlighet förutsätter rätt provtagning, transport, förvaring och behandling av prover. 4. Detektion av HPV är beroende av antalet virusgenom i provet och kan påverkas av provtagningsmetoder, patientfaktorer (t.ex. ålder, förekomst av symptom) och/eller infektionsstadium SV 16 Doc Rev. 11.0

17 5. Falskt negativa resultat kan uppstå på grund av polymerashämmare eller olämpliga celler. ß-globin-amplifiering har lagts till i LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test så att extraherade prover som innehåller ämnen som kan påverka PCR-amplifieringen och/eller olämpliga celler kan identifieras. 6. Förekomsten av AmpErase-enzym i LINEAR ARRAY HPV Master Mix minskar risken för ampliconkontaminering. Smitta från HPV-positiva kontroller och prover kan dock endast undvikas om god laboratoriesed tillämpas och de anvisningar som beskrivs i denna bipacksedel noga följs. 7. Endast personal med erfarenhet av PCR-teknik bör använda produkten. 8. Endast Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 har validerats för användning med denna produkt. Ingen annan termocykel, vare sig GeneAmp PCR System 2400, GeneAmp PCR System 9600 eller GeneAmp PCR System 9700 med aluminiumblock, kan användas tillsammans med denna produkt. 9. Prover som innehåller Advantage-S Bioadhesive Contraceptive Gel kan påverka prestandan hos LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test och ge falskt negativa eller ogiltiga resultat. 10. Prover som innehåller mer än 3,5 % (viktprocent) blod har visat sig hämma PCR-amplifiering och kan ge falskt negativa resultat. 11. Identifiering av HPV-genotyp 64 och 69 baseras på LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test-resultat för plasmid-dna, HPV-genotyp 64 och 69. HPV-genotyp 64 och 69 detekterades inte i ett kliniskt prov under egenskapsutvärderingarna. 12. Mutationer inom de maximalt konserverade regionerna på det virusgenom som täcks av primers och/eller prober för LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test är visserligen sällsynta, men kan göra att en viss genotyp inte kan detekteras. 13. På grund av inneboende skillnader mellan metoder rekommenderas användaren, innan en metod byts ut mot en annan, att genomföra metodkorrelationsanalyser i laboratoriet för att bestämma skillnaderna mellan metoderna. INTERFERERANDE ÄMNEN Följande vanliga intimprodukter för kvinnor, glidmedel, anti-fungal krämer och p-skum har visat sig inte påverka prestandan hos LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. Tabell 2 Produktnamn Ortho Options Delfen vaginalt spermiedödande skum Mycelex 3 svampdödande kräm Clotrimazole 3 vaginal kräm Vagi-Gard medicinsk kräm Gyne-Lotrimin 3 vaginal kräm Vagisil kräm mot klåda Gynecort kräm mot klåda med 1 % hydrokortison Yeast Gard homeopatiska vaginala suppositorier Vaginex hydrokortisonkräm Betadine medicinskt sköljkoncentrat Miconazole extern blygdkräm Monistat 3 kombinationspaket vaginal svampdödande kräm Norforms deodorant-suppositorier K-Y Brand glidmedel Vagisil glidmedel Falskt negativa och/eller ogiltiga resultat observerades för HPV-positiva prover som innehöll Advantage-S Bioadhesive Contraceptive Gel i koncentrationen 0,11 g/20 ml och mer. Falskt negativa resultat observerades för HPV-positiva prover som innehöll mer än 3,5 % (viktprocent) blod. Inga falskt negativa eller ogiltiga resultat observerades för HPV-positiva prover som innehöll slem från endocervix eller exocervix SV 17 Doc Rev. 11.0

18 FÖREKOMST AV HPV-GENOTYPER Förekomsten och fördelningen av HPV-genotyper har visat sig variera beroende på geografiskt område i världen Dessutom verkar flera genotyper, t.ex. 55, 64 och 69, vara nya genotyper med låg förekomst som inte associeras med cervixcancer 20,22. De vanligaste HPV-genotyperna som associeras med cervixcancer med minskad förekomst eller frekvens är typerna 16, 18, 45, 31; geografisk variation avseende frekvens gäller de flesta genotyper, bland annat 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59 och 68. Tabell 3 Rapporterad förekomst av HPV-genotyper i kontrollgrupps- och cervixcancerfall HPV-genotyp Prevalens (%) 16 7,5 56,0 18 2,3 22,1 45 2,4 7,9 58 0,2 5,4 53 0,0 5,2 33 1,0 4,4 31 2,0 4,2 52 0,5 4, ,0 3,6 39 0,0 3,3 61 0,0 3,2 35 0,4 2,7 56 0,2 2,5 66 0,0 2,4 84 2,3 6 0,3 2,3 81 0,1 2,3 70 0,0 2,3 59 0,0 2,1 CP6108 0,0 1,8 83 1,6 72 0,0 1,5 68 0,1 1,2 42 0,0 1,2 43 0,0 1,2 55 1,1 73 0,1 1,0 11 0,1 0,8 40 0,0 0,8 82 0,0 0,6 67 0,5 44 0,0 0,4 69 0,2 71 0,2 IS39 0,2 26 0,0 0,2 64 0, SV 18 Doc Rev. 11.0

19 ICKE-KLINISK EGENSKAPSUTVÄRDERING A. Detektionsgräns Detektionsgränsen bestämdes för 18 HPV-genotyper (6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 och 82). Plasmid-DNA [kvantifierat genom spektrofotometri (260 nm absorption)] för varje genotyp späddes till minst 5 koncentrationsnivåer med hjälp av PreservCyt-lösning med 250 ng/ml humant genomiskt DNA som spädningsmedel. Två användare utförde minst 4 körningar, där varje körning bestod av minst 3 replikat per koncentrationsnivå, vilket gav totalt minst 24 replikat per nivå. För var och en av de här 18 HPV-genotyperna genomfördes en probitanalys, och den förväntade 95-procentiga positiva träffsannolikheten för varje genotyp visas i tabell 4. Dessutom visas i tabellen den lägsta koncentrationsnivån med en iakttagen 95-procentig positiv träffsannolikhet där alla högre koncentrationsnivåer hade en iakttagen 95-procentig positiv träffsannolikhet. Tabell 4 Detektionsgränsresultat för LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test HPV-genotyp Förväntad 95-procentig träffsannolikhet (k/ml) enligt Probit Iakttagen koncentration för detektionsgräns 95 % positiv träffsannolikhet (k/ml) # # # * 33 # ** 35 # # # # # # # # # Identifierade som högrisk-genotyper som är associerade med höggradig cervixdysplasi och cervixcancer 3-5. * För genotyp 31 iakttogs > 95-procentig träffsannolikhet vid 2000; 1300; 900 och 660 k/ml och 92-procentig träffsannolikhet vid 3300 och 3000 k/ml. ** För genotyp 33 iakttogs > 95-procentig träffsannolikhet vid 4000 och 2700 k/ml och 92-procentig träffsannolikhet vid 6700 k/ml samt 94-procentig träffsannolikhet vid k/ml. B. Genotypsinklusivitet: Plasmid-DNA Genotypsinklusiviteten fastställdes genom analys av 36 HPV-genotypsplasmider (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 och CP6108). Plasmid-DNA för HPV-genotyp 52 fanns inte tillgängligt för testning. Inklusiviteten för HPVtyp 52 påvisades i studier med ett kliniskt prov (avsnitt C). För HPV-genotyp 6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 och 82 påvisades inklusivitet i studien av detektionsgräns. De återstående 18 tillgängliga HPV-genotypsplasmid-DNA-stammarna kvantifierades genom spektrofotometri (260 nm absorption), späddes till 900 kopior/ml i PreservCyt-lösning och testades därefter i replikat om sex med hjälp av två reagensloter. För HPV-genotyper som eventuellt inte detekterades vid ett 100-procentigt positivitetsvärde vid 900 kopior/ml, genomfördes ytterligare testning med ökande plasmid-dnakoncentrationer tills en 100-procentig inklusivitetsnivå (n=6) för den aktuella genotypen fastställdes. Resultaten visar att 36 HPV-genotyper från HPV-plasmid-DNA kan detekteras med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test vid olika koncentrationsnivåer beroende på HPV-genotyp (tabell 5) SV 19 Doc Rev. 11.0

20 6 Tabell 5 Genotypsinklusivitet för LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test * Inklusivitetsnivån motsvarar en 100-procentig positiv träffsannolikhet (n=6) vid de koncentrationer som anges i tabellen förutom för HPV-genotyperna 6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 och 82, där den förväntade koncentrationen är en 95-procentig positiv träffsannolikhet enligt probitanalysen. # Identifierade som högrisk-genotyper som är associerade med höggradig cervixdysplasi och cervixcancer 3-5. C. Genotypsinklusivitet: Kliniska prover Vid egenskapsutvärderingarna testades totalt 451 kliniska prover HPV-positiva med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test. 35 av de 37 HPV-genotyperna (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 och CP6108) detekterades i kliniska prover med LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test och påvisade därvid inklusivitet. Fördelningen av dessa HPV-genotyper visas i figur 1. Vid egenskapsutvärderingarna detekterades inte HPV-genotyp 64 och 69 i ett kliniskt prov. Figur 1 Fördelning av HPV-genotyper i LINEAR ARRAY HPV-positiva kliniska prover (n=451) vid egenskapsutvärderingarna Inklusivitetsnivå* HPVgenotyp (kopior/ml) # # # # # # # # # # 185 Inklusivitetsnivå* HPVgenotyp (kopior/ml) 59 # # CP IS Antal positiva Lågrisk- och högrisk-hpv-genotyper * För 58 kliniska prover som testades positivt för HPV 33, HPV 35 och/eller HPV 58 DNA, kunde coinfektion med HPV-genotyp 52 inte uteslutas SV 20 Doc Rev * 35* * IS39 CP