Specifik bindning är fundamentalt för levande materia. Strukturbiologi beskriver HUR proteiner interagerar med sina ligander - men VARFÖR?

Transkript

1

2 Specifik bindning är fundamentalt för levande materia. Strukturbiologi beskriver HUR proteiner interagerar med sina ligander - men VARFÖR? Spontanitet i kemiska reaktioner i lösning styrs av ändringen i Gibbs fria energi ΔG = ΔH - TΔS som kan relateras till associationskonstanten via ΔG = -RT ln K A

3 Hur ta reda på drivkrafterna bakom protein-ligandbindning? Beräkna utifrån strukturdata Svårt, stora system, modellberoende Folding-on-binding (protein-dna) Definition av ostrukturerade tillstånd? Mäta energiflödena direkt ;-) -hur mäter vi? -vad ser vi?

4 Vad får vi för information? Ändringar i Gibbs fria energi ger information om spontanitet i reaktionen Entalpiändringar ger information om ändring i bindningsstyrka Entropiändringar ger information om ändringar i systemets ordningsgrad (eller annorlunda uttryckt: hur många tillstånd systemet kan ockupera)

5 Entalpi-ändringar: ΔH app (bindningsenergi) Ändringar i kovalenta bindningar, väte/jonbindningar, hydrofobiska bindningar En stor del av ΔH app härrör från omorganisation av lösningsmedel. Ändringar pga mutationer svåra att bedöma pga energetiskt kompensatoriska effekter (entalpi/entropi kompensation)

6 Entropi-ändringar OBS: ΔS mäts för hela systemet, dvs även för lösningen runtomkring! Främst ändringar i hydratisering: - mer oordning (fler tillåtna tillstånd) i det bundna tillståndet ger ΔS >> 0 - mer ordnat vatten vid ytan, ΔS < 0 och ΔH >> 0 ΔS sänks av sänkt sidokedjerörlighet i bindningssitet (och ökar då rörligheten ökar)

7 Termodynamisk karakterisering innebär att bestämma ΔG, ΔH och ΔS för en reaktion vid en referenstemperatur samt, om möjligt, erhållaδcp för att kunna förutsäga ändringen av tillståndsfunktionerna med temperaturen

8 ΔG = ΔH - TΔS Men både G, H och S är temperaturberoende. Vi definierar värmekapacitiviteten vid konstant tryck, C p : ΔC P = d(δh ) = (kan visas) = T d(δs) dt dt Då kan vi efter integrering av diffekvationerna skriva ΔH(T) ΔH(T ref ) + ΔC P (T-T ref ) ΔS(T) ΔS(T ref ) + ΔC P ln (T-T ref ) om ΔC P förutsätts temperaturoberoende (inte helt sant för proteiner, men gäller inom begränsade temperaturintervall); vi kan också räkna ut ΔG(T).

9 Linjär Van t Hoffs-analys kan ge oss en uppfattning om ΔH och ΔS: ΔG = -RT ln(k eq ) = ΔH TΔS ln(k eq ) = -ΔH/RT + ΔS/R ln(k eq ) = (-ΔH/R)(1/T) + (ΔS/R) y = ax + b

10 Problem med van t Hoff-analys: Linjär van t Hoff-analys förutsätter att ΔΗ, ΔS, ΔG är temperaturoberoende, vilket oftast inte är fallet. Mätningarna kan därför oftast bara utföras i ett begränsat temperaturintervall (inom vilket man kan anta temperaturoberoende uppförande)

11 Van t Hoff entalpier (ΔH vh ) och verkliga entalpiskillnader ΔH app kallar vi den verkliga temperaturberoende ändringen i entalpi (apparent) ΔH vh = ΔH app bara vid two-state utan intermediat och med mycket små ändringar i hydratisering, konformation, eller protonering Om vi kan mäta ΔH app, och det verkliga borde vi kunna mäta andra effekter som påverkar ΔH, t ex skillnader i konformation och/eller dynamik!

12 För direkt mätning finns två tekniker: ITC Isothermal Titration Calorimetry Mäter värmen som åtgår/utgår då en reaktant tillsätts vid konstant temp DSC Differential Scanning Calorimetry Mäter hur mycket värme/ C som krävs för att höja temperaturen på en provlösning jfrt buffertlösning, dvs ΔCp

13 ITC Mätning av värmet, q, per tidsenhet som åtgår eller tillsätts provet för att hålla de två provcellerna vid samma temperatur (dvs den valda T) Provceller: ml Proteinmängden beror på ändringen i värme: typiskt behövs nmol protein, dvs ~µm koncentrationer

14 Vad är q? Varje tillsats ger värme, in eller ut Δ q i,app = q i q i-1 Δq i,app = Δ q i + Δ q i,dil + Δ q i, ns Δq i,app = Δ[Li] bound x V cell x ΔH app Δq i,dil + Δ q i, ns kan bestämmas genom provutspädning i buffert Från det korrigerade resultatet kan ΔH app, K A och n bestämmas genom kurvanpassning.

15 Två vanliga sätt att plotta rådata för anpassning: differential mode, där skillnaden i varje steg noteras delat med totala ligandkoncentrationen, och integral mode, där det ackumulerade värmet noteras.

16 Ändringar i bindingskonstanten ger oss ΔG, men... För att få pålitliga värden behöver vi mäta i ett koncentrationsområde med både fri ligand och komplex: [protein] ~ 1/K A = K D För starka bindningar krävs låg proteinkoncentration, men då får vi också låga q i vilket ger osäkerhet i mätningen För svaga bindningar krävs hög proteinkoncentration, vilket kan ge aggregering och löslighetsproblem

17 Protoneringseffekter ITC är tillräckligt känsligt för att detektera upptag eller release av H + ΔH app beror därför av entalpin för protonering av bufferten, ΔH buffer ΔH app = ΔH bin + nh+ x ΔH buffer Mätningar i olika buffertar krävs för att kunna korrigera för buffertbidraget

18 Applications of calorimetric methods to drug discovery and the study of protein interactions. Weber & Salemme, Curr Op Str Biol 2003

19

20 Exempel 1: Bröstcancermutanters bindning till targetproteiner (Drikos et al., Proteins 2009)

21 Exempel 2. HIV-proteas-inhibitorer Kompetition används för att hamna inom rätt q-område för ITC

22 TMC-126 Acetylpepstatin TMC-126+Ac-pep Ohtaka et al., Protein Science 2002 Ger bra mätning trots stark bindning (KA ~ 10 11! )

23 Olika HIV-1 proteasinhibitorer har olika termodynamiska profiler ΔG=ΔH-TΔS

24 Bindningsfickan ändras i det muterade resistenta proteaset om entalpin blir mindre negativ (om inhibitorn inte kan binda som designats) är det viktigt att TΔS är fortsatt och kanske tom mer negativt vid bindning (entalpi-entropiväxling). ΔG=ΔH-TΔS

25 Vad krävs för att binda till ett muterat, resistent HIV-1 proteas? De bästa inhibitorerna måste kunna byta ut förlusten i entalpi vid en mutation mot en vinst i entropi pga ökad rörlighet! ΔG=ΔH-TΔS

26 Differential Scanning Calorimetry I en DSC mätning värmer man med konstant hastighet, typiskt K/min, i provcell och referenscell. Om Cp är olika, kommer olika mängd elektricitet (J/s) att behövas för att värma provet till en viss temp. Efter normalisering med uppvärmningshastigheten (K/s) fås ΔCp=C p,prov C p, ref i enheten J/K.

27

28 Ett DSCexperiment!

29 Bestämning av smältpunkt, T m T m

30 Stabilitet hos BRCA-1 mutanter i bröstcancertumörer

31 Vad händer vid ligandbindning?

32 Vad händer här?

33 Ligandbindning påverkar ofta T m och ΔH M och L bildar här ett starkt komplex som är stabilare än de enskilda komponenterna.

34 Bestämning av bindningskonstanter kan göras med hjälp av kurvpassning. The curves from left to right were calculated for K c = 1, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, and M-1 at 298 K.

35 Är kalorimetri en teoretisk mätmetod utan praktisk tillämpning? DSC på blodplasma: friska individer Garbett et al., Experimental and Molecular Pathology 2009

36 Endometrial cancer; amyotrophic lateral sclerosis; lung cancer; ovarian cancer; lyme disease, systemic lupus erythematosus; rheumatoid arthritis; melanoma. These data suggest that each type of cancer or disease may have a characteristic signature thermogram.

37 #P Protein Profiling using Thermofluor -- a High-throughput, Fluorescence based, Thermal Stability Assay P01 - Evolution of HTS: A Critical Analysis - Poster Session Authors: James Kranz, Alexandra Klinger and Matthew Todd, 3-D Pharmaceuticals / Johnson & Johnson Presenter: James Kranz, 3-D Pharmaceuticals / Johnson & Johnson - USA ThermoFluor (TF) is a high throughput protein thermal stability assay developed at 3- Dimensional Pharmaceuticals (currently Johnson & Johnson) that has had powerful implications in drug discovery. This direct, general fluorescence assay is suited for study of compound binding for numerous classes of proteins in HTS, including enzymes, receptors, proteins for which assay development is difficult, and proteins lacking catalytic activity. Here we describe how the 384-well format has provided an efficient means of characterizing the complex effects of solution conditions on a protein stability surface. Rapid solution condition profiling has had applications from protein purification to crystallization, and has allowed for a rational approach in developing effective and relevant conditions for primary screening. TF has also been extremely effective in profiling how compounds collectively perturb the activity of a target protein. Arrayed assays allow for simultaneous testing of many interdependent sample variables, thus streamlining our drug development process. Presented at Society for Biomolecular Screening 2004, September, Orlando. Close X