Josefin Wiman. Examensarbete 15p C-nivå, Vt 08 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet

Transkript

1 Examensarbete 15p C-nivå, Vt 08 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Investigation of the intra-day variation in stearoyl-coa-desaturase activity by measuring the product-to-precursor ratios of fatty acids (16:1/16:0 and 18:1/18:0) Josefin Wiman Handledare: Annika Smedman, Siv Tengblad, Eva Warensjö Institutionen för folkhälso- och vårdvetenskap, Klinisk nutrition och metabolism Uppsala Universitet

2 ABSTRACT Obesity is today a problem that has reached epidemic proportions. One of the causes of obesity is the over-consumption of energy. Fat is the most energy-dense nutrient, where the quality seems to be more important for the development of the metabolic diseases than the quantity. The fatty acid composition in serum lipid fractions can be used to mirror the dietary fat quality. Stearoyl-CoA-desaturase (SCD) is an enzyme that converts saturated to monounsaturated fatty acids. A surrogate measure of SCD activity can be estimated as a fatty acid ratio; 16:1/16:0 (palmitoleic acid/palmitic acid) and 18:1/18:0 (oleic acid/stearic acid). The aim of this project was to investigate the intra-day variation in the SCD-ratio in humans eating a standardized diet. The results showed that triacylglycerol and nonesterified fatty acid fractions in serum lipids had a significant variance in the 16:1/16:0 ratio during the day, whereas 18:1/18:0 ratio in the same fractions did not exhibit the same pattern. In this study 16:1/16:0 ratio also seems to be a better marker than 18:1/18:0 ratio for estimating SCD activity. For further evaluation of the intra-day variation there need to be a more long-term study of the SCD-activity for a larger group of subjects. KEYWORDS Obesity, metabolic syndrome, fatty acid, serum lipid, SCD activity 2

3 INTRODUKTION Fetma och övervikt är idag ett problem som globalt ökar allt mer i befolkningen. Antalet överviktiga i världen är i dagsläget ca en miljard personer och av dessa räknas fler än 300 miljoner som feta. Som överviktig räknas en person som har ett Body Mass Index (BMI) på över 25kg/m 2 och fet vid ett BMI på över 30kg/m 2. Fetma och övervikt ökar risken för att drabbas av olika följdsjukdomar. Det metabola syndromet står för olika metabola förändringar (riskfaktorer) hos en individ, vilket oftast innebär att personen har för högt blodtryck, förändrade blodfetter (höga triglycerid-nivåer, höga nivåer av low density lipoprotein (LDL) och låga nivåer av high density lipoproteins (HDL)) och störd insulin- och glukosomsättning. Det metabola syndromet leder till en ökad risk för hjärtkärlsjukdomar och typ 2 diabetes, som i sin tur kan leda till för tidig död (1). Uppkomsten av dessa sjukdomar kan till viss del härledas till fettet i kosten, där kvalitén på fettet tycks ha större betydelse än kvantiteten (2). Det fett som finns i maten ska i kroppen transporteras i blodet som är en vattenlöslig miljö. För att göra detta möjligt paketeras fettet i partiklar, lipoproteinpartiklar, som har en hydrofil yta och en hydrofob mitt. De huvudsakliga lipoproteinerna är kylomikroner, very low density lipoprotein (VLDL), LDL och HDL. Dessa lipoproteinpartiklar innehåller olika lipider, serumlipider, som delas upp i fraktionerna; triglycerider (TG), fosfolipider (PL), kolesterolestrar (CE) och fritt kolesterol (FC). Ickeesterifierade (fria) fettsyror (FFA) transporteras i blodet bundna till albumin. I dessa serumlipider kan analys av fettsyrakompositionen i vår kropp göras. Fettet i vår kropp ger oss både energi och fungerar som ett energilager. Den upplagrade energireserv vi har består av TG som lagrats in i fettväven. Fettväven fungerar i sin tur även som 3

4 ett isoleringsmaterial och hjälper till att bibehålla kroppstemperaturen. Den har också som funktion att fungera som stötdämpning för flertalet av våra organ. Fettväven är metabolt aktiv och flera hormonliknande substanser produceras i fettcellerna. Fettet i vår föda består även den till största del av TG, som t.ex. smör, margariner och matoljor. TG är uppbyggda av glycerol, en trevärd alkohol (1,2,3-propantriol (C 3 H 5 (OH) 3 )), till vilken tre fettsyror är kopplade med hjälp av esterbindning. PL är uppbyggda på ett liknande sätt som TG, med skillnaden att PL innehåller en fosfatgrupp tillsammans med andra föreningar (t ex kolin). Till gruppen PL tillhör fosfoglycerider och sfingolipider. Sfingolipider ingår framför allt i cellmembran, t.ex. i erytrocyter, i hjärnan och i perifera nerver. Kolesterol tillhör gruppen steroler som består av fettlösliga alkoholer. Gemensamt för alla steroler är att de har en grundstruktur, ett s.k. steroidskelett. Kolesterol kan förekomma i fri form eller förestrad med en fettsyra, CE. Kolesterol finns huvudsakligen i animalisk vävnad. Kolesterol är viktig som utgångsmaterial för syntes av t.ex. steroidhormoner (såsom kortisol och könshormoner), vitamin D och gallsyror. Kolesterol ingår i cellmembran, där samverkan mellan kolesterol, proteiner och PL påverkar genomsläppligheten över membranet. Kolesterol tillförs via maten eller kommer från kroppens egen produktion i levern. Den största kvantitativa mängden kommer från levern. Fettsyror är uppbyggda av en kedja av kolatomer, vilket väte binder till. I kedjan finns en metylgrupp i ena änden och en karboxylgrupp i den andra. Fettsyror har olika biologiska effekter och fysiologiska egenskaper beroende på kedjelängd, mättnadsgrad och isomerisk form. Fettsyrorna kan vara mättade eller omättade. En omättad fettsyra har en eller flera dubbelbindningar. Fettsyror utan dubbelbindningar är mättade, t.ex. 18:0 (stearinsyra). De 4

5 omättade fettsyrorna delas in i enkel- och fleromättade fettsyror. De enkelomättade har en dubbelbindning, t.ex. 18:1, n-9 (oljesyra). Fleromättade fettsyror har två eller fler dubbelbindningar, t.ex. 18:2, n-6 (linolsyra). Kolatomerna i fettsyrorna kan numreras från dess metylgruppsände med n- eller omega- (ω) numrering; 18:1 (Oljesyra). Numreringen kan även göras från karboxylgruppsänden, delta- ( ) numrering. Positionen av den första dubbelbindningen kan utläsas som 18:2, n-6, där n-6 betyder att första dubbelbindningen kommer på kolatom nummer 6 från metylgruppsänden räknat. Endast den första dubbelbindningen anges. Hur många dubbelbindningar en fettsyra har, har betydelse för dess smältpunkt och följsamheten i cellmembranen där de ingår. De enzymer som omvandlar enkelbindningar till dubbelbindningar är desaturas. Dessa enzymer är bundna till det endoplasmatiska retikulet och hjälper till att bilda dubbelbindningar i fettsyror med långa kedjor. Ett av dessa enzym är 9-desaturas, även kallat stearoyl-coa-desaturase (SCD). SCD bildar den första dubbelbindningen på 9, 10 positionen från karboxyländen på mättade fettsyror, vilket sker i det sista steget i bildningen av enkelomättade fettsyror. Detta sker på fettsyror med kolatomer (3). Bland annat så omvandlar SCD 18:0 (stearinsyra) till 18:1 (oljesyra) och 16:0 (palmitinsyra) till 16:1 (palmitoljesyra). SCD har därmed en betydande roll för bildning av PL, TG, vaxestrar och CE, då de omättade fettsyrorna behövs för uppbyggnad av dessa lipider. SCD regleras av flera olika faktorer. Inducering av SCD sker av glukos, fruktos, kolesterol, insulin och östrogen. Inhibitorer av SCD är istället fleromättade fettsyror, alkohol och leptin (4). SCD tros kunna användas i framtiden som läkemedel mot övervikt och relaterade sjukdomar. Vid studier på knock-out möss (där SCD-genen slagits ut) har man sett att de har en bättre insulinkänslighet, högre energimetabolism och är smalare jämfört med normala möss. Studierna 5

6 på knock-out möss visar även att gener som är involverade i β-oxidationen uppregleras och gener involverade i lipidsyntesen nedregleras (5). För uppskattning av SCD-aktiviteten i humanstudier används fettsyrakvoterna 16:1/16:0 och 18:1/18:0. Detta är en indirekt metod för att undersöka SCD-aktiviteten. Ett annat sätt att mäta SCD-aktiviteten är att mäta mrna nivåer eller proteinuttryck. Detta är dock en metod som inte används vid studier på människor då det organ som är mest relevant att mäta aktiviteten ifrån antagligen är levern. Det är även möjligt att mäta SCD-uttryck i fettvävnad och skelettmuskulatur. Det är troligt att SCD-kvoterna i människa varierar under dygnet beroende på nutritionsstatus, men detta är inte väl undersökt. Det är därför viktigt att studera detta. I denna studie studerades förändringar i SCD-kvoterna under dygnet och fettsyrakvoterna 16:1/16:0 och 18:1/18:0 i serumlipider användes för att undersöka SCD-aktiviteten. För analys av fettsyrainnehåll i ett prov måste först lipiderna separeras från övrigt förekommande komponenter som t.ex. proteiner och kolhydrater. Detta gjordes med en s.k. Folch-extraktion. Lipiderna fraktionerades därefter med hjälp av tunnskiktskromatografi (TLC), vilket gav lipidfraktionerna; PL, FC, FFA, TG och CE. FC används dock inte till denna studie då dessa ej innehåller fettsyror. Inför analys av fettsyrorna måste sedan en avspjälkningen av fettsyrorna ske från de olika komponenterna i lipiderna, dvs. i fraktionerna TG, PL och CE. För att analysera fettsyrorna användes gaskromatografi, då det med denna metod går att få en komplett kvalitativ analys av fettsyrakompositionen i ett prov på kort tid. Andelen av de olika fettsyrorna mättes i relativ mängd (%). Metoden som huvudsakligen användes finns tidigare beskriven av Boberg et al (6). Detta är en välanvänd metod för analys av fettsyrasammansättning i lipidfraktioner och användes 6

7 genomgående i detta arbete. Skillnader i utförande av de olika stegen för extraktion och separation med mera kan dock finnas, men principen för analysen är densamma. Undersökningen gjordes på sju friska personer mellan 20 och 60 år. Försökspersonerna fick under samma dag standardiserade måltider vid bestämda tidpunkter och fick lämna blodprov sammanlagt 4 gånger. Proverna bestod av 2 fasteprov samt prov före lunch och före middag. MATERIAL/METOD Studieupplägg Den standardiserade kosten för undersökningen bestod av fil (3 %), mjukost, bröd och müsli till frukost. Till lunch serverades färdig kycklingsallad och baguette och till middag färdig ärtsoppa och pannkakor. Under dagen ingick även mellanmål med apelsin, banan och äpple. Första blodprovet (fastepr.1) togs före frukost dag 1 mellan kl , försökspersonerna var då fastande sedan dagen innan. Andra blodprovet (11.45) togs innan lunch dag 1, ca Tredje provet (16.45) togs sent på eftermiddagen innan middag dag 1, ca Det sista provet (fastepr.2) togs före frukost dag 2, ca , som fasteprov. Provmaterial Till analysen användes venöst blod taget i 6 ml serumrör, 1 prov per provtagningstillfälle. Serumröret fick stå i ca 30 min innan det centrifugerades, 2860 g i 10 min. Serumet fördes sedan över till eppendorfrör som förvarades i frys (-70ºC) fram till analystillfället. 7

8 Extraktion av lipider 1 ml serum pipetterades till ett preparatrör, mm med plan botten. Lipiderna i provet extraherades genom att 5 ml metanol tillsattes. Provet vortexades direkt i ca 5 s. 10 ml kloroform med 0,005 % (w/v) butylerad hydroxitoluen (BHT) tillsattes. BHT fungerar som en antioxidant som förhindrar att fettsyrorna oxiderar. Slutligen tillsattes 15 ml 0,2 M NaH 2 PO 4 (vattenfas), vilket leder till att blandningen delar upp sig i 2 faser. Detta sker på grund av att metanolen hellre blandar sig i vattenfasen än i kloroformen. Rören fick sedan stå över natt i kylskåp (bör stå minst 16 h, men kan stå upp till en vecka). De två faserna i preparatröret bestod då av en opolär underfas av kloroform, där lipiderna fanns, och en polär överfas av metanol/nah 2 PO 4 -lösning som innehöll de övriga komponenterna. Den undre fasen (kloroformfasen) sögs sedan upp med hjälp av en 10 ml glasspruta med en metallspets på 15 cm. Kloroformfasen fördes över till ett provrör av glas som sedan indunstades på värmeblock vid 30 C med en lätt ström av kvävgas. När allt lösningsmedel avdunstat tillsattes en liten mängd kloroform/bht-lösning på ca µl för att förhindra att fettsyrorna oxiderades och för att senare kunna applicera provet på tunnskiktsplattan. Rören proppades för att förhindra indunstning av provet. Tunnskiktskromatografi Preparation av tunnskiktsplatta Tunnskiktplattorna preparerades genom att först ta 2 rena glasplattor, cm. Dessa tejpades längs med ytterkanterna med 3 lager tejp av typ hospital tape. Plattorna torkades av med 95 % sprit. Sedan blandades 20 g kiselgel (Merck) med 70 ml brukslösning. Brukslösningen bestod av 1 ml POPOP-lösning i 1 l etanol. POPOP-lösningen blandades genom att tillsätta 0,6 g POPOP (1,4-bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzene (Packard)) till 1 l toluen. Den färdigblandade kiselgel- 8

9 lösningen hälldes ut på de två glasplattorna. För fördelning av kiselgelen drogs en glasstav snabbt en gång över plattorna. Plattorna torkades i dragskåp och fick sedan stå i värmeskåp, 30 min i 100 C. Separation av lipiderna En platta togs ur värmeskåpet och fick svalna ca 5 min. Provet applicerades med en pasteurpipett av glas på nederkanten av plattan (figur 1). Provet applicerades försiktigt i omgångar då fläcken ej fick bli större än 0,5 cm i diameter. Provröret sköljdes med ytterligare µl kloroform/bht-lösning för att få upp det sista av provet. Figur 1. Applicering av prov på tunnskiktsplattan. Totalt får 6 stycken prover plats på plattan. Plattan ställdes i en glasvanna, mm, med tillhörande glaslock. I vannan blandades innan den mobila fasen; 18 ml dietyleter, 81 ml petroleumbensin och 1 ml koncentrerad ättikssyra. Den mobila fasen är opolär, vilket leder till att de minst opolära lipiderna separeras ut först (nederst) på plattan och sen vidare efter minskad polaritet. Blandningen fick stå i minst 30 min före plattan sattes i. Plattan fick stå i ca min, tills lösningsmedelsfronten hade vandrat upp till plattans överkant. Plattan togs då upp och fick lufttorka i dragskåp i ca 30 min. Plattan lades under en UV-lampa, vilket synliggjorde de olika fraktionerna (figur 2). De olika fraktionerna markerades med en nål vartefter vardera fläck (förutom FC) skrapades ned i ett glasprovrör med skruvlock. Provet tillsattes 2 ml 5 % (v/v) svavelsyra i metanol. Avspjälkning av fettsyrorna sker då genom hydrolys med hjälp av svavelsyran samtidigt som fettsyrorna 9

10 esterifieras med hjälp av metanolen. Provröret proppades och vortexades i ca 5 s och sattes sedan i ett värmeblock vid 60 C över natt (minst 16 h). 5. CE (kolesterolester) 4. TG (triglycerider) 3. FFA (fria fettsyror) 2. FC (fritt kolesterol) 1. PL (fosfolipider Figur 2. De olika lipiderna efter separation med TLC av det applicerade provet. Rören fick svalna i rumstemperatur och 3 ml petroleumbensin och 1,5 ml avjoniserat H 2 O tillsattes provet. Provet vortexades i ca 5 s och centrifugerades 580 g i 10 min. Överfasen, innehållandes petroleumbensin/fettsyrametylestrarna, sögs av och fördes över till ett provrör med propp. Provet kan förvaras i ett par månader i frys (-70ºC). Gaskromatografi Analys med gaskromatografi Separation av fettsyrorna med gaskromatografi sker genom att provet fördelas mellan två faser, en stationär och en mobil fas. Den mobila fasen är en gas, vilken även kallas bärgas. Vid separation av fettsyror, där provmaterialet är opolärt, bör även stationärfasen i kolonnen vara opolär. De olika fettsyrorna kan särskiljas med gaskromatografi genom att de har olika retentionstid, dvs. elueringstidpunkter. I kolonnen separareras fettsyrametylestrarna dels beroende på interaktion med den fasta fasen, dels på deras kokpunkter, vilket beror på antal kolatomer och antal dubbelbindningar som ingår i fettsyrakedjorna. De olika fettsyrametylestrarna elueras ut som toppar i en viss följd och identifieras genom sin retentionstid (som får jämföras med de i standarden ingående fettsyrornas). Standarden som används för denna metod är kvalitativ och består av alla fettsyror som kan ingå i ett lipidprov. 10

11 Denna används för att få ut en standard för retentionstiderna för vardera fettsyran. Till kalibrering används olika mixer beroende på vilka fettsyror som skall analyseras. Resultaten där bör ej ha ett spridningsmått på mer än 5 % från retentionstiderna. Provet injiceras med ett injektionssystem på gaskromatografen där det förångas och transporteras in i kolonnen med hjälp av den mobila fasen, bärgasen, som i det här fallet är helium. Fettsyrorna separeras därefter i den uppvärmda kolonnen. Till den här metoden användes en flamjonisationsdetektor (FID). De organiska föreningarna från kolonnen joniseras i en flamma, som brinner av en blandning av vätgas och luft. De joner som bildas samlas upp av elektroder som ger upphov till en elektrisk ström. Denna signal förstärks sedan och avläses. Resultatet kan sedan ses i ett kromatogram, där vardera separerade typ av fettsyra ger upphov till en topp i kromatogrammet. Proverna analyserades med gas-liquid chromatography (GLC) med apparatur 6890 N Network GC system (Agilent Technologies). Först indunstades provet på värmeblock i 30ºC, med en lätt ström av kvävgas, vartefter 500 µl hexan (av typ uvasol, för spektrofotometri) tillsattes. Provet hälldes över till 0,1 ml Micro-Insert (31 6 mm, Skandinaviska Gene Tec AB) som sattes i en 1,5 ml vial (Crimp Neck Vial 32 11,6 mm, Skandinaviska Gene Tec AB). Detta försluts sedan med Aluminium Cap (11 mm, Skandinaviska Gene Tec AB). Vialen passar i 7683 Series Autosampler (Agilent Technologies). Provet separerades med hjälp av programmet Chem station (Agilent Chemstation), se tabell 1, och injicerades med 7683 B Series Injector (Agilent Chemstation). Till denna analys användes en kolonn av typ Termo TR-Fame, 30,0 m 320 µm 0,25 µm nominal (Dalco Chromtech AB) som tål en maxtemperatur på 260 C. 11

12 Inställningar Tabell 1. Inställning av temperatur för analys med hjälp av programmet Chem station. Oven Ramp C/min Next C Hold min Run time Initial 150 0,50 0,50 Ramp1 3, ,00 10,50 Ramp2 1, ,00 20,50 Ramp3 30, ,00 32,83 Post run 50 0,00 32,83 Tabellen visar de olika nivåerna för temperaturökning (Ramp). C/min anger temperaturökning/min tills förinställd tid uppnåtts; Next C. Hold min anger hur länge samma temperatur, dvs. den förinställda Next C, skall hållas. Run time är den totala tid som gått. Statistisk analys De statistiska analyserna gjordes med hjälp av statistikprogrammet STATA (version 10; STATA Corporation, TX, USA). Jämförelse av proverna gjordes med paired t-test, där fastepr.1 sattes som referens. Signifikans nivån sattes till p<0,05. RESULTAT I denna studie användes serumlipider för att undersöka variation av fettsyror under dygnet hos försökspersoner som ätit en standardiserad kost. Från de fraktionerade serumlipiderna användes kvoterna av fettsyrorna 16:1/16:0 och 18:1/18:0 som ett indirekt mått på SCD-aktiviteten, resultatet av detta ses i figur 3 och 4. En jämförelse i hur SCD-kvoten 16:1/16:0 (medelvärde) varierade i de olika fraktionerna visas i figur 3. I denna figur är provet i FFA och TG signifikant lägre (p 0,05) till skillnad från PL och CE som ligger mer konstant över dygnet, vilket även gäller helserum. Variation i fettsyrorna 16:1 och 16:0 i FFA vid olika tidpunkter visas i figur 5 och 6. Båda fettsyrorna följer ett liknande mönster med ett lägre prov. Mönstren kan jämföras med kvoten 16:1/16:0 för FFA i figur 3, vilken också har ett lägre värde för16.45-provet. 12

13 I figur 7 visas variation i SCD-kvoten 18:1/18:0 i fraktionen FFA, som visar ett spritt mönster mellan försökspersonerna. Jämförelse mellan SCD-kvoterna 18:1/18:0 i de olika fraktionerna visas i figur 4. Denna jämförelse uppvisar ej samma mönster som för SCD-kvoten 16:1/16:0 med ett lägre prov i FFA och TG. Däremot var provet signifikant lägre i TG-fraktionen. Ett liknande mönster kan även ses i fraktionen för FFA, även om skillnaden mellan de olika proverna är mycket mindre än för de som ses i TG-fraktionen. Analys av ursprungsdata visade att skillnaden i SCD 18:1/18:0 i provet i TG-fraktionen (figur 4) berodde på en högre mängd 18:0 och en lägre mängd 18:1 (figur 8, 9). Figur 3. Variation över dygnet i SCD-kvot 16:1/16:0 (medelvärde) i de olika fraktionerna. Medelvärden +/- SD anges för fraktionerna FFA och TG. För beräkning av signifikans användes paired t-test, där fastepr.1 sattes som referens (* p<0,05). Fastepr.1 är blodprovet som togs före frukost dag 1 mellan kl Försökspersonerna var då fastande sedan dagen innan. Prov togs innan lunch dag 1, ca 11.45, och prov togs sent på eftermiddagen innan middag dag 1 vid ca Fastepr.2 togs före frukost dag 2, ca , som fasteprov. 13

14 Figur 4. Variation över dygnet i SCD-kvot18:1/18:0 (medelvärde) i de olika fraktionerna. Medelvärden +/- SD anges för fraktionerna FFA och TG. För beräkning av signifikans användes paired t-test, där fastepr.1 sattes som referens (* p<0,05). Fastepr.1 är blodprovet som togs före frukost dag 1 mellan kl Försökspersonerna var då fastande sedan dagen innan. Prov togs innan lunch dag 1, ca 11.45, och prov togs sent på eftermiddagen innan middag dag 1 vid ca Fastepr.2 togs före frukost dag 2, ca , som fasteprov. Figur 5. Variation av 16:0 i FFA-fraktionen Figur 6. Variation av 16:1 i FFA-fraktionen vid de olika tidpunkterna hos försöksperson; vid de olika tidpunkterna hos försöksperson; 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7. 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7. Fettsyra 16:0 likasom fettsyra 16:1 (figur 6) Fettsyra 16:1 likasom fettsyra 16:0 (figur 5) visar ett liknande mönster som kvoten visar ett liknande mönster som kvoten 16:1/16:0 för FFA, figur 3, med ett lägre värde 16:1/16:0 för FFA, figur 3, med ett lägre värde för provet. för provet. 14

15 Figur 7. Variation över dygnet i SCD-kvot Figur 8. Variation av 18:0 i TG-fraktionen 18:1/18:0 i FFA-fraktionen hos försöks- hos försöksperson; 1, 2, 3, 4, 5, person; 1, 2, 3, 4, 5, 6 och 7. och 7. SCD-kvoten 18:1/18:0 i Resultaten visar på stor variation fraktionen TG i provet var signifikant av SCD-kvoten 18:1/18:0 hos försöks- sänkt (figur 4), vilket berodde på en högre personerna, vilket gör den mindre lämpad som mängd 18:0 och en lägre mängd 18:1 markör för uppskattad SCD-aktivitet än (figur 9). SCD-kvot 16:1/16:0. Figur 9. Variation av 18:1 i TG-fraktionen hos försöksperson; 1, 2, 3, 4, 5,6 och 7. SCD-kvoten 18:1/18:0 i fraktionen TG i provet var signifikant sänkt (figur 4), vilket berodde på en högre mängd 18:0 (figur 8) och en lägre mängd 18:1. 15

16 DISKUSSION Frågeställningen i den här studien var att undersöka hur SCD-kvoter varierar under dygnet. Tidigare har studier gjorts på provmaterial från Uppsala Longitudinal Study of Adult Men (ULSAM)-kohorten där serumlipider från fasteprover används för att undersöka vilken betydelse SCD-aktiviteten har för risken att utveckla det metabola syndromet och att drabbas av hjärtkärlsjukdomar (7). Det har även gjorts studier på hur insulinkänslighet korrelerar med fettsyrekompositionen i blodet på liknande sätt (8). I denna studie användes istället både fasteprov och prov före respektive efter måltid för att undersöka om fettsyrakvoterna varierar under dygnet beroende på nutritionsstatus. I resultaten för SCD-kvot 16:1/16:0 i de olika fraktionerna var provet i fraktionerna FFA och TG signifikant lägre (figur 3). Att en förändring skulle ske först i fraktionerna FFA och TG är förväntat då dessa lipider är de som först påverkas av kosten. Hos de övriga fraktionerna, PL och CE och för helserum låg nivåerna på fettsyrorna på en mer konstant nivå över dygnet (figur 3). Denna iakttagelse är viktig, då PL och CE är de fraktioner som används vid analys av fettsyrainnehåll i kroppen (t ex vid de studier av prover från ULSAM-kohorten som nämnts tidigare). De fraktioner som skall användas för dessa analyser får ej variera under dygnet för att få jämförbara resultat. Att dessa lipider inte påverkats av kosten under en sådan kort period beror på att lipidernas sammansättning av fettsyror byggs upp under en längre tid. Fettsyrakompositionen i PL och CE ger därmed en bättre indikation på hur fettet i kosten sett ut under en längre tidsperiod. I PL ses förändringar efter ett par dagar medan det i CE kan ses förändringar efter ett par veckor (9). Att förändringen hos FFA och TG syns just i tredje provet beror på att det tar ca 4-6 timmar från det att födan intas till dess att fettet absorberats ifrån tarmen och de mättade fettsyrorna omvandlats till enkelomättade (16:0 till 16:1). Ett lägre värde 16

17 för SCD-kvoten i provet enligt resultaten skulle i sådana fall visa på att SCD-aktiviteten har gått ner, dvs. minskad omvandling av mättade till enkelomättade fettsyror. Detta stämmer dock inte i teorin då SCD-aktiviteten i stället borde öka då det är vid denna tidpunkt som fettsyrorna tagits upp av blodet och förts vidare ut i kroppen efter de tidigare måltiderna frukost och lunch. SCD-aktiviteten borde alltså vara som högst då mättade fettsyror kommit in i blodomloppet. Nedgången i 16:1/16:0 beror antagligen på att 16:1 till största del syntetiseras endogent och endast tillkommer i liten mängd via maten. På så sätt blir det en utspädning av det endogena 16:1 med de övriga fettsyrorna som finns i blodet efter maten. Detta kan till viss del också bero på att fettsyrorna mäts i relativ mängd (%) vilket gör att när någon fettsyra ökar i relativ mängd så kan 16:1 minska procentuellt sett även om den egentligen inte minskar i mängd, vilket leder till en lägre kvot. SCD-kvot 18:1/18:0 i de olika fraktionerna följde ej samma mönster som SCD-kvot 16:1/16:0 vid de olika provtagningstillfällena hos försökspersonerna (figur 3, 4). 18:1 är den vanligaste fettsyran både i fettvävnad och även i maten (3), vilket leder till att endogent syntetiserat 18:1 späds av matens 18:1 till skillnad från 16:1 som bara förekommer i liten mängd i maten och till största del syntetiseras av kroppen själv. Variation över dygnet i SCD-kvot 18:1/18:0 i fraktionen FFA (figur 7) visar även upp ett spritt mönster mellan försökspersonerna. Dessa resultat tyder på att 16:1/16:0 är en bättre markör än 18:1/18:0 för uppskattad SCD-aktivitet. Den mättade fettsyran 16:0 verkar ligga på samma nivå och följa samma mönster hos alla försökspersonerna under dygnet trots skillnader i bland annat ålder, kroppssammansättning och könsfördelning inom gruppen. Detta tyder på att kroppen kan reglera SCD-aktiviteten på ett effektivt sätt så att 16:0 kan hållas på en konstant nivå (figur 5). Det är viktigt för kroppen att hålla 16:0 vid en viss nivå, eftersom det är visat i experimentella studier att 16:0 kan inducera celldöd (10) och stressa det endoplasmatiska retikulet (11). 17

18 SCD-kvoten 18:1/18:0 i fraktionen TG i provet var signifikant sänkt, vilket kan bero på att mängden 18:0 i kosten har ökat (figur 8). Denna ökning skulle kunna bero på mängden mejeriprodukter som intogs vid frukost, där 18:0 är en fettsyra som är vanligt förekommande. Frukosten bestod av både filmjölk och mjukost. Provet togs sedan ca fyra timmar efter frukosten, vilket gör att kostens fettsyraförändring skulle kunna ses i TG fraktionen. Sammanfattningsvis visar resultaten i denna studie att 16:1/16:0-kvoten varierar i både FFA och TG under dygnet. Studien är dock gjord under en kort tidsperiod och med en liten grupp deltagare. Det som skulle kunna göras i en framtida studie är att följa variationer i SCD-kvoten hos en större grupp individer under en längre tid och att även titta på förändringar i kvot förhållande till en utfallsvariabel. Som utfallsvariabel skulle någon metabol variabel kunna väljas, t.ex. insulinnivån. ACKNOWLEDGEMENT Vill tacka Annika Smedman och Eva Warensjö för all handledning och ett väl utformat examensarbete inom ett mycket intressant område. Ett stort tack till Siv Tengblad som tagit hand om mig på laboratoriet och delat med sig av sin kunskap och för alla trevliga fikastunder. Tack även Bengt Vessby för hjälp med tolkning av mina resultat. Till sist vill jag tacka all personal på enheten för klinisk nutrition och metabolism som jag kommit i kontakt med under mitt examensarbete. 18

19 REFERENSER 1. Isomaa B. A major health hazard: the metabolic syndrome. Life Sci 2003;73: Moussavi N, Gavino V, Receveur O. Could the quality of dietary fat, and not just its quantity, be related to risk of obesity? Obesity (Silver Spring) 2008;16: Nakamura MT, Nara TY. Structure, function, and dietary regulation of delta6, delta5, and delta9 desaturases. Annu Rev Nutr 2004;24: Ntambi JM, Miyazaki M. Recent insights into stearoyl-coa desaturase-1. Curr Opin Lipidol 2003;14: Attie AD, Krauss RM, Gray-Keller MP, et al. Relationship between stearoyl-coa desaturase activity and plasma triglycerides in human and mouse hypertriglyceridemia. J Lipid Res 2002;43: Boberg M, Croon LB, Gustafsson IB, Vessby B. Platelet fatty acid composition in relation to fatty acid composition in plasma and to serum lipoprotein lipids in healthy subjects with special reference to the linoleic acid pathway. Clin Sci (Lond) 1985;68: Warensjö E, Riserus U, Vessby B. Fatty acid composition of serum lipids predicts the development of the metabolic syndrome in men. Diabetologia 2005;48: Vessby B, Tengblad S, Lithell H. Insulin sensitivity is related to the fatty acid composition of serum lipids and skeletal muscle phospholipids in 70-year-old men. Diabetologia 1994;37: Nikkari T. Serum fatty acids and coronary heart disease in Finnish populations. Prog Lipid Res 1986;25: Listenberger LL, Ory DS, Schaffer JE. Palmitate-induced apoptosis can occur through a ceramide-independent pathway. J Biol Chem 2001;276:

20 11. Wei Y, Wang D, Pagliassotti MJ. Saturated fatty acid-mediated endoplasmic reticulum stress and apoptosis are augmented by trans-10, cis-12-conjugated linoleic acid in liver cells. Mol Cell Biochem 2007;303: