Oktober 2016 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 24 (katalognr. 4559263) Version 1 96 (katalognr. 4559265) Kvalitativ in vitro-diagnostik För användning med Rotor-Gene Q Instruments 4559263, 4559265 R7 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND 1046969SV Sample & Assay Technologies
QIAGEN Provtagnings- och analystekniker QIAGEN är den ledande tillverkaren av innovativa provtagnings- och analystekniker som möjliggör isolering och detektion av innehållet i alla typer av biologiska prover. Våra avancerade produkter och tjänster av hög kvalitet säkerställer framgång från prov till resultat. QIAGEN sätter standarden för: rening av DNA, RNA och proteiner nukleinsyra- och proteinanalyser mikrorna-forskning och RNAi automatisering av provtagnings- och analysmetoder Vårt uppdrag är att göra det möjligt för dig att uppnå utomordentliga framgångar och genombrott. Det finns mer information på www.qiagen.com.
Innehåll Kitinnehåll 4 Symboler 4 Förvaring 5 Avsedd användning 5 Begränsningar för produktanvändning 5 Varningar och försiktighet 7 Kvalitetskontroll 7 Inledning 8 Princip 8 Information om patogenen 8 Prestandaegenskaper 9 Utrustning och reagens som ska tillhandahållas av användaren 20 Viktiga anmärkningar 21 Allmänna försiktighetsåtgärder 21 Insamling, förvaring och transport av prov 21 DNA-isolering 24 Intern kontroll 30 Protokoll: PCR- och dataanalys 32 Felsökningsguide 42 Beställningsinformation 45 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 3
Kitinnehåll artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24) (96) Katalognr 4559263 4559265 Antal reaktioner 24 96 Blå C. trachomatis Plus RG Master 2 x 12 reaktioner 8 x 12 reaktioner Gul Röd C. trachomatis Plus LC/RG Mg- Sol* C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control 400 µl 400 µl 200 µl 200 µl Grön C. trachomatis Plus RG IC 1 000 µl 2 x 1 000 µl Vit Water (Vatten) (PCR-kvalitet) 1 000 µl 1 000 µl artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Handbook (Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit) (engelsk) 1 1 * Magnesiumlösning. Intern kontroll. Symboler <N> Innehåller reagens som räcker för <N> tester Använd före Medicinsk utrustning för in vitro-diagnostik Katalognummer Lotnummer Materialnummer 4 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Komponenter Innehåller Antal GS1-artikelnummer (Global Trade Item Number) Temperaturbegränsningar Tillverkare Konsultera bruksanvisningen Varning Förvaring Komponenterna i artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit måste förvaras vid 15 till 30 C och är stabila fram till det utgångsdatum som anges på etiketten. Upprepad tining och frysning (mer än två gånger) ska undvikas, eftersom detta kan minska analyssensitiviteten. Om reagensen endast ska användas periodvis ska de frysas ned i alikvoter. Förvaring vid 2 8 C ska inte överskrida 5 timmar. Avsedd användning artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit är ett in vitro-nukleinsyraamplifieringstest för detektion av Chlamydia trachomatis-dna i human urin, svabb- (ögon, endocervikalt eller uretralt) eller spermaprover. För detta diagnostiska testkit används polymeraskedjereaktion (PCR) och kitet är konfigurerat för användning med Rotor-Gene Q-instrument. Begränsningar för produktanvändning Samtliga reagens är uteslutande avsedda för användning i in vitro-diagnostik. Produkten ska endast användas av personal som har fått specialinstruktioner och som har utbildats i in vitro-diagnostiska förfaranden. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 5
Användarhandboken måste följas strikt för att uppnå optimala PCR-resultat. Var noga med att uppmärksamma de utgångsdatum som är angivna på asken och på etiketterna för alla komponenter. Använd inte utgångna komponenter. Även om det sker i sällsynta fall kan det uppkomma mutationer inom bakteriegenomets i hög grad bevarade områden, vilka täcks av kitets primrar och/eller sökfragment, och det kan resultera i att dessa kvantifieras i underkant eller så kan man missa att detektera förekomsten av bakterier i dessa fall. Därför granskas analysens giltighet och prestanda med jämna mellanrum. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan detektera stammar som bär på den kryptiska plasmiden och även nya svenska varianter av stammar som har en deletion i den kryptiska plasmiden. Kitet detekterar inte varianter av C. trachomatis som saknar kryptisk plasmid. 6 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Varningar och försiktighet Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Se lämpligt säkerhetsdatablad (SDS) för mer information. Dessa är tillgängliga online i praktiskt och kompakt PDF-format på www.qiagen.com/safety där du kan hitta, granska och skriva ut datablad för alla kit och kitkomponenter från QIAGEN. Säkerhetsinformation om reningskitet finns i relevant kithandbok. Säkerhetsinformation om instrument finns i användarhandboken för respektive instrument. Kassera prov- och analysavfall enligt lokala säkerhetsregler. Kvalitetskontroll I enlighet med QIAGEN:s ISO-certifierade kvalitetshanteringssystem testas varje lotnummer av artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit mot förutbestämda specifikationer för att garantera en konsekvent produktkvalitet. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 7
Inledning artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit utgör ett system som är klart att användas för detektion av DNA från C. trachomatis med användning av polymeraskedjereaktion (PCR) i Rotor-Gene Q-instrument. C. trachomatis Plus RG Master innehåller reagenser och enzymer för den specifika amplifieringen av en 111 bp-region av den kryptiska plasmiden för C. trachomatis. Reagenserna möjliggör även specifik detektion av amplikonet i fluorescenskanal Cycling Green för Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q och Rotor-Gene 6000, eller Cycling A.FAM för Rotor-Gene 3000. Dessutom innehåller artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ett andra heterologt amplifieringssystem för att identifiera eventuell PCR-inhibering. Detta detekteras som en intern kontroll (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow för Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q och Rotor-Gene 6000, eller i Cycling A.JOE för Rotor- Gene 3000. Detektionsgränsen för analytisk PCR av C. trachomatis (se Analytisk sensitivitet på sidan 9) reduceras inte. Extern positiv kontroll medföljer (C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control). Princip Patogendetektion med PCR baseras på amplifieringen av specifika regioner i den patogena organismens genom. I realtids-pcr detekteras den amplifierade produkten via fluorescerande färgämnen. Dessa är vanligtvis kopplade till prober av oligonukleotider, vilka binder specifikt till den amplifierade produkten. Övervakning av fluorescensintensiteterna under pågående PCRkörning (det vill säga i realtid) möjliggör detektion och kvantifiering av den ackumulerande produkten utan att man behöver öppna reaktionsrören på nytt efter PCR-körningen.* Information om patogenen Bakterier av arten Chlamydia (C.) är av stor epidemiologisk vikt. C. trachomatis (serovar D L) är en av de mest frekventa orsakerna till sexuellt överförda infektioner (STI) i hela världen. Det finns 16 serotyper av C. trachomatis och de orsakar olika sjukdomar. Serotyp A C orsakar trakom som är en kronisk, recidiverande sjukdom i ögats bindehinna och hornhinna som förekommer i tropiska områden. Serotyp D K orsakar såväl sexuellt överförbara urogenitala infektioner och ögoninfektioner som infektioner hos nyfödda genom perinatal överföring. Serotyp LGV I III orsakar lymfogranuloma venereum som är en sexuellt överförbar sjukdom som främst finns i tropikerna. *Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. 8 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Trakom ses nästan enbart i tropiska länder med bristande hygienstandard. Globalt är det den vanligaste ögonsjukdomen och efter katarakt den vanligaste orsaken till blindhet. Uppskattningsvis har 150 miljoner människor drabbats av infektionen och av dessa har ungefär 6 miljoner blivit blinda. I industrialiserade länder är klamydia den vanligaste bakterien som orsakar urogenital infektion. I Tyskland sker uppskattningsvis 300 000 nya genitala infektioner varje år. Incidensen av lymfogranuloma venereum (lymfogranuloma inguinale, Durand- Nicolas-Favres sjukdom) minskar globalt. Trots detta är denna sexuellt överförbara sjukdom fortfarande endemisk i Asien, Afrika, Sydamerika och delar av Karibien. Prestandaegenskaper Analytisk sensitivitet Den analytiska detektionsgränsen liksom den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen (sensitivitetsgränser) har utvärderats för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen fastställdes med hjälp av kliniska prover positiva för C. trachomatis i kombination med specifika extraktionsmetoder. Den analytiska detektionsgränsen bestämdes däremot oberoende av den valda extraktionsmetoden. Istället användes serotyper med känd koncentration. För att bestämma den analytiska sensitiviteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit gjordes spädningsserier av C. trachomatis serotyp E från 10 till 0,003 och från 6,6 till nominellt 0,0006 C. trachomatis-bakteriegenomekvivalenter/µl (be/µl) och analyserades på Rotor-Gene 6000 respektive Rotor-Gene 3000 i kombination med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Testningen utfördes under tre olika dagar med åtta replikat. Resultaten fastställdes genom en probitanalys. En grafisk illustration av probitanalysen på Rotor-Gene 6000 visas i figur 1. Den analytiska detektionsgränsen för artus C. trachomatis RG PCR Kit på Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 och på Rotor-Gene 3000 är 0,04 be/µl (p = 0,05) respektive 0,2 be/µl (p = 0,05). Detta innebär en 95-procentig sannolikhet att detektera 0,04 be/µl respektive 0,2 be/µl. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 9
95% 1.0 0.8 1.394 ~ 0.04 be/µl (95%) (0.025 0.171 be/µl) Proportions 0.6 0.4 0.2 0.0-4 -3-2 -1 0 1 log (dose) Figur 1. Probitanalys C. trachomatis (Rotor-Gene 6000). Analytisk sensitivitet för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene 6000. Den analytiska sensitiviteten med hänsyn till reningen (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene Instruments fastställdes med hjälp av spädningsserier av C. trachomatis serotyp E från 6,6 till nominellt 0,0006 C. trachomatis be/µl tillsatta till kliniska svabbprover. Dessa användes för att extrahera DNA med användning av QIAamp DNA Mini Kit (extraheringsvolym: 200 µl, elueringsvolym 100 µl). Var och en av de åtta spädningarna analyserades med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit under tre olika dagar med åtta replikat. Resultaten fastställdes genom en probitanalys. En grafisk illustration av probitanalysen visas i figur 2. Den analytiska detektionsgränsen med hänsyn till reningen av artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit i kombination med Rotor-Gene 3000 är 300 be/ml (p = 0,05). Detta innebär en 95-procentig sannolikhet att 300 be/ml kommer att upptäckas. 10 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
1 95% 0.18834 ~ 300 be/ml (95%) QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 0.8 Proportions 0.6 0.4 0.2-5 -4-3 -2-1 0 1 2 3 log (dose) 0 Figur 2. Probitanalys C. trachomatis (Rotor-Gene 3000). Analytisk sensitivitet med hänsyn till reningen (QIAamp DNA Mini Kit, QIAGEN) för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor- Gene 3000. För den analytiska sensitiviteten med hänsyn till reningen med QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit på Rotor-Gene Instruments antas en sensitivitet jämförbar med QIAamp DNA Mini Kit, eftersom förlusten efter rening med båda extraktionsmetoderna befinner sig i intervallet 0,3 till 1,8 %. Specificitet Specificiteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit säkerställs genom valet av primrar och prober, men även genom valet av stringenta reaktionsvillkor. Primrarna och proberna har kontrollerats beträffande eventuella homologier relativt alla sekvenser som publicerats i genbanker genom sekvensjämförande analys. Möjligheten att detektera alla relevanta serotyper har på det viset säkerställts genom parallellställning mot databassekvenser och genom en PCRkörning på Rotor-Gene Instruments med följande serotyper (se tabell 1) Dessutom utvärderades specificiteten hos prov som var negativa för C. trachomatis, 30 stycken från urin, 100 från svabbar och 30 från sädesvätska. Dessa gav inga signaler med de C. trachomatis-specifika primrar och prober som ingår i C. trachomatis Plus RG Master. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 11
Tabell 1. Testning av specificitet för relevanta serotyper Chlamydia Serotyp Källa C. trachomatis A ATCC* (VR-571B) C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontroll (Cycling Yellow eller A.JOE)) + + C. trachomatis B C. trachomatis Ba C. trachomatis C C. trachomatis D C. trachomatis E C. trachomatis F C. trachomatis G C. trachomatis H C. trachomatis I C. trachomatis J C. trachomatis K ATCC (VR-573) ATCC (VR-347, prov 1) ATCC (VR-572) ATCC (VR-885) ATCC (VR-348B) ATCC (VR-346) ATCC (VR-878) ATCC (VR-879) ATCC (VR-880) ATCC (VR-886) ATCC (VR-887) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + * American Type Culture Collection (den amerikanska typkultursamlingen). Tabellen fortsätter på nästa sida 12 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Tabell 1. Fortsättning Chlamydia Serotyp Källa C. trachomatis LGV I ATCC (VR-901B) C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontroll (Cycling Yellow eller A.JOE)) + + C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV III ATCC (VR-902B) ATCC (VR-577) ATCC (VR-903) + + + + + + Potentiell korsreaktivitet för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit testades med hjälp av den kontrollgrupp som räknas upp i tabell 2. Ingen av de testade patogenerna har visat reaktivitet. Tabell 2. Testning av kitets specificitet med potentiellt korsreaktiva patogener Kontrollgrupp C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontroll (Cycling Yellow eller Cycling A.JOE) Acinetobacter spp. + Bordetella pertussis + Candida albicans + Candida glabrata + Chlamydia pneumoniae + Chlamydia psittaci + Enterobacter cloacae + Enterococcus faecalis + Tabellen fortsätter på nästa sida Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 13
Tabell 2. Fortsättning Kontrollgrupp C. trachomatis (Cycling Green eller A.FAM) Intern kontroll (Cycling Yellow eller Cycling A.JOE) Escherichia coli + Gardnerella vaginalis + Haemophilus parainfluenzae + Klebsiella pneumoniae + Neisseria gonorrhoeae + Proteus mirabilis + Proteus vulgaris + Salmonella enteritidis + Salmonella typhimurium + Staphylococcus aureus + Streptococcus pneumoniae + Streptococcus pyogenes + Herpes simplex virus 1 och 2 + Precision Precisionsuppgifter för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit har samlats in med användning av Rotor-Gene Instruments och möjliggör bestämning av analysens totala varians. Den totala variansen består av intra-analysvariabilitet (variabilitet för flera provresultat med samma koncentration inom ett experiment), inter-analysvariabilitet (variabilitet för flera analysresultat som genererats på olika instrument av samma typ av olika operatörer inom ett laboratorium) och inter-batchvariabilitet (variabilitet för flera analysresultat med användning av olika batcher). De uppgifter som erhölls användes för att fastställa standardavvikelsen, variansen och variationskoefficienten för PCR-reaktionen avseende den specifika patogenen och den interna kontrollen. Precisionsdata för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit bestämdes med användning av C. trachomatis serotyp E i den koncentration som låg nämast det 14 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
trefaldiga gränsvärdet (2,1 be/µl med hänsyn till reningen, 0,66 be/µl utan hänsyn till reningen). Testningen utfördes med 8 replikat. Precisionsdata beräknades med utgångspunkt från CT -värdena i amplifieringskurvorna (CT: tröskelcykel, se tabell 3). Baserat på dessa resultat var den totala statistiska spridningen av godtyckligt givet prov med ovannämnd koncentration 2,45 % (CT) och 1,87 % (CT) med hänsyn till rening (QIAamp DNA Mini Kit, tabell 4) samt 3,34 % (CT) och 2,13 % (CT) med hänsyn till reningen (QIAamp DNA Mini Kit) för detektion av den interna kontrollen. Dessa värden baseras på slutsumman för alla enskilda värden för de fastställda variabiliteterna. Tabell 3. Precisionsuppgifter baserade på CT-värden Intraanalysvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (0,66 be/µl) Intraanalysvariabilitet: Intern kontroll Interanalysvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (0,66 be/µl) Interanalysvariabilitet: Intern kontroll Interbatchvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (0,66 be/µl) Interbatchvariabilitet: Intern kontroll Total varians: C. trachomatis serotyp E (0,66 be/µl) Total varians: Intern kontroll Standardavvikelse Varians Variationskoefficient (%) 0,38 0,14 1,23 0,05 0,01 0,36 0,58 0,33 1,90 1,08 1,18 4,80 0,46 0,21 1,47 0,39 0,15 1,74 0,64 0,41 2,45 0,85 0,72 3,34 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 15
Tabell 4. Precisionsuppgifter baserade på CT-värden med hänsyn till rening med QIAamp DNA Mini Kit Intraanalysvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (2,1 be/µl) Intraanalysvariabilitet: Intern kontroll Interanalysvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (2,1 be/µl) Interanalysvariabilitet: Intern kontroll Interbatchvariabilitet: C. trachomatis serotyp E (2,1 be/µl) Interbatchvariabilitet: Intern kontroll Total varians: C. trachomatis serotyp E (2,1 be/µl) Total varians: Intern kontroll Standardavvikelse Varians Variationskoefficient (%) 0,33 0,11 1,06 0,27 0,07 1,12 0,49 0,11 1,09 0,49 0,24 2,07 0,58 0,34 1,83 0,31 0,09 1,33 0,58 0,34 1,87 0,50 0,25 2,13 Robusthet Verifieringen av robusthet möjliggör bestämning av den totala misslyckandefrekvensen för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. 100 prover från svabbar negativa för C. trachomatis, 30 från urin och 30 från sädesvätska tillsattes till en elueringsvolym på 2,1 be/µl av kontroll-dna från C. trachomatis (cirka trefaldig koncentration av den analytiska sensitivitetsgränsen). Efter extrahering med användning av QIAamp DNA Mini Kit (för prover från sädesvätska eller svabbar) och med QIAamp Viral RNA Mini Kit (för urinprover) analyserades proverna med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. För alla prover från C. trachomatis var misslyckandefrekvensen 0 %. Dessutom 16 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
utvärderades robustheten i den interna kontrollen genom rening och analys av 100 prover från svabbar negativa för C. trachomatis, 30 från urin och 30 från sädesvätska. Den totala misslyckandefrekvensen var 0 %. Inhibitioner observerades inte. Robustheten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit är därför 99 %. Reproducerbarhet Med hjälp av uppgifter om reproducerbarhet är det möjligt att regelbundet utvärdera prestandan för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit och göra en effektivitetsjämförelse med andra produkter. Dessa uppgifter erhålls vid deltagande i etablerade kunskapsprogram. Diagnostisk utvärdering artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit har utvärderats i 4 studier. Diagnostisk utvärdering 1: Jämförelse av prover från svabb och urin mellan COBAS Amplicor CT/NG Assay I jämförelsen mellan artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit och COBAS Amplicor CT/NG Assay testades 107 retrospektiva svabb- och urinprover. I denna studie var robustheten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 98 %. Inhiberingar inträffade inte. Den diagnostiska specificiteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 %. Det avvikande provet (tabell 5) testade positivt i 2 C. trachomatisdetektionssystem i tidigare tester, en gång i ett test som kördes med LightCycler 2.0 Instruments och en gång med COBAS Amplicor CT/NG Assayen (artus jämfört med COBAS Amplicor). Koncentrationsförluster i prov som varit förvarade ger en förändring i analysernas detektionsgränser. Därför var orsaken till de båda avvikande resultaten inte ospecifik amplifiering eller detektion (vare sig för kiten artus PCR eller analysen COBAS Amplicor). Tabell 5. Resultat från komperativ valideringsstudie 1 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Totalt artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 47 1 48 1 58 59 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 17
Diagnostisk utvärdering 2: Jämförelse av prov från sädesvätska med COBAS Amplicor CT/NG Assay I jämförelsen mellan artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit och COBAS Amplicor CT/NG Assay testades 65 prospektiva prover från sädesvätska och urin. För 65 av de testade prospektiva proverna från sädesvätska fanns en korrelation på 100 % mellan artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit och COBAS Amplicor CT/NG Assay. Inhiberingsfrekvensen var 0 %. Den diagnostiska sensitiviteten var 100 %. Den diagnostiska specificiteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 % (tabell 6). Tabell 6. Resultat från komperativ valideringsstudie 2 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Totalt artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 16 0 16 0 49 49 Diagnostisk utvärdering 3: Jämförelse av prover från svabb och urin mellan LCx och Aptima Combo 2 Assay När artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit jämfördes med LCR (ligaskedjereaktion, LCx CT Assay) och ett TMA (transkriptionsmedierad amplification, APTIMA Combo 2 Assay) testades 234 retrospektiva svabb- och urinprover. I denna studie var korrelationen mellan LCR (LCx CT Assay) och Aptima Combo 2 Assay med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 98 % för retrospektiva svabboch urinprover. Den diagnostiska specificiteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 99 % (tabell 7). 18 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Tabell 7. Resultat från komperativ valideringsstudie 3 LCx/Aptima Combo 2 + Totalt artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 104 1 105 2 127 129 Diagnostisk utvärdering 4: Test av kliniska ögonsvabbar De 100 tidigare testade ögonsvabbarna testades retrospektivt med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. För dessa 100 testade retrospektiva ögonsvabbar var den diagnostiska sensitiviteten 100 % för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Den diagnostiska specificiteten för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit var 100 % (tabell 8). Tabell 8. Resultat från komperativ valideringsstudie 4 Förväntat resultat + Totalt artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit + 5 0 5 0 95 95 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 19
Utrustning och reagens som ska tillhandahållas av användaren Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Om du vill ha mer information hänvisas till tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. DNA-isoleringskit (se DNA-isolering, sida 24) Pipetter (justerbara)* Sterila pipettspetsar med filter Vortexblandare* Bänkcentrifug* med rotor för 2 ml-reaktionsrör Instrumenten Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene* med fluorescenskanaler för Cycling Green och Cycling Yellow eller fluorescenskanaler för Cycling A.FAM och Cycling A.JOE Rotor-Gene Q MDx-/Rotor-Gene Q-programvaruversion 1.7.94 eller senare (Rotor-Gene 6000-programvaruversion 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94, Rotor- Gene 3000 programvaruversion 6.0.23) Testremserör och lock, 0,1 ml, för användning med 72-brunnars rotor (kat.nr 981103 eller 981106) artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit har inte validerats för användning med Rotor-Genes 36-brunnsrotor. Kylblock (laddningsblock 72 x 0,1 ml-rör, kat.nr 9018901, eller laddningsblock 96 x 0,2 ml-rör, kat.nr 9018905) *Säkerställ att instrumenten är kontrollerade och kalibrerade enligt tillverkarens rekommendationer. 20 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Viktiga anmärkningar Allmänna försiktighetsåtgärder Användaren ska alltid vara uppmärksam på följande: Använd sterila pipettspetsar med filter. Förvara och extrahera positivt material (prover, positiva kontroller och amplikoner) separerade från alla andra reagens och tillsätt dem till reaktionsblandningen på en separat plats. Tina alla komponenter noggrant vid rumstemperatur (15 25 C) innan du startar en analys. När komponenterna är tinade blandar du dem (genom att pipettera upprepade gånger upp och ned eller genom pulsvortexblandning) och centrifugerar dem sedan mycket kort. Arbeta snabbt och förvara komponenter på is eller i kylblocket (72/96- brunnars laddningsblock). Insamling, förvaring och transport av prov Obs! Alla prover måste behandlas som potentiellt infektiöst material. Enbart följande provmaterial är tillåtna, där följande regler och särskilda instruktioner om insamling, transport och förvaring strikt har iakttagits. Urin Ögonsvabbar, endocervikala och uretala svabbar Prov från sädesvätska För att säkerställa hög provkvalitet ska transport av provet gå så snabbt som möjligt. Proverna måste transporteras vid angiven temperatur. Urinprover Obs! Patienten bör rådas att låta bli att urinera minst 2 timmar innan provtagning. Tillvarata 5 30 ml av den första urinen i en ren polypropylenbehållare utan konserveringsmedel. Stäng and märk provbehållaren. Obs! Använd inte urinprov som tagits i behållare med konserveringsmedel. Om testning av urinprover inte kan genomföras inom 24 timmar kan proverna förvaras vid rumstemperatur (15 till 25 C). Vid längre förvaring ska prover Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 21
förvaras vid 2 till 8 C i ett kylskåp om testningen görs inom 7 dagar. Om urinprover inte kan behandlas inom 7 dagar ska de förvaras vid 15 till 30 C eller kallare i högst 30 dagar. Urinprover måste förvaras i kylskåp vid 2 till 8 C i väntan på transport, som måste ske enligt lokala och nationella instruktioner för transport av patogent material.* Svabbprover Obs! Använd följande material för insamling och transport av ögonsvabbar, endocervikala och uretala svabbar. Obs! Använd enbart plastsvabbar med topp av Dacron, rayon eller kalciumalginat. Använd inte svabbar av aluminium eller trä. Ögonprover, endocervikala och uretala prover kan insamlas och transporteras i 1 3 ml av följande medier. digene Female Swab Specimen Collection Kit (QIAGEN, kat. nr. 5123-1220) digene Cervical Sampler (QIAGEN, kat. nr. 5122-1220) AMPLICOR STM (Transportmedium för prover, Roche, Inc.) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Thermo Fisher Scientific) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ChlamTrans CTM (Bartels, Trinity Biotech) Mastazyme Chlamydia Swab Set (MAST DIAGNOSTICA) Mastazyme Chlamydia Transport Medium (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech) Låt svabben vara kvar i kulturtransportmediet. Stäng and märk provbehållaren. Följ noga de givna instruktionerna för förvaring och transport. Prover måste förvaras vid 2 till 8 C. (Om svabbproverna skickas till ett diagnostiklaboratorium måste proverna transporteras så snart som möjligt efter insamling och enligt laboratoriets instruktioner för transport av klamydiaprover.) *International Air Transport Association (Internationellt samarbetsorgan för flygbolag) (IATA). Dangerous Goods Regulations (Föreskrifter om farligt gods). Biosafety in Microbiological Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 22 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Om svabbproverna inte bearbetas direkt efter ankomst till laboratoriet måste de förvaras vid 2 till 8 C och bearbetas inom 7 dagar. Om de inte testas inom 7 dagar efter insamling måste proverna förvaras vid 15 till 30 C eller kallare och testas inom 30 dagar efter tagning. Svabbprover måste transporteras kylda. Svabbprover ska skickas till ett laboratorium så snart som möjligt efter tagning i enlighet med laboratoriets instruktioner om kyltransport. Transportera proven enligt lokala och nationella instruktioner för transport av patogent material.* Prov från sädesvätska Obs! 2 till 4 dagars sexuell abstinens är nödvändig innan provinsamling av sädesvätska. Obs! Prov från sädesvätska måste tas samma dag det skickas till laboratoriet. Genomför insamling av human sädesvätska med någon av följande metoder, enligt standardförfaranden och praxis för laboratoriearbete. Masturbation direkt i en steril, ren och torr behållare. Se till att hela provet samlas upp i behållaren. Om en del av provet går förlorat under insamlandet måste detta antecknas i provtagningsprotokollet. Masturbation med kondom. Ta av kondomen efter ejakulation och fäst en påsförslutare i toppen för att behålla sädesvätskan inuti kondomen. Placera kondomen i en transportväska. Obs! Använd bara behållare utan konserveringsmedel och kondomer utan spermiedödandemedel eller artificiella substanser (som färgämnen). Bibehåll sädesvätskeprover i mörker i 30 till 45 minuter (t.ex. i en låda eller i ett skåp) tills de har omvandlats till vätska. Direkt när sädesvätskeproverna har omvandlats till vätska ska de frysas vid 15 till 30 C i kryoampuller. Sädesvätskeprov som inte bearbetas direkt efter ankomst till laboratoriet måste förvaras vid 15 till 30 C C och bearbetas inom 30 dagar efter provtagning. Om sädesvätskeproverna ska skickas till ett diagnostiskt laboratorium måste de skickas samma dag som de insamlats och enligt laboratoriets instruktioner för transport av klamydiaprover. *International Air Transport Association (Internationellt samarbetsorgan för flygbolag) (IATA). Dangerous Goods Regulations (Föreskrifter om farligt gods). Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 23
Dessutom måste sädesvätskeprover transporteras nedkylda. Proverna ska transporteras enligt lokala och nationella bestämmelser om transport av patogent material.* DNA-isolering De kit från QIAGEN som visas i tabell 9 är validerade för DNA-rening för de indikerade humana provtyper vid användning av artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Utför DNA-reningen enligt följande instruktioner, vilka kan skilja sig från protokollen i handböckerna till kiten. Tabell 9. Kit avsedda för rening som är validerade för användning med artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Provmaterial Urin Nukleinsyraisoleringskit QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) Katalognummer (QIAGEN) Bärar-RNA 52904 Inkluderat Sädesvätska, svabbar QIAamp DNA Mini Kit (50) 51304 Ej inkluderat Obs! artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit ska inte användas med fenolbaserade isoleringsmetoder. Använda QIAamp Viral DNA Mini Kit för urinprover Obs! Användning av bärar-rna är nödvändig för extraheringseffektiviteten och följdaktligen för DNA/RNA-utbytet. Tillsätt korrekt mängd bärar-rna till varje extraktion enligt instruktionerna i handboken till QIAamp Viral RNA Mini (QIAamp Viral RNA Mini Handbook). Obs! Den interna kontrollen för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan användas direkt i isoleringsförfarandet (se Intern kontroll, sidan 30). Bufferten AVL, som ingår i förfarandet för QIAamp Viral RNA Mini, inaktiverar ett flertal oidentifierade PCR-inhibitorer i urin. Protokollet QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol rekommenderas för isolering av cellulärt, bakteriellt och viralt DNA från urin. Låt proverna anta omgivningstemperatur (15 till 25 C). *International Air Transport Association (Internationellt samarbetsorgan för flygbolag) (IATA). Dangerous Goods Regulations (Föreskrifter om farligt gods). 24 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Urin innehåller ofta väldigt få bakterier. Därför är det effektivt att koncentrera proverna. Koncentrera proverna (5 30 ml vardera) genom centrifugering vid maximalt 18 000 x g i 15 20 minuter (alternativt 3 000 x g i 30 minuter). Supernatanten måste avlägsnas försiktigt. Efteråt ska pelleten återsuspenderas i 1 200 µl PBS (1x) genom noggrann vortexblandning för att lösas upp och spridas ut jämnt igen. Detta steg ska utföras genom pulsvortexblandning i 15 30 sekunder. Använd 140 µl av de förberedda proven för DNA-extraktionen. Följ QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol (handboken till QIAamp Viral RNA Mini (QIAamp Viral RNA Mini Handbook), tredje utgåvan, april 2010, sidan 23) från början. Obs!Vi tillråder starkt att man utför den rekommenderade centrifugeringen i steg 10 i protokollet för att avlägsna eventuella etanolrester.vi rekommenderar dessutom att tidslängden för detta centrifugeringssteg utökas till 3 minuter.vi föreslår också att man använder en elueringsvolym på 60 µl. Använda QIAamp DNA Mini Kit för svabb- eller sädesvätskeprov Obs! Användning av bärar-rna är nödvändig för extraheringseffektiviteten och följdaktligen för DNA/RNA-utbytet. Observera att tillsats av bärare (RNA Homopolymer Poly[rA],* ingår inte i QIAamp DNA Mini Kit) rekommenderas starkt för extrahering av nukleinsyror från cellfria kroppsvätskor och material med små mängder av DNA och RNA. I dessa fall ska man bereda bärar-rna enligt följande. Återsuspendera frystorkad bärar-rna (RNA Homopolymer Poly[rA], ingår inte i QIAamp DNA Mini Kit) i elueringsbuffert (använd inte lyseringsbufferten) från extraheringskitet (AE-buffert i QIAamp DNA Mini Kit). Bered en spädning med en koncentration på 1 µg/µl. Dela upp denna lösning av bärar-rna i ett antal alikvoter som är tillräckliga för dina behov och förvara dessa vid 15 till 30 C. Undvik upprepad upptining (mer än två gånger) av en alikvot med bärar-rna. Använd 1 µg bärar-rna per 100 µl lyseringsbuffert. Om extraheringsprotokollet exempelvis föreskriver 200 µl lyseringsbuffert ska du tillsätta 2 µl bärar-rna (1 µg/µl) direkt i lyseringsbufferten (AL-buffert i QIAamp DNA Mini Kit). Innan du påbörjar extraheringsförfarandet ska en färsk blandning av lyseringsbuffert och bärar-rna (och intern kontroll om *Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och skyddsglasögon vid hantering av kemikalier. Om du vill ha mer information hänvisas till tillämpliga säkerhetsdatablad (SDS) som kan erhållas från produktleverantören. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 25
tillämpligt, se Intern kontroll, sidan 30) beredas enligt pipetteringsschemat i tabell 10. Tabell 10. Pipetteringsschema för användning med QIAamp DNA Mini Kit Antal prover 1 12 AL-buffert (lyseringsbuffert)* t.ex. 200 µl t.ex. 2 400 µl Bärar-RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Total volym 202 µl 2 424 µl Volym per extrahering 200 µl 200 µl av vardera * Innehåller guanidinhydroklorid, se handboken till kitet för säkerhetsinformation. Obs! Använd den färska och beredda blandningen av lyseringsbuffert och bärar-rna omedelbart för extrahering. Förvaring av blandningen är inte möjlig. Obs! Den interna kontrollen för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan användas direkt i isoleringsförfarandet (se Intern kontroll, sidan 30). Utför reningen med QIAamp DNA Mini Kit enligt följande steg, vilka kan skilja sig från protokollen i handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). Utjämna prover till rumstemperatur (15 till 25 C). För svabbprover som innehåller en svabb i kulturtransportmedium ska proverna vortexblandas. Locken på provrören måste tas bort försiktigt. Var försiktig så att inte handskarna blir kontaminerade. Kontaminerade handskar måste bytas ut mot ett nytt par inför hantering av nästa prov. Tryck svabben mot provrörets insida för att pressa ut vätskan. Eventuella rester av mukus i provet ska avlägsnas i detta steg genom att samla upp dem på svabben. Eventuell kvarstående vätska från mukus och svabben ska därefter pressas ut genom att trycka svabben mot provrörets insida. Slutligen ska svabben och mukus avlägsnas och kasseras. Pipettera 180 µl av ATL-bufferten och 200 µl av transportmediet till ett 1,5 ml-mikrocentrifugrör och vortexblanda ordentligt. Lägg torra svabbar direkt i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 180 µl ATLbuffert och vortexblanda i 15 30 sekunder. Ett alternativ är att pipettera 26 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
200 µl ATL-buffert till transportröret och vortexblanda svabben i 15 30 sekunder i provröret. Pipettera sedan 180 µl till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Försäkra dig om att vätskan från svabben pressas ut genom att svabben trycks mot provrörets insida. Ta därefter bort svabben och kassera den. För DNA-extraktion från sädesvätskeprover ska du späda 60 µl av provmaterialet med 140 µl PBS (1x) i ett 1,5 ml-mikrocentrifugrör och vortexblanda. Pipettera 100 µl av spädningen och 180 µl av ATL-bufferten till ett 1,5 ml-mikrocentrifugrör och pulsvortexblanda ordentligt i 15 30 sekunder. Tillsätt 20 µl proteinas K och pulsvortexblanda, inkubera vid 56 C i 15 minuter (svabbar) eller i 1 12 timmar (sädevätskeprover). Vortexblanda då och då under inkubationen för att lösa upp provet. Du kan också placera provet i en termomixer. Obs! Proteinas K måste användas. QIAGEN-proteas visar reducerad aktivitet vid närvaro av ATL-buffert. Centrifugera 1,5 ml-mikrocentrifugröret som hastigast för att undvika korskontamination till följd av stänkande provvätska från lockets insida när röret öppnas. Tillsätt 200 µl AL-buffert (med bärar-rna och eventuellt intern kontroll, se ovan och Intern kontroll, sidan 30) till provet. Blanda i cirka 15 sekunder med pulsvortexblandning och inkubera vid 70 C i 10 minuter. Centrifugera 1,5 ml-mikrocentrifugröret som hastigast för att undvika korskontamination till följd av stänkande provvätska från lockets insida när röret öppnas. Det är mycket viktigt att blanda provet och AL-bufferten noggrant för att få lösningen homogen. Tillsätt 200 µl etanol (96 100 %) till provet och pulsvortexblanda i 15 sekunder. Centrifugera mikrocentrifugrören som hastigast för att undvika korskontamination. Applicera försiktigt 500 μl av blandningen (inklusive utfällningen) till QIAamp Mini Spin Column (i ett 2 ml-uppsamlingsrör) utan att blöta ned kanten. Stäng locket försiktigt och centrifugera vid 6 000 x g (8 000 varv/min) i 1 minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent 2 mluppsamlingsrör och kassera uppsamlingsröret med filtratet.* Stäng alla kolonner för att undvika aerosolbildning under centrifugeringen. *Filtratet innehåller AL-buffert eller AW1-buffert och är därför inte kompatibelt med blekmedel. Säkerhetsinformation hittar du i handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 27
Upprepa föregående steg genom att applicera hela den kvarvarande blandningen till QIAamp Mini Spin Column. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 μl AW1-buffert utan att blöta ned kanten. Stäng locket försiktigt och centrifugera vid 6 000 x g (8 000 varv/min) i 1 minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent 2 ml-uppsamlingsrör och kassera uppsamlingsröret med filtratet.* Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 500 μl AW2-buffert utan att blöta ned kanten. Stäng locket försiktigt och centrifugera vid maximal hastighet (t.ex. 16 000 varv/min) i 3 minuter. Kassera det uppsamlingsrör som innehåller filtratet. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent 2 ml-uppsamlingsrör centrifugera vid maximal hastighet (t.ex. 16 000 varv/min) i 3 minuter. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent 1,5 ml-uppsamlingsrör och kassera uppsamlingsröret med filtratet. Öppna QIAamp Mini Spin Column försiktigt och tillsätt 50 μl AE-buffert. Inkubera i rumstemperatur (15 till 25 C) i en minut och centrifugera sedan QIAamp Mini Spin Column vid cirka 6 000 x g (8 000 varv/min) i 1 minut. Använda QIAamp DNA Mini Kit för frystorkade prover Obs! Användning av bärar-rna är nödvändig för extraheringseffektiviteten och följdaktligen för DNA/RNA-utbytet. Observera att tillsats av bärare (RNA Homopolymer Poly[rA], ingår inte i QIAamp DNA Mini Kit) rekommenderas starkt för extrahering av nukleinsyror från cellfria kroppsvätskor och material med små mängder av DNA och RNA. I dessa fall ska man bereda bärar-rna enligt följande. Återsuspendera frystorkad bärar-rna (RNA Homopolymer Poly[rA], ingår inte i QIAamp DNA Mini Kit) i elueringsbuffert (använd inte lyseringsbufferten) från extraheringskitet (AE-buffert i QIAamp DNA Mini Kit). Bered en spädning med en koncentration på 1 µg/µl. Dela upp denna lösning av bärar-rna i ett antal alikvoter som är tillräckliga för dina behov och förvara dessa vid 15 till 30 C. Undvik upprepad upptining (mer än två gånger) av en alikvot med bärar-rna. Använd 1 µg bärar-rna per 100 µl lyseringsbuffert. Om extraheringsprotokollet exempelvis föreskriver 200 µl lyseringsbuffert ska du tillsätta 2 µl bärar-rna (1 µg/µl) direkt i lyseringsbufferten (AL-buffert i QIAamp DNA Mini Kit). Innan du påbörjar extraheringsförfarandet ska en *Filtratet innehåller AL-buffert eller AW1-buffert och är därför inte kompatibelt med blekmedel. Säkerhetsinformation hittar du i handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). 28 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
färsk blandning av lyseringsbuffert och bärar-rna (och intern kontroll om tillämpligt, se Intern kontroll, sidan 30) beredas enligt pipetteringsschemat i tabell 11. Tabell 11. Pipetteringsschema för användning med QIAamp DNA Mini Kit Antal prover 1 12 AL-buffert (lyseringsbuffert)* t.ex. 200 µl t.ex. 2 400 µl Bärar-RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Total volym 202 µl 2 424 µl Volym per extrahering 200 µl 200 µl av vardera * Innehåller guanidinhydroklorid, se handboken till kitet för säkerhetsinformation. Obs! Använd den färska och beredda blandningen av lyseringsbuffert och bärar-rna omedelbart för extrahering. Förvaring av blandningen är inte möjlig. Obs! Den interna kontrollen för artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit kan användas direkt i isoleringsförfarandet (se Intern kontroll, sidan 30). Utför reningen med QIAamp DNA Mini Kit enligt följande steg, vilka kan skilja sig från protokollen i handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). Utjämna prover till rumstemperatur (15 till 25 C). Rekonstituera det frystorkade provet noggrant i 500 µl PBS (1x) genom att skaka försiktigt för hand. Inkubera därefter proven i minst 30 minuter vid rumstemperatur (15 till 25 C) i en skakapparat (t.ex. termomixer) om möjligt. Pipettera 200 µl av det rekonstituerade provet och 360 µl ATL-buffert till ett 1,5 ml-mikrocentrifugrör och vortexblanda ordentligt. Tillsätt 20 µl proteinas K, pulsvortexblanda och inkubera vid 56 C i 1 12 timmar. Vortexblanda då och då under inkubationen för att lösa upp provet. Du kan också placera provet i en termomixer. Obs! Proteinas K måste användas. QIAGEN-proteas visar reducerad aktivitet vid närvaro av ATL-buffert. Centrifugera 1,5 ml-mikrocentrifugröret som hastigast för att avlägsna droppar från lockets insida. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 29
Tillsätt 400 µl AL-buffert (med bärar-rna och eventuellt intern kontroll, se ovan och Intern kontroll, sidan 30) till provet. Blanda i cirka 15 sekunder med pulsvortexblandning och inkubera vid 70 C i 10 minuter. Tillsätt 400 µl etanol (96 100 %) till provet och pulsvortexblanda i 15 sekunder. Applicera försiktigt 700 μl av blandningen till QIAamp Mini Spin Column utan att blöta ned kanten. Stäng locket och centrifugera vid 6 000 x g (8 000 varv/min) i 1 minut. Placera QIAamp Mini Spin Column i ett rent 2 ml-uppsamlingsrör och kassera röret med filtratet.* Upprepa föregående steg genom att applicera hela den kvarvarande blandningen till QIAamp Mini Spin Column. Följ protokollet för vävnader (handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook), tredje utgåvan, juni 2012, sidan 32) från och med tillsatsen av AW1-bufferten i steg 8. Obs! Vi rekommenderar starkt att man utför det rekommenderade centrifugeringssteget 10 i protokollet för att avlägsna eventuella etanolrester. Vi rekommenderar att man ökar tiden för denna centrifugering till 3 minuter. Det kan vara lämpligt att använda en elueringsvolym på 50 µl AE-buffert. Intern kontroll En intern kontroll (C. trachomatis Plus RG IC) medföljer. Detta gör att användaren både kan kontrollera DNA-isoleringsförfarandet och kontrollera om det finns en möjlig inhibering av PCR. För denna användning tillsätter man den interna kontrollen till isolatet i förhållandet 0,1 µl per 1 µl elueringsvolym. Exempelvis elueras DNA i 200 µl AE-buffert vid användning av QIAamp DNA Mini Kit. Därför ska 20 µl av den interna kontrollen tillsättas initialt. Om du eluerar exempelvis 100 µl blir den motsvarande volymen du ska använda 10 µl. Mängden intern kontroll som används beror enbart på elueringsvolymen. Obs! Den interna kontrollen och bärar-rna (se DNA-isolering ovan) ska endast tillsättas blandningen av lyseringsbuffert och provmaterial eller direkt till lyseringsbufferten. Den interna kontrollen får inte tillsättas direkt till provmaterialet. Om den tillsätts till lyseringsbufferten ska man observera att blandningen av intern kontroll och *Filtratet innehåller AL-buffert eller AW1-buffert och är därför inte kompatibelt med blekmedel. Säkerhetsinformation hittar du i handboken till QIAamp DNA Mini and Blood Mini (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). 30 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
lyseringsbuffert bärar-rna måste beredas färsk och användas omedelbart (förvaring av blandningen vid rumstemperatur eller i kylskåp under bara några timmar kan leda till utebliven funktion av den interna kontrollen och en minskad extraheringseffektivitet). Obs! Tillsätt inte den interna kontrollen och bärar-rna direkt till provmaterialet. För att en rening ska anses ha lyckats ska CT-värdet för den interna kontrollen för ett negativt prov som har bearbetats under reningen (QIAamp DNA Mini Kit eller QIAamp Viral RNA Mini Kit) ha uppnått CT = 24 ± 3 (tröskelvärde 0,02) för användning med Rotor-Gene Q Instruments. Den angivna avvikelsen på upp till 3 CT-värden är baserad på variansen hos instrumentet och reningen. En högre avvikelse tyder på problem med reningen. I detta fall måste reningen kontrolleras och eventuellt valideras ytterligare en gång. Om du har några ytterligare frågor eller om du stöter på problem kan du kontakta QIAGEN:s tekniska service. Den interna kontrollen kan även användas uteslutande för att kontrollera eventuell PCR-inhibering. För denna användning ska man tillsätta den interna kontrollen direkt till C. trachomatis Plus RG Master och C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol, enligt beskrivning i steg 2b i protokollet (sidan 33). Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 31
Protokoll: PCR- och dataanalys Viktigt att tänka på före start Innan du startar förfarandet läser du Viktiga anmärkningar, sidorna 21 30. Ta dig tid att bekanta dig med Rotor-Gene Q Instrument innan du startar protokollet. Se instrumentets användarhandbok. Säkerställ att minst en positiv kontroll såväl som en negativ kontroll (vatten, PCR-kvalitet) ingår i varje PCR-körning. Moment att utföra före start Säkerställ att kylblocket (tillbehör till Rotor-Gene Q Instrument) är förkylt till 2 till 8 C. Före varje användning måste alla reagenser tinas helt, blandas (pipettera upprepade gånger upp och ned eller vortexblanda snabbt) och centrifugeras som hastigast. Förfarande 1. Placera önskat antal PCR-rör i kylblockets adaptrar. 2. Om du använder den interna kontrollen för att övervaka DNA-isoleringen och kontrollera eventuell PCR-inhibering, följ steg 2a. Om du använder den interna kontrollen uteslutande för att kontrollera PCR-inhibering, följ steg 2b. 2a. Den interna kontrollen har redan tillsatts till isolatet (se Intern kontroll, sidan 30). I detta fall ska du bereda en masterblandning enligt tabell 12. Reaktionsblandningen innehåller vanligtvis alla komponenter som behövs för PCR, förutom provet. 32 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016
Tabell 12. Beredning av masterblandning (intern kontroll som används för att övervaka DNA-isolering och kontrollera PCR-inhibering) Antal prover 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 0 µl 0 µl Total volym 15 µl 180 µl 2b. Den interna kontrollen måste tillsättas direkt till blandningen av C. trachomatis Plus RG Master och C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol. I detta fall ska du bereda en masterblandning enligt tabell 13. Reaktionsblandningen innehåller vanligtvis alla komponenter som behövs för PCR, förutom provet. Tabell 13. Beredning av masterblandning (intern kontroll som används uteslutande för att kontrollera PCR-inhibering) Antal prover 1 12 C. trachomatis Plus RG Master 13 µl 156 µl C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol 2 µl 24 µl C. trachomatis Plus RG IC 1 µl 12 µl Total volym 16 µl* 192 µl* * Volymökningen orsakad av tillsats av intern kontroll är försumbar vid förberedning av PCR-analysen. Detektionssystemets sensitivitet försämras inte. 3. Pipettera 15 µl av masterblandningen i varje PCR-rör. Tillsätt sedan 10 µl av eluerat prov-dna (se tabell 14). På motsvarande sätt måste 10 µl av C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control användas som en positiv kontroll och 10 µl vatten (vatten, PCR-kvalitet) som en negativ kontroll. Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016 33
Tabell 14. Förberedning av PCR-analys Antal prover 1 12 Masterblandning 15 µl 15 µl av vardera Prov 10 µl 10 µl av vardera Total volym 25 µl 25 µl av vardera 4. Stäng PCR-rören. Kontrollera att låsringen (tillbehör till Rotor-Gene Instrument) är placerad överst på 72-brunnsrotorn för att förhindra att rören öppnas av misstag under körningen. 5. Skapa en temperaturprofil för detektion av DNA från C. trachomatis genom att utföra följande steg. Inställning av allmänna analysparametrar Figur 3, 4, 5 Första aktivering av enzym med varmstart Figur 6. DNA-amplifiering Figur 7. Justering av fluorescenskanalsensitiviteten Figur 8 Start av körningen Figur 9 Alla specifikationer gäller för Rotor-Gene Q MDx-/Rotor-Gene Q programvaruversion 1.7.94, Rotor-Gene 6000 programvaruversion 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94 och Rotor-Gene 3000 programvaruversion 6.0.23. Mer information om hur du programmerar Rotor-Gene Q Instruments hittar du i användarhandboken till instrumentet. I illustrationerna har dessa inställningar en tjock svart inramning. Illustrationerna omfattar Rotor-Gene Q-instrument. Där andra värden krävs för Rotor-Gene 3000 beskrivs dessa skillnader i texten. 34 Handbok till artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit 10/2016