Slutrapport för anslag: Utveckling av diagnostik för bättre möjlighet till behandlingen vid Malignt Mesoteliom. Diarienr

Transkript

1 Slutrapport för anslag: Utveckling av diagnostik för bättre möjlighet till behandlingen vid Malignt Mesoteliom. Diarienr Uppnådda resultat Med stöd av detta projekt har vi kunnat utveckla diagnostik av malignt mesoteliom (MM) baserat på cytopatologisk undersökning av det exsudat, som ofta är första tecknet på sjukdom och därför utgör det första materialet som är tillgängligt för diagnostik. På begäran av International Mesothelioma Interest Group (IMIG) har vi sammanställt internationella guidelines för denna diagnostik, vilket nu publicerats i flera tidskrifter. Vår modell medger tidigare diagnos jämfört med histologi. Effekten av behandling påverkas då närmast sensationellt. Tidsvinsten jämfört med histologisk diagnostik är endast någon enstaka månad, men medianöverlevnaden ökar med närmare ett år när diagnosen erhålls baserat på exsudatcytologi. Detta skall redovisas på den kommande IMIG-kongressen under året. 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% hist cyt 0,0% Fig. Överlevnad efter kemoterapi bland patienter vars MM diagnosticerats med exsudatcytologi jämfört med de som diagnosticerats med biopsi/histologi. Den tidigare cytologiska diagnosen ökar sannolikheten att tumörcellerna inte utvecklat resistens mot behandlingen. En 3-årsöverlevnad på 40% är sensationell; I de fall där diagnosen är baserad på biopsi är motsvarande överlevnad endast ca 4%. Detta arbete utgör vidareutveckling av fynd gjorda inom projektets ram. Projektets delmoment enligt ansökan: 1. Kan ett optimerat batteri av biomarkörer, baserat på serumanalyser, möjliggöra tidigare diagnostik av MM? Ett antal möjliga nya biomarkörer har identifierats med vår proteomik (syndecan-1, aldo-keto reductase 1B10, apolipoprotein C-I, superoxiddismutas-2, tenascin C, myosin-viib, thrombospondin 1, Galectin-1 och Fibulin-3). De har vägts samman mot tidigare kända markörer för analys av såväl exsudat som serum. Fyra markörer (hyaluronan, mesothelin, osteopontin och syndecan-1) ger tillsammans diagnostisk information vid analys av serum. Av särskilt intresse är här syndecan-1, som när det transporteras till cellkärnan förefaller påverka mesoteliomcellens proliferation. Denna transport kan vara föremål för riktad behandling. Syndecan-1 skulle då inte bara vara en diagnostisk markör, utan också ha prediktiv betydelse. Dessutom reglerar syndecan-1 mesoteliomcellens produktion av angiogenetiska faktorer, vilket i sig också kan ge möjlighet för behandling. Galactecin-1 kan komma att ytterligare

2 komplettera analysen av exsudat. För att inkludera ytterligare markörer i ett kliniskt användbart test måste vi dock utveckla teknologi för simultan analys av multipla markörer, exempelvis Luminexteknik. Den utvecklingen förutsätter dock finansiering med fortsatt externt anslag, då vi inte har ekonomiskt stöd från kliniken. Detta arbete har följt och vidareutvecklat projektet utifrån projektbeskrivningen. 2. Vilka ytterligare MM-specifika biomarkörer kan identifieras och förbättrar dessa testets sensitivitet? Vilka markörer uttrycks tidigt i tumörutvecklingen? De nya markörerna presenteras under punkt 1, ovan. För att få svar på frågorna om tidigdiagnostik behöver vi testa vår serumanalys i en befintlig australiensisk biobank med prover tagna före och tidigt under utvecklingen av MM. För att begränsa åtgången av biobankmaterial måste vi först ha en fungerande analys med Luminexteknologi (se ovan). Vi har inte kunnat bli klara med teknikutvecklingen som planerat; i övrigt har arbetet följt projektet utifrån projektbeskrivningen. 3. Kan metyleringsanalys av promotorregionerna till p16 komplettera vår etablerade FISH för att bättre skilja tidigt stadium av MM från reaktivt mesotel? En förlust av båda generna för supressorgenen p16, beläget i bandet 9p21, ses ofta i MM och anses utgöra en mekanism för utveckling av denna tumör. Vi har med FISH visat att ca 40% av olika MM har kvar båda banden 9p21, också när detta undersöks med kortare prober. I fall med bibehållen p16 gen har vi studerat i vad mån genen är avstängd genom hypermetylering av promotorregionen. Vi kunde då inte visa ökad metylering av denna region. Denna analys av metylering har således inte diagnostiskt värde. Detta arbete har följt projektet utifrån projektbeskrivningen. 4. Kan testning av sensitivitet för en bred panel av cellgifter förutsäga den individuella tumörens behandlingsbarhet och vägleda vid behandlingssvikt? Testning av drogsensitivitet ex vivo har tidigare inte visat tillräcklig specificitet. Orsaker till detta har varit den tillblandning av benigna celler som är oundviklig i kliniskt material och att exponeringstiden av odlingstekniska skäl måste hållas relativt kort (48 timmar). Ett omfattande arbete har lagts ner för att undvika desa störande faktorer. Vi har testat våra cellisolat mot de 6 droger (pemetrexed, carboplatin, gemcitabin, doxorubicin och vinorelbin) som utgör första, andra och tredje linjens behandling av MM; hitintills har celler från 15 MM analyserats. Koncentrationer som skiljer mer och mindre känsliga cellisolat har titrerats. Vid försök att med immunteknik (MACS) öka proportionen tumörceller framgick klart att provets benigna celler påverkades kraftigt, och det på olika sätt från fall till fall.

3 Fig.1 Exsudat där effekten av cellgifter studerats före och efter anrikning av de maligna cellerna. Efter anrikning ibland ökar och ibland minskar känsligheten dvs de benigna cellerna påverkas på ett ej förutsägbart sätt och maskerar den verkliga effekten på tumörcellerna. Detta visar på nödvändigheten av mer tumörcellsspecifik analys. För att specifikt mäta drogers effekt på tumörceller har vi därför nu optimerat en analys med FACS, där uppkomsten av apoptos mäts med annexinv / propidiumjodid. Genom att samtidigt använda tumörspecifika antikroppar (mesothelin, EMA) kan vi bestämma känsligheten för de olika drogerna specifikt för just tumörcellerna. Fig. 2 Tumörcellsspecifik analys av pleuravätska från patient med MM. Cellerna exponerades för carboplatin respektive doxorubicin och analyserades med FACS efter inmärkning med annexin V (x-axeln) och propidiumjodid (PI, y-axeln) samt med EMA som tumörmarkör. Vid apoptos ses först reaktivitet för annexin V och i mer avancerad apoptos även PI. Celler som ej utvecklat denna form av celldöd och fortfarande är viabla återfinns i nedre-vänstra kvadranten. I detta fall är effekten av doxorubicin mer uttalad än för carboplatin Den korta exponeringen (48 timmar) för pemetrexed kan inte spåras som celldöd. Drogen påverkar celldelningen genom arrest i S-fas, och vi kan påvisa och kvantitera den effekten med FACS-baserad analys av cellcykeln (inmärkning med PI efter permeabilisering). En liknande effekt på S-fasen ses ibland också vid exponering för carboplatin.

4 Fig.3 När tumörcellerna exponeras för pemetrexed (P) (och ibland även carboplatin; C) påverkas inte cellernas överlevnad inom 48 timmar. Däremot hindras cellernas proliferation i cellcykelns S-fas, vilket leder till ökad mängd celler i S-fasens tidigare del, samtidigt som toppen för G2/M minskar Detta arbete har följt och vidareutvecklat projektet utifrån projektbeskrivningen. 5. Kan effekt av given behandling korreleras till definierade genskador? Föreligger vid MM sådana genskador som redan idag kan vara mål för riktad behandling? Utrustning för denna analys (NGS) har blivit tillgänglig först denna månad, och detta delmoment har därför inte kunnat genomföras. Genskador som kan kopplas till riktad behandling kommer nu att analyseras i våra isolat av MM. Erhållna genmönster skall då kopplas till resultatet från ex vivo testning av drogsensitivitet enl punkt 4 ovan. Bristen på utrustning har gjort att projektet ännu inte kunnat fullföljas utifrån projektbeskrivningen. Insatser som skett och planeras för att resultatet ska komma till praktisk användning i arbetslivet Malignt mesoteliom är den allvarligaste konsekvensen av yrkesmässig exponering för asbest. Vi visar nu att den diagnostik vi utvecklat förbättrar möjligheterna till behandling av dessa tumörer. Vi har dessutom utvecklat ett test av blodprov, som kan göra det möjligt att upptäcka tumören ännu tidigare hos den asbestexponerade, vilket skulle ytterligare förbättrad möjligheterna till behandling för den drabbade PUBLIKATIONER Darai-Ramqvist E, Nilsonne G, Flores-Staino C, Hjerpe A, Dobra K.: Microenvironment-Dependent Phenotypic Changes in a SCID Mouse Model for Malignant Mesothelioma. Front Oncol Aug 9;3: Mundt F, Nilsonne G, Arslan S, Csürös K, Hillerdal G, Yildirim H, Metintas M, Dobra K, Hjerpe A.: Hyaluronan and N-ERC/mesothelin as key biomarkers in a specific two-step model to predict pleural malignant mesothelioma. PLoS

5 One Aug 21;8(8):e Johansson HJ, Sanchez BC, Mundt F, Forshed J, Kovacs A, Panizza E, Hultin-Rosenberg L, Lundgren B, Martens U, Máthé G, Yakhini Z, Helou K, Krawiec K, Kanter L, Hjerpe A, Stål O, Linderholm BK, Lehtiö J.: Retinoic acid receptor alpha is associated with tamoxifen resistance in breast cancer. Nat Commun. 2013;4: Szulkin A, Nilsonne G, Mundt F, Wasik AM, Souri P, Hjerpe A, Dobra K.: Variation in drug sensitivity of malignant mesothelioma cell lines with substantial effects of selenite and bortezomib, highlights need for individualized therapy. PLoS One Jun 20;8(6):e Mundt F, Heidari-Hamedani G, Nilsonne G, Metintas M, Hjerpe A, Dobra K.: Diagnostic and prognostic value of soluble syndecan-1 in pleural malignancies. Biomed Res Int. 2014;2014: Szatmári T, Dobra K.: The role of syndecan-1 in cellular signaling and its effects on heparan sulfate biosynthesis in mesenchymal tumors. Front Oncol Dec 19;3: Szulkin A, Ötvös R, Hillerdal CO, Celep A, Yousef-Fadhel E, Skribek H, Hjerpe A, Székely L, Dobra K.: Characterization and drug sensitivity profiling of primary malignant mesothelioma cells from pleural effusions. BMC Cancer Sep 24;14: Mundt F, Johansson HJ, Forshed J, Arslan S, Metintas M, Dobra K, Lehtiö J, Hjerpe A.: Proteome screening of pleural effusions identifies galectin 1 as a diagnostic biomarker and highlights several prognostic biomarkers for malignant mesothelioma. Mol Cell Proteomics Mar;13(3): Kovalszky I, Hjerpe A, Dobra K.: Nuclear translocation of heparan sulfate proteoglycans and their functional significance. Biochim Biophys Acta Aug;1840(8): Mundt F, Heidari-Hamedani G, Nilsonne G, Metintas M, Hjerpe A, Dobra K. Diagnostic and prognostic value of soluble syndecan-1 in pleural malignancies. Biomed Res Int. 2014;2014: doi: /2014/ Epub 2014 Jul Heidari-Hamedani G, Vivès RR, Seffouh A, Afratis NA, Oosterhof A, van Kuppevelt TH, Karamanos NK, Metintas M, Hjerpe A, Dobra K, Szatmári T.: Syndecan-1 alters heparan sulfate composition and signaling pathways in malignant mesothelioma. Cell Signal Oct;27(10): Ötvös R, Szulkin A, Hillerdal CO, Celep A, Yousef-Fadhel E, Skribek H, Hjerpe A, Székely L, Dobra K,: Drug sensitivity profiling and molecular characteristics of cells from pleural effusions of patients with lung adenocarcinoma. Genes Cancer Mar;6(3-4): Hjerpe A, Ascoli V, Bedrossian C, Boon M, Creaney J, Davidson B, Dejmek A, Dobra K, Fassina A, Field A, Firat P, Kamei T, Kobayashi T, Michael CW, Önder S, Segal A, Vielh P: Guidelines for cytopathologic diagnosis of epithelioid and mixed type malignant mesothelioma. Complementary statement from the International Mesothelioma Interest Group, also endorsed by the International Academy of Cytology and the Papanicolaou Society of Cytopathology. Cytojournal Nov 30;12:26.

6 14. Szatmári T, Ötvös R, Hjerpe A, Dobra K.: Syndecan-1 in Cancer: Implications for Cell Signaling, Differentiation, and Prognostication. Dis Markers. 2015;2015: Skandalis SS, Dobra K, Götte M, Karousou E, Misra S.: Impact of Extracellular Matrix on Cellular Behavior: A Source of Molecular Targets in Disease. Biomed Res Int. 2015;2015: Hjerpe A, Ascoli V, Bedrossian CW, Boon ME, Creaney J, Davidson B, Dejmek A, Dobra K, Fassina A, Field A, Firat P, Kamei T, Kobayashi T, Michael CW, Önder S, Segal A, Vielh P.: Guidelines for the cytopathologic diagnosis of epithelioid and mixed-type malignant mesothelioma: Complementary Statement from the International Mesothelioma Interest Group, Also Endorsed by the International Academy of Cytology and the Papanicolaou Society of Cytopathology.Diagn Cytopathol Jul;43(7): Erratum in: Diagn Cytopathol Dec;43(12): Hjerpe A, Dobra K.: Comments on the recently published "Guidelines for the cytopathologic diagnosis of epithelioid and mixed-type malignant mesothelioma". Cancer Cytopathol Aug;123(8): Hjerpe A, Ascoli V, Bedrossian CW, Boon ME, Creaney J, Davidson B, Dejmek A, Dobra K, Fassina A, Field A, Firat P, Kamei T, Kobayashi T, Michael CW, Önder S, Segal A, Vielh P.: Guidelines for the Cytopathologic Diagnosis of Epithelioid and Mixed-Type Malignant Mesothelioma: a secondary publication. Cytopathology Jun;26(3): Hjerpe A, Ascoli V, Bedrossian CW, Boon ME, Creaney J, Davidson B, Dejmek A, Dobra K, Fassina A, Field A, Firat P, Kamei T, Kobayashi T, Michael CW, Önder S, Segal A, Vielh P; International Mesothelioma Interest Group; International Academy of Cytology; Papanicolaou Society of Cytopathology.: Guidelines for the cytopathologic diagnosis of epithelioid and mixed-type malignant mesothelioma. Complementary statement from the International Mesothelioma Interest Group, also endorsed by the International Academy of Cytology and the Papanicolaou Society of Cytopathology. Acta Cytol. 2015;59(1):2-16. Erratum in: Acta Cytol. 2015;59(3): Natalja Uhlen, Oscar Grunberg, Hans Jacobsson, Rimma Axelsson, Anders Sundin, Katalin Dobra, Alejandro Sanchez-Crespo och Karl-Gustav Kölbeck: PET/CT with 18F-FDG for diagnosis of pulmonary carcinoid tumors. Clin Nucl Med, in press. Insända, ännu ej accepterade och preliminära manuscript 21. Aslan S, Mundt F, Metintas S, Ak G, Dobra K, Yildirim H, Hjerpe A, Metintas M: Prediction of malignant mesothelioma by analyzing serum hyaluronan, osteopontin, N-ERC/mesothelin C-ERC/mesothelin and syndecan-1. Biomed Res Int. Submitted 22. Szatmari T, Mundt F, Alexeyenko A, Möbus L, Ötvös R, Lehtiö J, Johansson H, Hjerpe H och Dobra K: Molecular targets and signaling pathways regulated by nuclear translocation of syndecan-1. Preliminärt manuskript 23. Heidari-Hamedani G,, Schmalzl A, Szatmári T, Metintas M, Anders Hjerpe A och Dobra K Syndecan-1 alters angiogenesis in malignant mesothelioma. Preliminärt manuskript Avhandlingar och bokkapitel

7 . 24. Mundt F, Dobra K and Hjerpe A: Diagnostic biomarkers in effusion supernatants indicating Malignant Mesothelioma. In: Papanicolaou Society of Cytopathology Monograph Series, Cambridge University Press. In press 25. Szulkin, Adam Characterization of malignant pleural mesothelioma : possibilities for an individualized therapeutic arsenal. Akademisk avhandling, KI Mundt, Filip Malignant pleural mesothelioma : novel biomarkers and related pathways. Akademisk avhandling, KI Zong F, Kovalszky I, Hjerpe A and Dobra K: Structure-function relationship of syndecan-1; with focus on nuclear translocation and tumor cell behaviour; De Gruyter, 2013, ISBN: