Elin Lindström, Matilda Moritz, Sandra Jansson

Transkript

1 Elin Lindström, Matilda Moritz, Sandra Jansson Tentamensuppgift Aggregering av amyloidfibriller kan orsaka Alzheimers och likanade sjukdomar. I detta försök har man studerat hur proteinet Barstar bildar protofibriller med två olika metoder. Dels har man studerat inducering av den kemiska detergenten TFE (trifluoretanol), dels upphettning av proteinet. Båda detergenterna ger bildning av protofibriller men via olika vägar och med olika slutstrukturer. a) Vilken metod har använts i Fig 1? Beskriv kort en annan tillämpning av metoden. b) Med hjälp av Fig 2, vad är skillnaden mellan de olika protofibrillernas? c) Hur tolkar du skillnaden mellan de värmeinducerade och TFE-inducerade protofibrillerna i Fig 1 c? d) Vad kan du säga sammantaget om fibrillbildningen genom att tolka Fig 1 och 2 gemensamt? FIGURE 1: Images of TFE-induced and heat-induced protofibrils. (A) TFEinduced protofibrils. (B) Heat-induced protofibrils. The insets in panels A and B showmagnified amplitude images to illustrate the beaded appearance of the protofibrils. The scale bars in the insets represent 120 nm. (C) Height distributions of the TFE-induced (black bars) and heat-induced (gray bars) protofibrils. The solid lines represent fits to a Gaussian equation. FIGURE 2: Structural characterization of TFE-induced and heatinduced protofibrils. (A) FTIR spectrum of TFE-induced protofibrils. (B) FTIR spectrum of heatinduced protofibrils. Ett IR-diagram som visar vid vilka vågtal man finner β-aggregat behövs. Svar:

2 Elin Lindström, Matilda Moritz, Sandra Jansson a) AFM- Atomic Force Microscopy. I figuren har man använt AFM som en ytmikroskopi där man genom att låta proben vandra över ytan får en uppfattning om ytstrukturers tjocklek. En alternativ användning av AFM är att förankra proben i proteiner/molekyler på ytan och mäta kraften som krävs för att dra ut eller komprimera molekylen/proteinet. b) De värmeinducerade är högre/tjockare än de TFE-inducerade. c) Båda består främst av β-flak med tanke på den högsta toppen i IR-spektrat. Den värmeinducerande har också random coil- och helixstruktur visar topparna vid 1650 och 1540 cm -1 d) Figur 2 visar huvudsaklig β-sheetstruktur, figur 1 visar att de värmeinducerade protofibrillerna är mer än dubbelt så tjocka. Sammantaget kan man tänka sig att de TFE-inducerade protofibrillerna bildar monolayer β-sheets och att de värmeinducerade vildar bilayer β-sheets; alternativt att de värmeinducerade protofibrillerna bildar tjockare fibriller p.g.a. inslagen av α-helix och random coil.

3 Alejandro Gómez/ Malin Hammerman Proteinernas aggregeringsförmåga har alltid varit av stort intresse för att förstå hur strukturella determinanter kan påverka proteinernas slutgiltiga biologiska funktion. Dessutom har man påvisat att rent fenomenologiskt är bildning av olika proteinaggregat i själva verket den gemensamma nämnaren bakom en lång rad olika sjukdomstillstånd av varierande etiologi. En ökad insikt i mekanismerna bakom Alzheimers sjukdom, för att bara ta ett exempel, har visat hur bildning av så kallade amyloida fibriller kan vara av betydelse för sjukdomens förlopp och eventuell utkomst. Därför är studien av de strukturella och mekanistiska grunderna för bildning av amyloida fibriller ett oerhört aktuellt forskningsområde. Barstar är ett litet protein som i närvaro av vissa lösningsmedel eller vid höga temperaturer kan aggregera och bilda amyloida protofibriller. Dessa protofibriller kan se olika ut både i sin struktur och aggregeringskinetik. Figuren nedan visar två sådana protofibriller som blivit inducerade antigen genom värme (60 0 ) eller genom att tillsätta trifluoretanol (TFE). I figur 1D har fluoroforen Thioflavin (ThT) används för att monitorera denaturering under alkaliska förhållanden (ph8). ThtT fluorescerar bäst när den är inbunden till protofibriller. Time (min) Figur 1: I figurerna A och B visas spektra för TFE- inducerade respektive värmeinducerade protofibriller. I figurerna C och D motsvarar den streckade linjen kurvan för TFE -inducerade protofibriller medan kurvan för värmeinducerade protofibriller anges i form av punkter.

4 Figur 2: Figuren A visar TFE-inducerade protofibriller medan figuren B visar värmeinducerade protofibriller. För figuren C gäller att TFE-inducerade protofibriller motsvaras av de svarta staplarna medan värmeinducerade motsvaras av de grå. Frågor: 1) Vilka metoder har använts i detta försök och vad mäter man i varje fall? Vilka är enheterna på x-axeln i figur 1 A, B och C? 2) Vilka slutsatser om protofibrillernas struktur kan man dra av att jämföra figurerna 1 A, B och C? 3) I figur 1D har båda typerna av protofibrillerna denaturerats genom ph-ändring (ph 8). Vilket aggregat verkar vara stabilast? Motivera genom att koppla ihop figur 1 och 2. Svar 1:

5 De metoder som använts I studien är Atomic force microscopy (AFM), IR (infrared)- spektroskopi, CD (cirkulär dikroism)-spektroskopi och fluorescens. AFM - I denna studie har man gjort en scanning av provet med hjälp av AFM (ej inbindningsstudie). Man mäter höjdskillnader i provet. IR-spektroskopi - I IR-spektroskopi mäts absorbansen i IR-området vilket motsvarar vibrationella övergångar i proteinets grundtillstånd. Vibrationsabsorptionsband uppkommer från övergångar som finns i molekylen, ex C=O streching, C-H streching, amidbindningar mm. Man kan alltså se olika bindningar (som ingår i peptidbindningarna) i proteinet vilket kan ge information om dess sekundärstruktur. IR-spektroskopi är uppdelad i två områden, amide I ( cm -1 ) och amide II ( cm -1 ), och i denna studie har man studerat proteinet i båda områdena. I CD-spektroskopi mäts absorbansskillnaden mellan höger- och vänstervridet ljus hos ett protein som är kiral, dvs har optisk aktivitet. I studien används våglängder som finns i Far- UV-området dvs nm. Vid dessa våglängder absorberar peptidbindningarna ljus vilket ger information om deras sekundärstrukturinnehåll. I fluorescens experimentet är det fluoroforens (thioflavins) intensitet som mäts. En fluorofor är en molekyl som avger ljus av en viss våglängd vid deexcitation. Man kan använda sig av interna eller externa fluoreforer. Enheterna på x-axlarna för A och B ska vara vågtal (cm -1) ) och för C anges x-axeln som våglängd (nm). Svar 2: Protofibrillen inducerad av TFE verkar bestå av mer betaflak i jämförelse med den värmeinducerade protofibrillen eftersom den ligger nära den karaktäristiska betadippen på 216 nm. CD-spektrumet för den värmeinducerade protofibrillen har en förskjutning av minimum punkten ifrån en ren beta-struktur (216 nm) och en mindre ellipticitet vilket tyder på att protofibrillen har en mer blandad struktur. Detta kan ses i IR-spektrumet där fler toppar syns i amide I området i jämförelse med den enda toppen i TFE inducerade protofibrillens spektrum. Svar 3: Den värmeinducerade protofibrillen är stabilast. TFE- inducerade protofibrillens fluorescensintensitet går ner i signal snabbast av de två protofibrillerna vilket tyder på att TFE inducerade protofibrillen denaturerar fortare. Vid denaturering kan inte fluoroforen binda till protofibrillen utan släpps ut i lösningen där den quenchas av lösningsmedelsmolekyler och deexciteras innan den hinner avge ljus. Vid jämförelse mellan figur 1 och 2 kan man uttyda att den värmeinducerade protofibrillen verkar kännetecknas av ett mer blandat sekundärstrukturinnehåll. Dessutom visar AFMbilderna att den har en mer kompakt och tjockare struktur än den TFE inducerade protofibrillen vilket kan ligga till grund för stabilitetsskillnaden.

6 Robert Gustafsson Tomas Mårtensson Jesper Lundgren Proteinet S100A2 är en tumörsupressor vilken inverkar på en cells livsspann. Genom inbindandet av Zn 2+ och Ca 2+ påverkas dess stabilitet och därigenom dess aktivitet, Proteinet har 2 bindningssite för Zn 2+ och 2 bindningssite för Ca 2+. Genom mutationer i proteinet har man åstadkommit C2S vilken saknar ett bindningssite för Zn 2+ och ΔCys vilken saknar bägge bindningssite för Zn 2+. I ett försök har man fått figur Vilken metod har man använt sig av för den erhållna grafen? Beskriv 2 tillämpningar metoden har på biomolekyler. 2. Vad kan sägas om proteinets egenskaper? Jämför speciellt A och B nedan. Motivera ditt svar.

7 Robert Gustafsson Tomas Mårtensson Jesper Lundgren Tumörsupressorn S100A2 innehåller 2 aktiva bindningssite för Ca 2+ respektive 2 för Zn 2+. För att undersöka metalljonernas påverkan på proteinets struktur så klonades 2 mutanter av S100A2 fram, CS2 och ΔCys. CS2 saknar ett av Zn 2+ siten medan ΔCys inte har något Zn 2+ site alls. Figur 2 visar genom CD-spektra hur proteinet förändras vid kemisk denaturering. I figur 3 och 4 används FT-IR för att åskådliggöra förändring vid denaturering med värme av S100A2-ΔCys. I figur 3 visas mutanten utan tillsatt Ca 2+ (apo) och i figur 4 samma mutant med tillsatt Ca 2+. I figur 3 respektive 4 härrör toppar vid 1530cm -1 från random coil, 1622 cm -1 från β- struktur samt 1552 cm -1 och 1651 cm -1 från α-struktur. Pilarna visar förändringen vid ökad koncentration urea respektive temperatur. i. Finns det någon skillnad mellan kemisk och termisk denaturering? Jämför figur 2 och 3. ii. Vilket av tillstånden i figur 3 och figur 4 är stabilast? Motivera.

8 Robert Gustafsson Tomas Mårtensson Jesper Lundgren Svar fråga 1: 1. Man har använt sig av CDspektra. Tillämpningar: Strukturuppskattning, proteininteraktioner, ligandbindning, folding/unfolding, enantiomerer, racemisering, (analys för patentering, experimentella överväganden). 2. Negativa lokala minima i ellipticitet vid 208- och 222nm --> α-helix-innehåll. Visst beroende av [Zn 2+ ] och [Ca 2+ ] kan skönjas. Svar fråga 2: i. Vid kemisk denaturering övergår α-struktur till random coil vid ökning av koncentrationen av Urea. Däremot vid termisk denaturering så minskar α-strukturen medan β-strukturen och random coil ökar vid höjning av temperaturen. För full poäng på detta svar behövs mer detaljer om hur man kan se att detta sker, för båda metoderna! ii. Vid tillsättning av Ca 2+ ökar stabiliteten eftersom förändring av strukturen sker vid högre temperatur. Det kan vara lite svårt att se direkt ur dessa diagram, ett unfoldingdiagram skulle behövas för att komplettera denna fråga.

9 Tentamensuppgift p53 är ett tetramert multidomänkomplex som har flera funktioner i cellen, bland annat att inducera apoptos (celldöd) eller stoppa celldelningen. Man har nyligen upptäckt att ASPPproteiner regulerar apoptos som sker via p53. I detta forskningsarbete studerades N- terminalen av ASPP2. Anledningen är att denna spelar stor roll för aktiviteten hos proteinet, en mindre förekommande variant, som saknar de 123 aminosyrorna i N-terminalen, finns också naturligt. Hos denna variant av ASPP2 är förmågan att regulera p53 borta, dessutom befinner den sig då inte längre i cytoplasman, utan i cellkärnan. Mätningen i fig (a) görs vid 350nm, de två kurvorna i figur (b) härstammar från 350nm respektive 360nm. Fråga (I): Vilka metoder har använts i figur (a) och (b)? Fråga (II): Vad händer med residualkurvan i figur (a) om den matematiska modellen/funktionen ändras? Varför gör man en residualkurva och inte enbart ett värde på residualen? Fråga (III): Utifrån figur (b), svara på vad som händer när ASPP2 värmedenatureras. Varför ser kurvan ut som den gör? Svar (I): (a): AUC, Analytisk Ultracentrifugering. (b): Temperaturberoende flourescensspektroskopi. Svar (II): Om man byter ut den matematiska modellen kommer residualkurvan självklart också att ändras, residualen visar i Y-led skillnaden mellan mätvärde och funktion. En dåligt överensstämmande matematisk modell ger på sina ställen höga värden på residualkurvan. Att bara ge ett värde på residualen visar inte hur modellen lokalt stämmer överens med mätvärdena, om modellen skulle ha ett för lågt värde på ett ställe och ett för högt värde på ett annat så ses troligen inte detta i ett värde på residualen. Gör man en residualkurva ser man helt enkelt tydligare hur bra den matematiska modellen passar till rådata. Svar (III): I likhet med ANS-fluorescens så quenchas trp så länge den ligger på utsidan av proteinet och är i kontakt med lösningsmedlet. När proteinet går mot denaturering skapas ett Molten Globule-steg där trp hamnar inåt i proteinet => skyddas från quenching => fluorescensen ökar.

10 Fråga 1: Calmodulin, CaM, är ett protein med fyra Ca 2+ bindande sites. Vid inbindning sker konformationsändring till olika grad hos CaM. Vid olika konformationer binder CaM in olika ligander, ofta Ca 2+ beroende målproteiner och proteinsekvenser. Två CaM bindande proteiner skmlck, skeletal muscle Myosin light chain Kinase, och CaMKK, Calmodulin dependent Kinase Kinase, användes vid en undersökning och följande data erhölls (se fig. nedan) a:vad är detta för metod och beskriv enkelt hur den går till, och nämn två användningsområden för metoden? b: Vad händer vid de olika topparna i mätdiagrammen? c: skmlck binder CaM starkare än CaMKK. Hur kan man se det i diagrammet?

11 Svar 1: a: Metoden som använts är AFM. Ett prov fästs vid en platta, till provet fästs även en hävstång. Med hävstången kan man dra i provet och känna av motståndet provet ger vid töjning. Används för att scanna en yta på molekylär nivå, undersöka interna molekylära krafter hos proteiner. Används även för att studera styrkan hos ligandbindning och proteininteraktioner, man kan även studera membraninteraktioner. Preparativa och manipulativa processer av enstaka molekyler i enstaka celler möjliga. b: I figur C tyder första toppen att CaM två domäner släpper från varandra och genomgår konformationsändring. Vid andra toppen börjar första domänet släppa liganden vilket gör att andra domänet kan släppa liganden (3:e toppen) lättare. I figur D tyder första toppen även här att de båda domänerna släpper från varandra. Vid andra toppen släpper första domänet från liganden men detta medför inte att det blir lättare för andra domänet att släppa liganden vilket den gör vi tredje toppen. c: I figur C ser man på diagrammet att en större kraft krävs vid första toppen än i figur D, då domänerna släpper från varandra. Man kan också se att domän 1 töjs dubbelt så långt jämfört med domän två i fall C när de släpper liganden, detta tyder på en hög kooperativitet (domän 2 släpper lättare när domän 1 har släppt). I fall D töjs domänerna lika mycket när de släpper liganden, vilket tyder på att kooperativiteten är lägre.

12 Du är projektledare för en grupp laboranter som forskar kring en sjukdom som drabbar många människor. En sjukdom där Ryanodine receptorkanalernas (RyR) kalciumpåverkan inte fungerar som den ska. RyR är ett homotetrameriskt receptorprotein där varje domän består av olika subenheter, bland annat Calmodulin (CaM) och FKBP. När Ca 2+ binder till CaM sker omarrangeringar i CaM som gör att hela RyR antingen aktiveras eller inhiberas beroende på vilken koncentration av Ca 2+ som finns närvarande. a. Förklara hur laboranterna experimentellt med hjälp av fluorecens har studerat förhållandet mellan CaM och FKBP. b. Hur kan man i figuren ovan se att CaM binder nära FKBP när det titreras in till proteinkomplexet? Vilken av dessa molekyler är acceptor respektive donator?

13 Laboranterna har gjort rätt i sina mätningar och fått fram ett tydligt diagram men vet inte hur de ska utläsa resultatet. c. Du som projektledare ska hjälpa dem förstå hur CaM är uppbyggt relativt till FKBP. Hjälp dina laboranter att tolka diagrammet om orienteringen av CaMs tre olika domäner i förhållande till FKBP. (Fig 4) Svar a: Man kan med hjälp av inmärkning på två olika molekyler, CaM och FKBP, studera hur de interagerar genom fluorecens. Om de kommer nära varandra så uppstår fluorecens. Kommer de långt ifrån varandra uppstår ingen fluorescens vilket innebär att de inte påverkar varandra. Svar b: Eftersom man observerat fluorescens när CaM binder in betyder det att den binder nära FKBP. För att de ska uppstå fluorescens mellan dem måste de binda tillräckligt nära för att kunna interagera med varandra. Man kan även se att CaM är acceptor eftersom den emitterar som en andra topp i diagrammet. Svar c: Eftersom FRET-effekten är större för N-loben kan man anta att den ligger närmare FKBP än de andra delarna. Hög FRET indikerar bra interaktion mellan fluorescerande molekyler.

14 IFM/Linköpings Universitet Lina Nilsson Biomätteknik Amélie Wallenhammar TFKE37 Stabilization of a β-hairpin in monomeric Alzheimer's amyloid-β peptide inhibits amyloid formation Amylodier är proteiner som aggregerar och bildar plaques. Aggregeringen av amyloida β-peptider i hjärnvävnaden triggar patogenesen av Alzheimers sjukdom. Amyloid-β (Aβ) är en peptid bestående av aminosyror. Affibodyligander är speciella små proteiner framställda för att binda specifikt till targetproteiner. Komplexet som bildas genom interaktioner mellan Aβ och affibodyproteinet Z Aβ bildar en β-harpunkonformation som påminner om fibrillstrukturen som bildar plaques. Z Aβ fungerar som en inhibitor för fortsatt aggregering. 1. Figur A visar mätningar där affibody Z Aβ (A) och en muterad variant Z aβc28s (B) titrerats till amyloid-β-peptid. I figur B har 60x högre koncentration av Z Aβ titrerats in. a) Vilken metod har använts? b) Vad skiljer det övre från det undre diagrammet i respektive figur? c) Vilken affibody har högst affinitet? Motivera! d) Varför var man tvungen att ha högre koncentration av liganden i mätningen i figur B?

15 IFM/Linköpings Universitet Lina Nilsson Biomätteknik Amélie Wallenhammar TFKE37 2. Figur H visar fritt Z Aβ (svart) och Z Aβ i komplex med Aβ (röd). a) Vad har studerats? b) Vad kan man dra för slutsatser om fritt Z Aβ och komplexet utifrån grafen? 3. I figur I har fluorescensen bestämts med hjälp av en extern fluorofor som fluorescerar vid inbinding till aggregerat protein. a) Vad skiljer en extern från en intern fluorofor? Ge exempel på en extern och en intern fluorofor! b) Två kurvor visar komplexet i olika molförhållanden och en kurva visar fritt Aβ. Identifiera kurvorna och motivera hur du kommit fram till resultatet!

16 IFM/Linköpings Universitet Lina Nilsson Biomätteknik Amélie Wallenhammar TFKE37 Svar 1: a) Metoden som används är ITC (Isothermal Titration Calorimetry). b) Övre diagrammet visar hur mycket tillsatt värme q (riktningen ges av tecknet), som krävs för att hålla reaktionscellen vid samma temperatur som referenscellen vid varje dropptillsats i förhållande till tiden i minuter. Undre diagrammet visar skillnaden i värme vid varje dropptillsats delat med den totala ligandkoncentrationen (differential mode). c) Z Aβ (figur A) har högst affinitet eftersom lutningen på kurvan är störst. d) Hög koncentration krävdes för att få ett utslag som var synligt för denna svaga bindning. Om samma koncentration används som i figur A hade utslaget inte varit synligt. Svar 2: a) Termostabiliteten har studerats. b) Komplexet har högre smältpunkt T m och är därför mer stabilt. Jämför T m för komplexet (57 C) med T m för fritt Z Aβ (45 C). Svar 3: a) En intern fluorofor finns redan i proteinet som ska analyseras, t.ex. tryptofan. En extern fluorofor är något som tillsätts och som binder specifikt till proteinet, t.ex. DNSA. En extern fluorofor ger högre fluorescens och emitterar ljus vid en längre våglängd. b) Fluoroforen binder till aggrererat protein. Aβ (blå) aggrererar mest eftersom den inte inhiberas av Z Aβ. Den ljusblå och den röda kurvan visar komplexet mellan Aβ och Z Aβ, men med olika koncentrationer av tillsatt Z Aβ. Ju högre koncentration av Z Aβ desto mindre aggregering av proteinet.röd kurva visar därför komplexet med högst koncentration Z Aβ (1,1 molekvivalenter) och ljusblå komplexet med lägre koncentration Z Aβ (0,5 molekvivalenter).

17 BRCA1 är en gen inblandad i bl.a. DNA-reparation, cellcykelkontroller och transkriptionen. Kvinnor som har en mutation på BRCA1 har 45-60% större risk att utveckla bröstcancer i tidig ålder. BRCA1 har två strukturidentiska BRCT upprepningar på 2x90 aminosyror i C-terminalen. Många av de mutationer som påverkar bröstcancer finns just i denna region. I denna studie har man därför undersökt hur 5 st mutationer (M1775K, P1812A, M1783T, V1809F, V1696L) på BRCT påverkar dess struktur och proteinets funktion. Man undersöker även hur BRCTs funktion och struktur påverkar inbindning till två fosforylerade protein targets, BACH1 och CtIP. Se figurer på nästa sida! a) Hur påverkar mutationerna sekundärstrukturen? Vilken struktur består BRCA1-wt huvudsakligen av? Vilken metod används? b) Para ihop BRCA1-wt och de fem mutationerna med rätt topp/siffra i figur 2. Vilken metod används? c) Är proteinets stabilitet ett bra mått på proteinets bindningsstyrka? Motivera ditt svar! d) Binder BACH1 och CtIP in på samma ställe till BRCA1? Motivera ditt svar!

18 Figur 1 (O) BRCT-wt, ( ) M117K, (+) V1696L, (X) P1812A, (--) M1783T, ( ) V1809F Figur 2 Figur 3

19 SVAR a) Ingen sekundärstrukturförändring alls, se fig 1. β-flak (karakteristiska 2 dipparna lokala minima vid 208 och 222 nm). CD b) 1 = V1809F 2 = M1783T 3 = M1775K 4 = P1812A 5 = V1696L 6 = WT Se T M i tabell, DSC c) Nej, ex har WT och M1783T samma bindningskonstant men helt olika stabilitet (T M ) Här vill jag gärna se en förklaring/motivering till hur man kan se att de har samma bindningskonstant och olika stabilitet! d) Nej, fig 3 visar att mutationen V1696L kan binda in BACH1 men inte CtIP Likadant här: hur ser man detta?

20 Inledning saknas 1. a) Vilken typ av biomätteknisk metod har använts för att få fram diagram A respektive diagram B? b) De båda mätmetoderna (var för sig) ger ett värde på en viktig konstant, vilken? Ange både förkortning och fullständigt namn. c) Vilken övrig information kan mätteknik A respektive B ge dig om ditt prov? d) Varför ger BACH1-P upphov till flera olika linjer i digram A? (BACH1-NP ligger parallellt med referenslinjen) en bättre formulering av frågan vore: Varför har flera mätningar gjorts för BACH1-P? Vad skiljer sig åt mellan mätningarna? B

21 Tabellen hör till diagram A. Svar: a) A: BIAcore, ytplasmonresonans; B: ITC b) K d, dissociationsjämviktskonstanten c) A: k a, k d (hastighetskonstanten för association respektive dissociation); B: ΔH, ΔG, ΔS, n d) Olika koncentrationer på BRCA-BRCT i provet har åstadkommit de olika linjerna. Lite utförligare svar behövs för full poäng!