Produktdokumentation och översättningar är tillgängliga på webbplatsen: PRODUKTBLAD

Transkript

1 Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, CT USA Tel: +1 (203) eller (888) , Fax: +1 (203) Produktdokumentation och översättningar är tillgängliga på webbplatsen: MIA FORA NGS HLA-typningskit För in vitro-diagnostik PRODUKTBLAD INNEHÅLLSFÖRTECKNING Provtagning och Definition av symboler.. 1 beredning... Reagens från katalognummer... 2 Procedur.. 5 Avsedd användning 3 A. Material som förutses... 5 Sammanfattning och förklaring... 3 B. Material som behövs, men inte medföljer... 5 Principer för förfarandet... 3 Användarinstruktioner.. 5 Reagenser... 3 Kvalitetskontroll A. Identifiering... 3 Begränsning av arbetsordningen... B. Varningar och försiktighetsmeddelanden... 3 Specifika prestandaegenskaper.. 13 C. Förvaringsanvisningar... D. Rening eller förbehandling för användning Felsökning.. 14 Begränsade licenser... E. Instabilitetsindikatorer.. 4 Information om tillverkaren Instrumentkrav.. 4 Varumärken som används Definition av symboler Batchkod Katalognummer Temperaturbegränsning Sista förbrukningsdatum Serienummer SN Tillräckligt för <n> tester Försiktigt Konsultera bruksanvisningen Tillverkare Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen Medicinskteknisk anordning för in vitrodiagnostik Europeisk överensstämmelse Innehåller CONT Sida 1 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

2 REAGENSER PER KATALOGNUMMER MIA FORA NGS HLA Mästare Kit Artikelnummer SR bestående av MIA FORA NGS HLA-typning reagenskit (SR ) och kit med magnetiska mikrosfärer (SR ). MIA FORA NGS HLA-typning reagenskit (SR ): a) PCR-reagenser: Består av nio (9) enskilda injektionsflaskor Reagens Produktnummer Påfyllningsvolym Lagring 1 HLA-A PCR-blandning SR HLA-B PCR-blandning SR HLA-C-PCR-blandning SR HLA-DPA1 PCRblandning 4 HLA-DPB1 PCRblandning 5 HLA-DQA1 PCRblandning 6 HLA-DQB1 PCRblandning 7 HLA-DRB1-S PCRblandning 8 HLA-DRB1-L PCRblandning 9 SR SR SR SR SR SR µl -20 till -80 C 24 b) Bibliotek över reagensberedning: Består av tolv (12) enskilda injektionsflaskaer Reagens Produktnummer Påfyllningsvolym Lagring 10 Fragmenteringsenzym SR µl 11 Fragmenteringsbuffert SR µl 12 Stoppbuffert SR µl 13 Enzymblandning för slutreparation SR µl 14 Buffert för slutreparation SR µl 15 A-svans enzym SR µL 16 A-svans buffert SR µl 17 Ligasenzym SR µl 18 2X-ligasbuffert SR µl 19 PCRenzym/buffertblandning SR µl 20 Amplifieringsprimrar SR µl 21 Nukleasfritt vatten SR µl -20 till -80 C 24 c) Adapterplatta (SR ): Beskrivning Artikelnummer Påfyllningsvolym Lagring Index över adapterplattan Tre fyllda kolonner på en 96- hålsplatta SR µl/hål -20 till -80 C Magnetisk sfärsats (SR ): a) Magnetiska mikrosfärer: Bestående av en (1) injektionsflaska Beskrivning Artikelnummer Påfyllningsvolym Lagring Fylld injektionsflaska, Agencourt AMPure XP sfär SR ml 2 till 8 C Sida 2 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

3 AVSEDD ANVÄNDNING MIA FORATM NGS HLA-typningsats är avsedd för förstärkning och sekvensering av HLA-gener HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, - DQA1, -DQB1, - DPA1 och -DPB1 på Illumina NGS sekvenseringsplattformen. MIA FORA-programvaran är avsedd att användas som vägledning för att fastställa HLA-typen från datan som genereras med MIA FORA NGS HLA bibliotekkit. Testet är avsett att användas i ett laboratorium som är kvalificerat för hantering av DNA för amplifiering och sekvensering. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Sekvensbaserad typning av PCR-amplifierade exoner av HLA-gener är ett vanligt laboratorieförfarande. PCR-amplifiering används för att berika riktade sekvenser och efterföljande HLA-typning bestäms för de valda områdena. Andra metoder såsom sekvensspecifik oligonukleotidprob (SSOP), sekvensspecifika primerförlängningsproduktanalyser (SSP) har också använts för att bestämma HLA-typning. MIA FORA NGS HLA-typningssystem är en ny HLA-typningsmetod som utnyttjar möjligheten att fånga alla relevanta delar av HLA-lokusen med PCR med lång räckvidd. Nio PCR huvudblandningar som innehåller alla nödvändiga komponenter för att förstärka varje gen, däribland enzymer, buffertar, dntp er (deoxinukleotidtrifosfater) och primers för PCR-förstärkning med långt omfång finns i satsen. Amplifierad DNA kan sedan bearbetas med hjälp av MIA FORA NGS HLA bibliotekkitet för att generera DNA-bibliotek för sekvensering på Illumina-sekvenseringsplattformen. Satsen tillåter sekvensering av upp till 24 prover på ett multiplexsätt med Illumina sekvenseringsplattformen. PRINCIPER FÖR FÖRFARANDET MIA FORA NGS HLA-typningskit är utformad för att bestämma typning av klass I och klass II HLA-lokus genom att sekvensera hela genen eller de mest informativa exonerna och intronerna. MIA FORA NGS HLA typningskit använder PCR med lång räckvidd för att fånga och berika de huvudsakliga HLA-generna, HLA-A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1 -DPB1 och -DRB1/3/4/5. MIA FORA NGS Biblioteksberedningens reagenskit genererar ett bibliotek från den förstärkta DNA för sekvensering på Illuminasekvenseringsplattformen. MIA FORA NGS HLA-typningsprogramvaran ger sekvensen för relevanta HLA-gener och fasinformation för att uppnå högupplöst HLA-typning. REAGENSER A. Identifiering Se tabellerna i Reagenser enligt katalognummer för en komplett lista över produkter och katalognummer. B. Varnings- och försiktighetsmeddelanden 1. Endast för användning till in vitro-diagnostik inom den Europeiska unionen. 2. Resultaten från dessa kit skall inte användas som enda grund på vilken man fattar ett kliniskt beslut som påverkar patienten. 3. Separata labb eller slutna labbutrymmen bör utses för Pre-PCR-manipulationer samt Post-PCR-manipulationer. 4. Separata pipetter bör användas för Pre-PCR-manipulationer samt Post-PCR-manipulationer. 5. Biorisk: Alla biologiska prover och blodprover ska behandlas som potentiellt smittförande. Använd allmänt vedertagna försiktighetsåtgärder vid hantering. 6. Pipettera aldrig med munnen. Undvik kontakt mellan reagenser och prover med hud och slemhinnor. 7. Kassera använda material i enlighet med institutionens och/eller lokala bestämmelser för hantering av potentiellt biologiskt farligt material. 8. PCR-tekniken är utsatt för kontaminering, särskilt från sin egen produkt. Aerosoler av PCR-amplikoner som genereras under post-pcr-stegen är en vanlig källa till kontaminering. Försiktighet bör därför vidtas för att förhindra överdrivet stänk och alstring av aerosoler. Standard PCR-laboratorieåtgärder som omfattar avtorkning av arbetsytor med nygjort 10 % blekmedel före bearbetning eller beredning av PCR-prover, användning av ultraviolett (UV) ljus i huvar eller biosäkerhetsskåp mellan användningarna, tids- och rumsseparation av pre- och post-pcr-verksamhet, användning av lika delar PCR-reagens, användning av positiva och negativa kontroller, osv., bör också användas under kitets användning. Användning av konsekvent, noggrann teknik i kombination med liberal införlivande och övervakning av kontrollerna kommer att garantera en vaksam, proaktiv strategi för att kontrollera och övervaka PCR-förorening. 9. Laboratorierna bör validera sina egna rengöringsmetoder. 10. Kontamination av reagenser eller prover kan ge felaktiga resultat; därför bör försiktighet iakttas för att undvika kontaminering av produkten under användning. Använd inte förorenade reagenser. 11. Använd satsens vätskor som ingår. Utspädning eller förändring kan generera felaktiga resultat. Blanda inte reagenser mellan olika partier. 12. Använd inte läckande eller omärkta injektionsflaskor. 13. Tidigare frysta prover eller reagenser bör blandas noggrant och sedan centrifugeras efter upptining före testning. Undvika att skapa skum och bubblor i proverna. 14. Håll alla enzymer och masterblandningar på is eller cryoblock (2-8 C) under tining. 15. Säkerställ korrekt provrörstätning före amplifiering för att förhindra avdunstning. 16. På grund av inneboende skillnader i mekanismerna för termocyklernas prestanda, kan variationer i resultaten uppstå när inställda termiska profiler överförs mellan olika märken och modeller av termocyklerns instrument. I vissa fall kan reaktionens specificitet och sensitivitet äventyras, vilket leder till felaktig tolkning och rapportering av data. Alternativa värmecykler och profiler måste valideras av användaren. 17. Inkubationstider eller temperaturer som skiljer sig från de som anges kan ge felaktiga resultat. 18. Avvikelse från de rekommenderade bruksanvisningarna kan resultera i mindre än optimal produktprestanda. Beroende på naturen och svårighetsgraden av avvikelsen i analysen (enskilt prov samt körfel) kan fel och/eller felaktiga resultat kan Sida 3 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

4 förekomma. Till exempel har vi bestämt att användning av otillräcklig/inaktiv sfärrengöring i analysen kan resultera i höga förekomster av indexadapterns misslyckande samtal. 19. Det rekommenderas att utföra gelelektroforesen för analys av HLA-genens amplifieringsprodukter efter storlek. PCRprodukter ska visualiseras med etidiumbromid eller röd gel; andra färgämnen kan visa svaga band. 20. Magnetiska mikrosfärer används i flera steg i protokollet. Det är viktigt att avlägsna etanol innan man fortsätter till elueringssteget utan att tillåta mikrosfärerna torka för mycket. Ytan på de magnetiska mikrosfärerna ska se glasartad ut utan vätska synlig. Lämplig torktid kan bestämmas empiriskt i varje laboratoriemiljö (5-10 minuter). 21. Använd nyutspädd 80 % etanol för varje ren sfär. 22. Efter varje ren sfär finns det en säker stoppunkt där prover eller bibliotek kan förvaras i -20 C i upp till fyra dagar. 23. Skydda PicoGreen -plattorna mot ljus för att undvika blekning. 24. Det är viktigt att fragmenteringsreaktionen inte överstiger 20 minuter och att sfärens rening kan utföras omedelbart för att säkerställa korrekt fragmentering av storleksintervallet. 25. A-svansplattan måste gå direkt till adapterns ligeringssteg. 26. Vid framställning av indexadapterligationsplatta, använd fräscha handskar vid hantering av adapterplattan. Ta försiktigt bort plattans tätning. Kontrollera att alla hål i kolumnerna 1, 2 och 3 innehåller ca 5 µl av lösningen. 27. Det amplifierade biblioteket ska renas inom en timme efter amplifiering. 28. Bibliotekets efteramplifieringssteg bör utföras i ett sekvenseringsrum eller i en AirClean PCR-låda för att undvika kontaminering av indexadapterns ligerade DNA med slutprodukter som innehåller Illumina-klustersekvenser. 29. Inställning för bibliotekskvantifiering med qpcr eller Qubit måste göras i PCR-huv och med färsk spädningsbuffert för qpcr, för att undvika kontaminering. 30. Utför provdenaturering med färsk 0,2 N natriumhydroxid. 31. Utför alla efterkörningar och underhållstvättar samt regelbunden rengöring. C. Förvaringsanvisningar 1. Lagra MIA FORA NGS HLA typningskit vid en temperatur under -20ºC i frys med manuell avfrostning 2. Använd inte komponenter efter deras utgångsdatum. 3. Förvara magnetiska mikrosfärer vid 2 till 8 C. D. Rening eller förbehandling krävs för användning Se "Provtagning och beredning". E. Instabilitetsindikatorer 1. Om salter har fällts ut ur lösningen under transport eller förvaring, återsolubilisera helt före användning genom att vortexa i rumstemperatur (18 till 30 C). INSTRUMENTKRAV 1. Termisk cykler utrustad med ett uppvärmt lock, justerbar ramptider, och ett minimalt termiskt intervall 2 C till 100 C och en noggrannhet på minst +/- 0,5 C. Villkor för termocyklers kan behöva ändras för att optimera profilerna. Veriti termocykler från Applied Biosystems har validerats när de körs i standardläget med ramphastigheten (3,9ºC/sek). 2. Lämplig fluorescerande plattläsare med excitationsfilter ~ 485 nm och emissionsfilter ~ 535 nm för mätning av DNA-koncentration som Victor X2, X3 har validerats. 3. Lämplig metod/anordning för isolering och rening av DNA-fragment av omkring 400 till 500 baspar i storlek. En apparat av en sådan storlek Pippin Prep TM instrument har validerats. 4. Tillvalsvätskans hanteringssystem för halvautomatisk bibliotekskonstruktion. Ett sådant system Biomek 4000 har validerats. 5. Lämplig metod/apparat för bibliotekskvantifiering, t.ex. qpcr eller Qubit. 6. Illumina-sekvenseringsplattformen har validerats. 7. MIA FORA NGS Server och mjukvara: Immucor Artikelnummer SR PROVTAGNING OCH BEREDNING Humant genomiskt DNA kan renas från Helblod och Buffy-coats med en validerad metod som uppfyller kriterierna nedan. DNA som extraherats från blod bevarat i EDTA har testats och visat sig ge förväntade resultat i denna analys. DNA som extraherats från blod som förvarats i heparin kan inte användas i denna analys. Isolerat DNA bör vara i 10 mm Tris-HCl, ph-värde 8,0 till 9,0, eller i nukleasfritt vatten. Om ett kelatbildande medel såsom EDTA är närvarande, bör den slutliga koncentrationen av det kelatbildande medlet inte överskrida 0,5 mm. Slutlig DNA-koncentration bör vara 5 till 15 ng/µl. Absorbansmätningar av DNA-provet vid 260 och 280 nm bör ge ett förhållande på 1,65 till 2,0. DNA kan användas direkt efter isolering, eller lagras vid -20 C i upp till 1 år. Upprepad frysning/upptining bör undvikas eftersom detta kan resultera i DNA-nedbrytning. Minst 50% av genomiska DNA-prover ska ha fragment större än 10 kb för framgångsrik PCR-förstärkning över ett långt område. Sida 4 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

5 PROCEDUR A. Material som tillhandahålls (Se tabellen i Reagenser enligt katalognummer för specifik information PCR-reagenser Reagens för framställning av bibliotek, indexadapterplatta, Ampure Magnetiska mikrosfärer B. Material, reagenser och utrustning som behövs, men inte tillhandahålls Termiska cykler: ABI Veriti termocykler har validerats Magnetiska rack eluering av låga volymer i plattor med 96 hål: Alpaqua Magnum FLX har validerats Magnetställning för magnetisk separation av mikrocentrifugrör: DynaMag-2 Magneten har validerats Bänk topplatta spinnare och mikrocentrifugrör spinnare Pipetter, flerkanalspipetter och spetsar (1-20μL, μL, 1000µL) Självhäftande tätningar för PCR-plattor. Accuseal Självhäftande PCR-film (E & K Scientific katalognummer kat.nr T796150, 4titude kat.nr. 4ti-0500) har validerats 1,5 ml centrifugrör och PCR-bandrör Virvelblandare Hårda halvplattor med full höjd 96-hål halvkantade plattor (E & K Scientific katalognummer EK-75012, 4titude kat.nr. 4ti-0770/C) Platta med 96 hål PP svart, v-botten skorstensstil (E & K Scientific katalognummer 21209, Greiner Bio-One kat.nr ) MicroAmp optisk 96-håls reaktionsplatta (ThermoFisher katalognummer N ) MicroAmp optisk tätningstejp, avancerad häftningreservoarer såsom Accuflow (E & K Scientific kat.nr. T796400, ThermoFisher kat.nr ) Reagensreservoarer Genomskinliga tätningstejpdynor Tätningstejp i aluminium Linspapper Filtrerade (aerosolresistenta) engångspipettspetsar som täcker området 0,1μL till 1000 µl Etanol 200 skyddad molekylär biologisk grad 10 mm Tris-HCl, ph 8,0 100% mellan 20 Natriumhydroxid, 1N Nukleasfritt vatten 1,5% agaros, färgämnesfritt, interna standarder, Pippin PrepTM, 250 bp - 1,5 kb, (Sage Science, CDF1510) PhiX kontroll v3 (Illumina kat # FC ) Reagenser för fluorescerande DNA-koncentrationsbestämning: Quant-iT Picogreen dsdna Analyskit har validerats MiSeq V2 300 cykelsats (Illumina katalognummer MS ) MiniSeq mellangenererande reagenskit 300 cykel (Illumina cat# FC ) Exakt bibliotekskvantifieringsmetod/kit/apparat: både KAPA bibliotekskvantifieringskit och Qubit-fluorimeter har validerats ANVÄNDARINSTRUKTIONER Analys för 24-provskörning kan utföras med manuellt protokoll som beskrivs nedan. Detaljerade manuella protokoll för 8, 16 eller 24 prov och automatiseringsprotokoll för 24 prov med Biomek 4000 finns att beställa av teknisk säljare hos Immucor. ANMÄRKNINGAR: Var mycket försiktig i andelsprocessen. Använd kalibrerade pipetter. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i att reagenset går förlorat och analysen misslyckas. Alla temperaturer måste bibehållas exakt. För de magnetiska mikrosfärerna till rumstemperatur före användning. Den amplifierade produkten kan förvaras i upp till 4 dagar vid -20 C före användning. Den amplifierade produkten kan bara frysas och tinas en gång. Upprepad infrysning och upptining kan leda till nedbrytning av den amplifierade produkten och kan ge dåligt resultat om den används för att generera bibliotek. A. Genomisk DNA-rening Rena genomisk DNA med valfri metod. Kraven för DNA-prov är följande: Genomiska DNA-prov måste extraheras från helblod eller Buffy-coat med användning av en DNA-extraktionsmetod som kan generera DNA med hög molekylvikt. DNA måste spädas i nukleasfritt vatten och förvaras vid -20 C eller lägre. Den slutliga DNA-koncentrationen ska vara mellan 5-15 ng/µl, med alla prover vid liknande koncentrationer. Justera vid behov med nukleasfritt vatten. Minst 50 % av extraherade genomiska DNA-fragment bör vara 10 kb eller större i storlek för framgångsrik lång räckvidd av PCR. Sida 5 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

6 B. DNA-amplifiering (PCR) PCR-inställning 1. Fyll i provets streckkodsfil (en CSV-fil, Windows kommaseparerad fil) med provnamn och tilldelad streckkod som visas i Fig. 1. Figur 1. Provets streckkodsfil exempel 2. Skapa ett projekt i MIA FORA programvaran efter skapande av ett provark med provnamn och streckkoder. Detta projektnamn behövs för sequencerkörnamn. 3. Etikett för tre halva 96-håls PCR-plattor med hårt skal. 4. Förbered en provplatta med 100 µl av genom-dna per hål för varje prov i en koncentration av 5-15 ng/µl utspätt i sterilt vatten. Provplattan bör ordnas i kolumnerna 1, 2 och 3 av en 96-håls platta, såsom visas i provplattan i Figur 2. Hål A1 bör vara 10mM Tris-HCl ph 8,0 negativ kontroll (NTC) som innehåller något DNA, följt av prov 1 I B1, prov 2 I C1 och fortsätt med upp till prov 23 I H3 (Figur 2, PROVPLATTAN). 5. Tina PCR-huvudmixarna (P1-P9), blanda genom inversion eller vortexa snabbt och centrifugera. 6. Centrifugera provplattan från steg 4 i en centrifug med en platthållare i två minuter, för att säkerställa att genomisk DNA finns längst ner i hålet. 7. Dispensera 15 µl av PCR-blandningarna P1-P9 i kolumner 1-9 av de tre halva 96-håls PCR-plattorna med hårt skal så att varje hål i en kolumn har samma PCR-blandning (Fig. 2). 8. Fördela noggrant för att undvika bubblor i PCR huvudblandning. 9. Fördela proverna från provplattan med en multikanalpipett enligt följande (Fig. 2): Kolumn 1 från provplattan: 10 µl av NTC och prover 1-7 i kolumn 1 (A1-H1) i var och en av de nio kolumnerna PCR platta 1. Kolumn 1 från provplattan: 10µL av proverna 8-15 i kolumn 2 (A2-H2) i vart och ett av de nio kolumnerna på PCR-platta 2. Kolumn 1 från provplattan: 10µL av proverna i kolumn 3 (A3-H3) i var och en av de nio kolumner med PCR-platta 3. OBS: prover måste blandas försiktigt för att undvika bubblor i PCR-huvudblandningen som visas i Fig Täta PCR-plattorna med självhäftande PCR-film. Centrifugera kort PCR-plattorna, placera dem i 3 separata termiska cykler och kör MIA FORA HLA_PCR-programmet med uppvärmt lock-inställning, se tabell 1. SÄKERT STOPPSTÄLLE PCR-produkter kan förvaras vid -20ºC upp till 4 dagar tills de är redo för genbalanseringssteget. Sida 6 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

7 Figur 2. Arrangemang av prover och PCR inrättat Tabell 1. Termocyklerns förutsättningar för amplifiering Cykel (1) Cykler (15) Cykler (20) Cykel (1) Ursprunglig håll Denaturering Hybridation Förlängning Denaturering Hybridation Förlängning Slutlig ext. Håll 94 0 C /30s 94 0 C /1:15m 60 0 C /30s 66 0 C /7m30s 94 0 C /30s 60 0 C /30s 66 0 C /7m30s 66 0 C/10 m 4 0 C/ 11. Tillval: Amplifieringen kan verifieras genom att köra några representativa prover på en 0,8 % agarosgel innehållande etidiumbromid eller röd gel. Elektrofores bör utföras vid 90 volt i 40 minuter. PCR-fragmenten kan variera mellan proverna beroende på skillnader i intronerna. De ungefärliga storlekar för PCR-produkterna visas i tabell 2. Tabell 2: Storlekar av amplifieringsprodukter HLA-ställe Storlek (kb) HLA-A 3,2 HLA-B 4,1 HLA-C 4,4 HLA-DPA 5,0 HLA-DPB 5,2 HLA-DQA 5,8 HLA-DQB 6,3 HLA-DRB1 0,9 HLA-DRB2 5,6 C. Balansering och sammanslagning av PCR-produkter Koncentrationen av varje PCR-produkt kan bestämmas med användning av en lämplig fluorescerande DNA-kvantifiering reagens, såsom PicoGreen. Baserat på fluorescensmätningar, blir PCR-produkterna från alla nio PCR-reaktionerna för varje prov balanserade och sammanslagna i enlighet med utsignalen från SironaQuant TM, tillgänglig på MIA FORA NGS HLA-systemet. De grupperade proverna renas sedan i beredning för fragmentering. Sida 7 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

8 Balansera och sammanslå Figur 3. PicoGreen analyskonfiguration 1. Kvantifiera PCR-produkterna med hjälp av PicoGreen -reagensen: För PicoGreen -reagensen till rumstemperatur och späd med 1xTE-buffert (50µL PicoGreen μl 1xTE). Vortexa för att blanda och skydda mot ljus tills det ska användas. Obs! Följ produktbladet för reagenserna om andra reagenser används för PCR kvantifiering. 2. Förbered serieutspädda standarder i mikrocentrifugrör med hjälp av 100 ng/µl kontroll som ingår med PicoGreen -kitet. Dispensera 20 µl av varje standard på PicoGreen -plattan 1 (svarta mätningsplattor) hål A10 -E12 såsom visas i Fig. 3. Överför 20 µl av 1xTE buffert i PicoGreen plattan med 1 hål F10, F11, F12, såsom visas i Fig Tillsätt 20 µl/av utspätt PicoGreen till varje hål i de tre PicoGreen -plattorna, inklusive standardiseringshålen i plattan 1, som visas i Figur Tillsätt 19 µl av 1xTE buffert till tre PicoGreen -plattor i samma format som de tre PCR-plattorna. Tillsätt 1 µl PCRprodukter till de tre PicoGreen -plattorna så att arrangemanget motsvarar de ursprungliga PCR-plattorna för att göra 1:20 utspädningen av PCR-produkterna. Den slutliga volymen är 40μL i alla uppmätta hål. 5. Centrifugera plattan och inkubera i rumstemperatur i minst 5 minuter. Skydda plattorna mot ljus under inkubationen. 6. Mät fluorescensen med filter med excitation ~ 485 nm/emission ~ 535 nm, 0,1s (Victor X3) 7. Spara utdatafilen med följande namnkonvention: (Obs: Windows: använd text med tabulatorbegränsning; MacOS: använd Windows formaterad text). Project_COLUMN1_Date.txt (t.ex. ProjectX_COLUMN1_ txt) Project_COLUMN2_Date.txt (t.ex. ProjectX_COLUMN2_ txt) Project_COLUMN3_Date.txt (t.ex. ProjectX_COLUMN3_ txt) Kör SironaQuant balanseringsprogram i MIA FORA programvara. Det rekommenderade pmol-värdet är mellan 0,0035 till 0,0009 pmol. 8. Centrifugera PCR-plattorna och märk en ny platta för nästa steg som "Projekt_grupperad PCR_datum" 9. Späd PCR-produkter från varje lokus med 10mMTris HCl-buffert ph 8,0 enligt SironaQuant-utgången före sammanslagningen. 10. Konsolidera PCR-produkter från alla 9 PCR-reaktioner för varje prov genom att överföra volymer som anges i SironaQuant-utgången. 11. Täta plattorna och förvara vid -20 C, om inte gå vidare till mikrosfärernas rengöringssteg omedelbart. 12. Ta de magnetiska mikrosfärerna till rumstemperatur och blanda de magnetiska mikrosfärerna genom att vortexa för att resuspendera mikrosfärerna jämnt. 13. Lägg 55 µl mikrosfärer per hål i konsoliderade prover. Blanda DNA och mikrosfärer väl genom att pipettera upp och ner minst 10 gånger. 14. Inkubera DNA sfärblandningen vid rumstemperatur under 10 minuter. Överför plattan till magneten i 5 minuter. 15. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa mikrosfärerna medan plattan är på magneten. 16. Lämna kvar plattan på magneten för etanoltvättstegen. Lägg till 200 μl av nyligen utspädd 80 % etanol i varje hål och inkubera i 30 sekunder och ta sedan försiktigt bort och kasta etanolen. 17. Upprepa etanoltvätten två gånger till (för totalt tre tvättar). Ta bort alla spår av etanol efter den tredje tvättningen. 18. Avlägsna plattan från magneten och låt mikrosfärerna lufttorka. Ytan på de magnetiska sfärerna ska se glasartad ut utan synbara vätskeansamlingar. Den lämpliga torkningstiden kan avgöras empiriskt i varje laboratoriemiljö (5 10 minuter). 19. Lägg till 35 mikroliter av rumstempererat 10mMTris-HCI ph 8,0 till varje hål. Blanda väl genom att pipettera och inkubera i 5 min. 20. Placera plattan på magneten och inkubera i 5 minuter eller tills lösningen är genomskinlig. 21. Med plattan på magneten, överför 30 mikroliter av eluatet till den nya 96-håls PCR-plattan märkt: Projekt_Balancerad_rening_datum. SÄKERT STOPPSTÄLLE Sammanslagna och rengjorda prover kan förvaras vid -20ºC upp till 4 dagar innan de är klara för fragmenteringssteget. Sida 8 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

9 D. Konstruktion av sekvenseringsbiblioteken a. Splittring 1. Ställ en laboratorietimer på 20 minuter före steg Alikvotera 20 ul av stoppbuffert från rör 12 i varje hål i kolumn 11 i den nya 96-håliga plattan märkt som fragmenteringsplatta. 3. Förbered fragmentering av huvudblandningen genom att överföra 134 µl av röret 11 (fragmenteringsbuffert) till rör 10 (fragmenteringsenzym). Blanda noggrant genom att vortexa och centrifugera en kort stund. 4. Pipettera 23 µl av fragmenteringens huvudblandning som framställts i steg 3 i varje hål i kolumn 12 av fragmenteringsplattan för att skapa huvudblandningens reservoar-kolumn. 5. Från kolonn 12, överför man 6 µl av fragmenteringens huvudblandning till varje hål i kolumnerna 1, 2 och 3 av fragmenteringsplattan. 6. Överför 14 µl av provet från kolumn 1 av den grupperade, sfärrengjorda plattan från föregående sektion (Projekt_Balancerad_rensning_datym) till kolumn 1 på fragmenteringsplattan. Blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger. 7. Överför 14 µl av provet från kolumn 2 av den grupperade, sfärrengjorda plattan från föregående sektion (Projekt_Balancerad_rensning_datym) till kolumn 2 på fragmenteringsplattan. Blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger. 8. Överför 14 µl av provet från kolumn 3 av den grupperade, sfärrengjorda plattan från föregående sektion (Projekt_Balancerad_rensning_datym) till kolumn 3 på fragmenteringsplattan. Blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger. 9. STARTA TIMERN och inkubera i rumstemperatur under 20 minuter. Det är avgörande att reaktionen inte överstiger 20 minuter. 10. Efter 20 minuters inkubation, ska du omedelbart överföra 5 µl av STOP-bufferten från kolumn 11 till kolumnerna 1, 2 och 3 och blanda väl genom att pipettera upp och ned 5 gånger efter varje tillsats. 11. Pipettera 200 µl av rumstempererade magnetiska mikrosfärer i varje hål i kolumn 10 av den fragmenterade provplattan eller in i ett rent PCR-remsrör. 12. Från kolonn 10, tillsätt 40 µl av magnetiska mikrosfärer till varje hål i den fragmenterade DNA och blanda långsamt genom att pipettera upp och ner 10 gånger. Inkubera DNA sfärblandningen vid rumstemperatur under 10 minuter. 13. Överför plattan till magneten i 5 minuter för att binda mikrosfärerna till sidorna av hålen och kassera noggrant supernatanten genom att använda en pipett. 14. Lämna kvar plattan på magneten för etanoltvättstegen. Tvätta varje hål med 200 µl av 80 % etanol, inkubera i 30 sekunder, och ta försiktigt bort vätskan med en flerkanalig pipett, utan att störa mikrosfärerna 15. Upprepa etanoltvätten en gång till för totalt två tvättningar. 16. Avlägsna plattan från magneten och lufttorka för att avdunsta överskott av etanol tills pelleten av magnetiska mikrosfärer har ett glasartat utseende. 17. Avlägsna plattan från magneten. Tillsätt 20 mikroliter av rumstempererad 10 mm Tris-HCl-buffert ph 8,0 till mikrosfärerna, blanda genom pipettering, och inkubera i 5 minuter utanför magneten. 18. Placera plattan på magneten och inkubera i 5 min. 19. Överför 15 µl eluat till de nya 96-håls PCR-plattorna med hårt skal etiektterade Projekt_Fragmenterad_Rensning_Datum och försegla plattan. Proverna är nu redo för slutreparationssteget SÄKERT STOPPSTÄLLE De fragmenterade och rengjorda proverna kan förvaras vid -20 C tills de är redo för slutreparationssteget. Det är säkert att lagra väl tillsluten fragmenterad och rensad platta upp till 4 dagar vid -20 C. b. Slutreparation 1. Etikettera om den tidigare fragmenterade och rengjorda plattan som: Projekt Slutreparation Datum 2. Förbered Slutreparationens huvudblandning genom att tillsätta 136 µl av rör 14 (Slutreparationens buffert) till rör 13 (Slutreparationens enzym), vortexa och centrifugera kort. 3. Pipettera 18,5 µl av slutreparationens huvudblandning som framställts i steg 1 till spalt 12 på slutreparationsplattan märkt Projekt_Slutreparation_Datum, för att skapa en reservoar-kolumn 4. Från kolumn 12, överför du 5 µl av slutreparationens huvudblandning til kolumnerna 1, 2 och 3 av balanserad, fragmenterad och renad DNA etiketterad som Projekt_Fragmenterad_Renad_datum från föregående sektion och blanda genom att pipettera 5 gånger. 5. Förslut plattan med självhäftande PCR-film och centrifugera kort för att säkerställa att all vätska är längst ner i hålet. 6. Överför slutreparationsplattan som är märkt Projekt_Slutreparation_Datum till en termocykler och kör MIA FORA slutreparationsprogrammet, som visas i tabell Håll plattan på -20 C tills den är redo för A-svansbildningen. Tabell 3: Termiskt cykelprogram för slutreparation MIA FORA slutreparation 20 C i 30 minuter 70 C i 10 minuter 4 C håll Sida 9 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

10 c. A-svansbildning 1. Förbered A-svansens huvudblandning genom att tillsätta 85 µl av rör 16 (A-svans-buffert) till rör 15 (A-svans-enzym), vortexa och centrifugera kort. 2. Pipettera 12 µl av A-svans masterblandning som framställts i steg 1 till kolumn 11 av den slutreparerade plattan för att skapa en kolumn "reservoar". 3. Från kolumn 11, överför du 3 µl av A-svans huvudblandning till varje hål i kolumnerna 1, 2 och 3 i den slutreparerade plattan märkt som Projekt_Slutreparation_Datum från föregående sektion och blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger. Etikettera om plattan med Projekt A-svans Datum. 4. Placera plattan i termocyklern och kör MIA FORA A-svansprogrammet, såsom visas i tabell GÅ DIREKT TILL INDEXADAPTORNS LIGERINGSSTEG INOM 30 MINUTER. d. Index för adaptorligeringen Tabell 4: Termiskt cykelprogram för A-svansbildning MIA FORA A-svans 37 C i 30 minuter 75 C i 20 minuter 4 C håll 1. Använd fräscha handskar vid hantering av adapterplattan. Centrifugera adapterplattan kort innan du tar bort plattans tätning. Försiktigt bort plattans tätning från adapterplattan. Kontrollera att alla hål i kolumnerna 1, 2 och 3 innehåller cirka 5 µl av lösning. 2. Förbered Ligeringens huvudblandning genom att tillsätta 850 µl från rör 18 (Ligasbuffert) till rör 17 (Ligasenzym), vortexa och centrifugera kort. 3. Pipettera 95 µl av Ligation huvudblandning som framställts i steg 2 kolumn 10 i A-svansplattan märkt som Projekt_Asvans_Datum från föregående sektion för att skapa en "reserv" kolumn. Etikettera om plattan med Projekt Ligation Datum. 4. Från kolumn 10, överför 26 µl av Ligeringens huvudblandning till varje hål i kolumnerna 1, 2 och 3 i A-svansplattan och blanda genom att pipettera upp och ned minst 5 gånger. 5. Överför 2,5 µl av adaptern i motsvarande hål av ligeringsplattan. 6. Blanda väl och försegla plattan med självhäftande PCR-film. Centrifugera kort. 7. Överför ligationsplattan till en termocykler och kör MIA FORA ligationsprogrammet, såsom visas i tabell 5. Tabell 5: Termiskt cykelprogram för adapterligering MIA FORA Ligering 25 C i 30 minuter 65 C i 10 minuter 4 C håll e. Konsolidering av Adaptor-ligerade produkter 1. Kombinera 20 µl från varje hål i Projekt_Ligation_Datum från föregående sektion till ett enkelt 1,5 ml Eppendorf-rör. Märk röret med "Projekt-Datum-Konsoliderat." 2. Tillsätt 865 µl magnetiska mikrosfärer till mikrocentrifugrör märkta som Projekt-Datum-Konsoliderad. Blanda noggrant genom att vortexa. Inkubera i 10 minuter. 3. Överför röret till magnetställningen tills lösningen är klar. Avlägsna och kassera supernatanten. 4. Medan den fortfarande är på magneten, tillsätt 1 ml 80% etanol och inkubera i 30 sekunder. Ta bort 80% etanol utan att störa de bundna mikrosfärerna. 5. Upprepa etanoltvätten (steg 4) för totalt två tvättar. Avlägsna så mycket etanol som möjligt från röret. 6. Ta bort röret från den magnetiska ställningen och tillåta mikrosfärerna lufttorka i 5-10 minuter tills pelleten av magnetiska mikrosfärer har ett glasartat utseende. 7. Resuspendera mikrosfärerna i 63 mikroliter av rumstempererad 10mMTris-HCI ph 8,0. Vortexa och inkubera i 5 minuter. 8. Placera röret på magneten tills lösningen är genomskinlig och överför 60 µl eluat som innehåller rengjorda adapterligeringsprov till ett rent mikrocentrifugrör. SÄKERT STOPPSTÄLLE Grupperade och rengjorda adapterligerade prover (Bibliotek) kan lagras vid -20 C tills man är redo att utföra storleksvalet i upp till 4 dagar. f..vl av storlek och amplifiering av storleken på valt bibliotek (Pippin-beredning) OBS: det amplifierade biblioteket ska renas inom 1 time efter amplifieringen. 1. Utför en urvalsmetod med lämplig storlek på bibliotekets beredning för att isolera fragment av cirka baspar. Följ bruksanvisningen för produkten om du inte använder Pippin-preparatet. 2. Blanda 30 µl av biblioteket med 10 µl av lämplig markör och ladda i ett fält på Pippin-kassetten. 3. Skapa och köra ett program för att välja bibliotek med fragmentstorlek mellan bp. Sida 10 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

11 4. Tina amplieringsmodulerna från bibliotekets beredningskit, rör 19, 20, 21 och montera reaktion i rad med 0,2 ml PCRbandrör enligt följande: Blanda 25 µl förstärkningsblandning från rör 19, 2 µl primers från rör 20, 18 µl nukleasfritt vatten från rör 21 och 5 µl av elueringen av vald storlek. 5. Blanda försiktigt och centrifugera ner. Överför till termocyklern och amplifiera med MIA FORA bibliotek PCR såsom visas i tabell 6. Tabell 6: MIA FORA PCR-bibliotek Cykel (1) Cykler (12) Cykel (1) Ursprunglig håll Denaturering Hybridation Förlängning Slutlig ext. Håll 98 0 C /30s 98 0 C /15s 65 0 C /30s 72 0 C /30 s 72 0 C/5 m 4 0 C/ E. Sekvensering av beredning OBS! Öppna och hantera alla post-amplifieringsstegen i en angiven sektion av laboratoriet, och företrädesvis i en PCR-säkert huv för att förhindra förorening av arbetsytor och sekvenseringsreagenser. 1. Överför det amplifierade biblioteket till ett mikrocentrifugrör. Lägg till 50 µl av rumstempererade magnetiska mikrosfärer till biblioteket. Blanda väl och inkubera i 10 minuter. 2. Efter 10 minuter, placera röret i den magnetiska rörhållaren tills lösningen är genomskinlig, cirka 5-8 min. Avlägsna och kassera supernatanten. 3. Medan den fortfarande är på magneten, tillsätt 200 µl av 80 % etanol och inkubera I 30 sekunder. Ta bort 80 % etanol utan att störa de bundna mikrosfärerna. 4. Upprepa etanoltvätten (steg 3) I totalt 2 tvättningar. Ta bort så mycket etanol som möjligt från röret. 5. Ta bort röret från magnetställningen och låt mikrosfärerna lufttorka I 5-10 minuter tills de magnetiska mikrosfärerna har ett glasartat utseende. 6. Resuspendera mikrosfärerna i 17 µl rumstempererat 10mMTris-HCl ph 8,0. Vortexa och inkubera I 5 minuter. 7. Placera röret på magneten tills lösningen är genomskinlig och överför 15 µl av elutaten som innehåller det renade, amplifierade sekvenseringsbiblioteket I ett rent mikrocentrifugrör. SÄKERT STOPPSTÄLLE Eluerade prov kan lagras i -20ºC i upp till 4 dagar. 8. Bestäm koncentrationen av biblioteket genom metoder som noga mäter DNA-koncentration. Immucor rekommenderar antingen qpcr- eller Qubit-metoder för att uppskatta bibliotekets koncentration. 9. På grund av sequencertypen måste det amplifierade biblioteket ha en koncentration på minst 10 nm. Storleksfördelningen av biblioteket kan bestämmas genom användning av agarosgelelektrofores eller kapillärelektroforessystem för att kontrollera storleken på de resulterande biblioteken. 10. Späd biblioteket till 4 nm och bered ett 8 pm (Qubit) eller 12 pm (qpcr) slutligt denaturerat bibliotek för MiSeq, samt 1,3 pm (Qubit) slutligt denaturerat bibliotek för MiniSeq. Biblioteket kan spetsas med 5% PhiX-kontroll om så önskas. 11. Ladda det denaturerade biblioteket på kassett och kör på de sekvenseringsverktyget. 12. Följ Illuminas instruktioner för sekvensering av biblioteket. Se till att filnamnet i provarket överensstämmer med projektnamnet som genererats under inställning för långa räckvidd PCR. F. Dataanalys Fastq-filer som genererats av sekvenseringsinstrumentet analyseras med MIA FORA-programvaran för att generera HLAtypning. Provarket med provets namn och streckkoder, och motsvarande fastq-filer ska laddas i projektfilen i MIA FORAprogramvaran. För användning av MIA FORA-programvaran, följ programvarans användarhandbok. Sida 11 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

12 RESULTAT 1. PCR-amplifiering: Agarosgelanalysen ska inte visa någon produkt med negativ (NTC) kontroll för att körningen ska vara giltig. Agarosgel av amplifierade produkter kan visa variationer i storlek beroende på skillnader i intronsekvenserna. Se tabell 2 för ungefärlig bandstorlek. 2. Bibliotekets beredning: Bibliotek-kitet ska generera ett bibliotek när ingångs DNA-nivån i SironaQuant är mellan 0,0009 och 0,0035 pmol. Den slutliga koncentrationen av biblioteket bör vara minst 10 nm, och bör noggrant kvantifieras före sekvensering. Biblioteken bör spädas till 4 nm före denaturering. Kluster på MiSeq och MiniSeq kit kan variera beroende på kvantifieringens precision. Normalt varierar klustertätheter på 8-12 pm-bibliotek från K/mm 2 på MiSeq och K/mm 2 på MiniSeq. Försiktighet måste iakttas för att exakt kvantifiera biblioteket. Alla post-adapter ligerade produkter måste finnas i en PCR-huv eller anvisad plats och färska utspädningsreagenser måste vara beredda att förhindra kontaminering. 3. HLA-typningen genereras av MIA FORA NGS mjukvaran och tillhandahålls i en rapport. Följ MIA FORA programvarans användarhandbok för HLA-typningens dataanalys. KVALITETSKONTROLL Det krävs att en negativ kontroll och en valfri känd kontroll körs med varje test, såsom ett vattenämne respektive ett tidigare typningsbestämt prov. Extrem försiktighet måste användas när du tar bort plattans tätningar och plattorna måste centrifugeras ned innan öppning. Nya platttätningar måste användas vid varje steg där plattorna måste tätas. De använda pipettspetsarna bör placeras i lämpliga behållare och kasseras. PCR-inställningen måste utföras i ett Pre-PCR-rum separat från platsen där de förstärkta produkterna hanteras. All genomisk DNA måste spädas i nukleasfritt vatten. Efter DNA-storlekens val och amplifiering, måste det amplifierade biblioteket hanteras i ett separat område, företrädesvis en PCR-huv, och hanteras med en separat uppsättning pipetter. Försiktighet bör vidtas för att inte förorena arbetsområden med amplifierade bibliotek. Analysen bör köras enligt rekommendationen i detta produktblad samt utföras med andra förfaranden för kvalitetskontroll som är i enlighet med lokala, statliga, federala och/eller ackrediteringsorganens krav. EGRÄNSNING AV ARBETSORDNINGEN 1. PCR och analysen som beskrivs i produktbladet kräver noggrant kontrollerade förhållanden. Avvikelser från validerade parametrar kan leda till fel på produkten. 2. Om minst 50 % av de första DNA-fragmenten är mindre än 10 kb, genereras kanske inte tillräckligt med långa PCR-produkter. 3. Om den slutliga bibliotekskoncentrationen ligger under 10 nm genereras kanske inte korrekta sekvenseringsresultat. 4. Tvetydigheter i 4:e fältet kommer att observeras på grund av för litet täckning i intronregionen. 5. Tillsatser i PCR-blandningen kan störa vanligt använda giftfria etidiumbromidalternativ som används i agarosgelelektroforesen och kan leda till en lägre bandintensitet. 6. SYBR grönfläckiga agarosgeler fungerar inte med PCR-produkterna. Etidiumbromid eller GelRed bör användas för visualisering av PCR-produkter. 7. DPB1-primern amplifierar inte exon 1 och exon 5. Därför sekvenseras inte kända polymorfismer i dessa exoner, och de kommer att listas som oklarheter i rapporten. 8. Bristen på genomiska referenssekvenser för DPB1 och låga nivåer av polymorfism i intron 2 (mellan exon 2 och 3) gör det svårt att utföra fasanalyser för heterozygota prover. Därför kan det finnas en genotyptvetydighet som inte kan lösas. 9. De framåtriktade primers för DPB1 överlappar med de första baserna på exon2. Därför kommer inte polymorfismen att identifieras genom sekvensering i dessa sekvenser. 10. DRB-loci amplifieras såsom två fragment - ett som förstärker exon 1 och ett annat som förstärker exoner 2 till 6. Intron 1 har inte amplifierats helt. Därför är avvecklingen av hela lokus inte möjlig för DRB1/3/4/5. Polymorfismer i Intron 1 kommer att leda till tvetydigheter i 4:e fältet. 11. Den omvända primerna för DRB-exonerna 2 till 6 över lappar 3-änden av exon 6, och därför kommer polymorfismen i dessa sekvenser inte att bestämmas genom sekvenseringen. 12. I de flesta fallen kartläggs förstärkningsprodukterna för exon 1 för DRB1/3/4/5 dåligt till exon 1 för de kända referenssekvenserna för DRB5. Därför, genereras de kontig för exon 1 troligen inte för DRB5. Eftersom inga kända exon 1-polymorfismer finns för DRB5, leder det inte till tvetydigheter i HLA-typningen för DRB På grund av den komplicerade karaktären av HLA-typning, ska kvalificerad personal hantera datatolkningen och typningsuppgifterna Sida 12 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

13 SPECIFIKA PRESTANDAEGENSKAPER Kliniska studier utfördes på tre platser för att utvärdera MIA FORA NGS HLA typningskit. Prestandan hos analysen jämfördes med tidigare typningar som inkluderade högupplöst sekvensbaserad typning (SBT) där sådana finns, och typning med lägre upplösning där SBT inte var tillgänglig. Proverna valdes ut av testlokus för att representera ett mångfald av HLA-typer som skulle uppstå under den normala verksamheten. Totalt 206 prover testades genom platserna i 3 körningar vardera med användning av två batcher reagenser. HLA-typningen bestämdes för HLA-A, -B, -C, -DPA1, -DPB1, -DQA1 -DQB1 och -DRB 1/3/4/5 lokus. Totalt alleler utvärderades med dessa 206 prover. Resultaten visade att HLA-typer som erhållits genom MIA FORA-analysen, utan omtestning av misslyckanden och disharmoniska lokus, var överensstämmelsen 99,34%.Efter omtestning av misslyckade lokus och disharmoniska lokus, var den övergripande överensstämmelsen 99,74%. Plats Tabell 8: Sammanfattning av den totala överensstämmelsen Antal Antal Antal alleler Överensstämmelse efter omtest prover testade lokus för analys av överensstämmelse Plats (99,75%) Plats (99,91%) * Plats (99,59%) * Det fanns ingen repeterad testning att göra på den här platsen. En DQB1 lokus hade inte tillräckligt med data. Tabell 9: Sammanfattning av klinisk prövning per lokus HLA-lokus Ursprunglig Överensstämmelse efter omtest** överensstämmelse HLA-A 100,00 % 100,00 % HLA-B 99,76 % 99,76 % HLA-C 99,51 % 100,00 % DPA1 99,72 % 100,00 % DPB1 99,44 % 99,72 % DQA1 99,26 % 100,00 % DQB1 98,48 % 99,27 % DRB1 98,54 % 99,03 % DRB3/4/5 99,43 % 100,00 % Total 99,34 % 99,74 % ** Omtester inkluderade samtal som flaggade för granskning och inte kunde lösas genom manuell inspektion av data. Samtal som inte kan göras på grund av otillräckliga data (11/1854-amplifieringar) testades också om. Obs! För detaljerade specifika egenskaper, ring Immucor Transplant Diagnostics, Inc. på nummer Sida 13 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

14 FELSÖKNING PROBLEM MÖJLIG ORSAK LÖSNING Inga band på gelet efter PCR-amplifiering Multipla band eller bandsmetning efter PCR-amplifiering Fluorescerande värden låga för alla lokus DNA-kvalitet eller - kvantitet Termocyklerns förutsättningar PicoGreen -reagens OD 260/280 förhållande mindre än 1,65 DNA-fragment Minst 50% DNA bör vara större än 10 kb DNA utspädd i Tris-HCl eller TE Låg mall DNA-koncentration Etidiumalternativ som används i agarosgel Amplifieringsbortfall Ramphastigheter Temperatur DNA-kvalitet Fotoblekning av PicoGreen -reagens Felaktig utspädning av reagens Standarder utspädda felaktigt Återrena DNA för att avlägsna föroreningar Extrahera DNA från provet igen Späd ut prover i vatten Se till att DNA-koncentrationen är ng/reaktion Använd etidiumbromid om banden är svaga på agarosgel eftersom vissa fluorescerande färgämnen kan släckas på grund av PCR-blandningens sammansättning Upprepa PCR för amplieringsavhopp med hjälp av överblivna reagenser, av vilka det finns tillräckligt för fyra prover. Överblivna reagenser som lagras vid 2-8 C är stabila i en vecka. Se till att rampvärdena är som anges i protokollet Kalibrera PCR-maskinen för att kontrollera utförandet av PCRmaskiner Se till att DNA utspädes i vatten och är fritt från föroreningar Följ tillverkarens anvisningar noga. Reagenser måste skyddas mot ljus Späd PicoGreen -reagenset enligt instruktionerna Späd ut standarderna enligt instruktionerna DNA-storlekens val är felaktigt qpcr R 2 < 0,95 Det förstärkta bibliotekets koncentration är låg MiSeq Klustring mindre än väntat Kontrollera elueringsprofilen för att se till att elueringen skett utan fel Följ Sage Science felsökningsschema för att avgöra om instrumentprestandan är i enlighet med specifikationerna. Kör 2 mikroliter av 1 kb plus stege (ThermoFisher) med Pippin-instrument Instrumentet är inte kalibrerat punktprotokoll med baspar. Kör 15 mikroliter av eluerad produkt på agarosgel för att visualisera elueringen av 500 bpfragmentet Återanvändning av Pippin-patro Pippin-patronen bör användas endast en gång KAPA-PCR Orsakas av en tydlig avvikelse Upprepa analysen med utelämnade avvikare. Föroreningar i reagenser Upprepa KAPA PCR med färska standarder Etanol inte fullständigt avlägsnat Avlägsna etanol medan plattorna är på magnethållaren. Avlägsna alla spår av etanol, särskilt efter sluttvätten. Mikrosfärerna lagras felaktigt Förvara mikrosfärerna i 2 till 8 C - FÅR EJ FRYSAS Rengöring av Etanol är inte nyberett 80 % etanol bör beredas på nytt före varje användning magnetiska mikrosfärer Torktiden kan bero på omgivningens temperatur och Mikrosfärer som övertorkas luftfuktigheten. Övervaka mikrosfärerna noggrant för att säkerställa att mikrosfärerna inte blir för torra och justera protokollet vid behov Fel koncentration av Tris-HCl används Kontrollera att Tris-HCl-bufferten är 10 mm och ph-värdet är 8,0 Förstärk 1 µl pre-pippin grupperat rent bibliotek med halva mängden reagenser för bibliotekets förstärkning. Kör Kontrollera före och efter eluering om amplifierade produkter (ingen renings behövs) på en 2 % Pippin-preparatet det finns adapter ligerade produkter agarosgel för att bestämma om ett utstryk av fragment är eluerar inte DNA närvarande. Amplifierad produkt som förlorats Omamplifiera 5 5µL av elueringen. Om biblioteket är >25 nm, under sfärens sanering kan produkterna visas genom att köra 5 µl på en agarosgel Fel i fragmenteringen genom ligeringsstegen Bibliotekes kvantifiering är felaktig Illumina-reagenser Fragmenteringsproblem Kapa qpcr Qubit fluorimeter Flödescell, instrument, eller reagensproblem Rena 20 µl av 2-3 ligerade prover och NTC med hjälp av sfärreningsprotokollet med 36 µl mikrosfärer. Eluera produkterna i 10 µl och kontrollera fragmenteringen i en 2% agarosgel. Om fragmentering inte inträffa, kontakta teknisk support för ytterligare felsökningsanvisningar Följ tillverkarens anvisningar med stor uppmärksamhet åt utspädningar, och kontrollera att standardkurvan är korrekt och Ct-värdena ligger inom det linjära området för standardkurvan. Följ tillverkarens anvisningar. Var noga med utspädningen. Använd färska standardutspädningar. Om provet hamnar utanför standardkurvan för reagenser med brett intervall, upprepa med högkänslig analys. Kontakta Illumina teknisk support för att felsöka problem med reagens och instrument Sida 14 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)

15 BEGRÄNSAD LICENS VIKTIGT - LÄS NOGGRANT: Detta märkeslicensavtal ("Avtalet") är det juridiska avtalet mellan dig (hädanefter "Licenstagaren") och Immucor Transplant Diagnostics, Inc. ("Immucor") (individuellt en "parten" eller tillsammans, "parterna"), för användning av reagenser som tillhandahålles häri ("Reagenser"). Genom användning av reagenser, samtycker Licenstagaren till att vara bunden av de villkor som anges häri. 1. Användning av reagenser från Licenstagarens sida. Immucor beviljar Licenstagaren en icke-exklusiv, icke-överförbar rätt att använda endast den överförda mängedn reagenser endast i enlighet med de förfaranden som anges på den bifogade etiketten och med förbehåll för de begränsningar som anges häri. Äganderätten till Reagenserna ska inte överföras till Licenstagaren. Immucor behåller alla rättigheter som inte uttryckligen beviljas häri, och det finns inga underförstådda licenser som beviljas häri. 2. Undantagna användningar. Inget tillstånd beviljas nedan för Licenstagaren för att använda andra reagenser än de som anges under Sektion 1 i detta avtal. Närmare bestämt beviljas inget tillstånd nedan för Licenstagaren för användning av Reagenser för överföring, försäljning, avslöja eller på annat sätt ge tillgång till Reagenser eller Mia Fora-produkten till en tredje part. Licenstagaren skall inte ha rätt att framställa derivat av något reagens eller auktorisera tredje part att använda eller sälja några reagenser eller derivat av reagenser. Licenstagaren erkänner att vissa reagenser och deras användning är föremål för tredje parts patent och är licensierade av Immucor. Licenstagaren skall inte använda reagenserna utom då så uttryckligen tillåts häri. 3. Missbruk av reagenserna och villkor för skadeersättning. I den utsträckning som lagen tillåter, kommer Licenstagaren att försvara, gottgöra och hålla Immucor, Immucor smedlemsförbund, deras chefer, direktörer, tjänstemän, anställda, sponsorer, och agenter (tillsammans de "skadeslösa parterna") fria från allt ansvar, förluster, skador, anspråk eller kostnader, inklusive advokatkostnader, (med en term kallat "skadesfrihet från förluster") som uppstår ur eller i samband med detta avtal, inklusive, utan begränsning till ersättning för förluster till följd av användning av eller på uppdrag av Licenstagaren. Licenstagaren kommer att gottgöra och hålla de Skadeslösa parterna fria från alla skadestånd för förluster som uppstår ur eller i samband med Licenstagarens brott mot detta avtal; och krav från en tredje part då Licenstagaren eller Licenstagarens användning av reagenserna strider mot eller kränker patent, upphovsrätt, varumärke, affärshemlighet eller andra immateriella rättigheter för sådan tredje part. 4. Detta avtal gäller endast reagenserna. All användning av Mia Fora programvaran är föremål för det tillämpliga slutanvändaravtalet. Detta avtal skall tolkas och verkställas i enlighet med lagarna i delstaten New York i USA. Om köparen inte är beredd att acceptera villkoren i detta avtal, är Immucor villig att acceptera produktens återlämning. INFORMATION OM TILLVERKAREN Tillverkad av: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ USA. Telefon: +1 (908) , Fax: +1 (908) Auktoriserad representant: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse Dreieich, TYSKLAND Telefon: , Fax: Europeisk teknisk service: Telefon: +32 (0) Detta dokument reviderades och utfärdades senast: Rev 2, 03 november 2016 VARUMÄRKEN SOM ANVÄNDS MIA FORA och SIRONAQUANT är varumärken tillhörande Sirona Genomics, Inc. Agencourt och Ampure är registrerade varumärken som tillhör Beckman Coulter, Inc. Alla andra varumärken tillhör sina respektive ägare. Sida 15 av 15 LC1618CESV.2 (11/16)