Molekylära studier av malignt mesoteliom med syfte att utveckla diagnostik och möjliggöra bättre behandlingsmodaliteter

Transkript

1 Molekylära studier av malignt mesoteliom med syfte att utveckla diagnostik och möjliggöra bättre behandlingsmodaliteter Redovisning av erhållna projektmedel Vårt projekt har under två år erhållit stöd från AFA. Anslaget har möjliggjort att vi nu konsoliderat en forskargrupp med fokus på malignt mesoteliom och med utvecklat kontaktnät inom KIs nätverk för cancerforskning i övrigt. Gruppen har under de två åren publicerat 9 originalartiklar inom området, sänt in ytterligare tre och står i begrepp att sända in ytterligare 4. Som framgår av nedanstående förteckning har arbetet kommit att utgöra en viktig bas för två doktorsavdandlingar, som skrivits av medlemmar i gruppen Redovisningen följer de punkter som givits i ansökningshandlingarna. 1. Karaktäristik av faktorer kopplade till differentiering av MM. a. Syndekanernas betydelse i mesoteliom. Publikationslista nr. 3, 4, 6, 8, 9, 15, 16, 18 Vi har visat att syndekanerna är viktiga för proliferation, migration och prognos vid mesoteliom. Syndecanets extra-och intracellulära domäner griper in i dessa processer på olika sätt och effekterna utövas både på cellens yta och i dess kärna. Fynden indikerar att båda molekylerna kan fungera som diagnostiska biomarkörer och eventuellt som målmolekyler i framtida behandling. b. Kindlinernas betydelse vid mesoteliom. Publikationslista nr. 4, 11, 12 Såväl proliferation som migration av mesoteliomcellen är också beroende av och medieras via kindlin-2, som behövs för integrin β1-medierad adhesion till kollagen typ I. Också detta protein är därför en möjlig målmolekyl för att hindra tillväxt och spridning av mesoteliom. Detta protein uttrycks framför allt i mesoteliomets infiltrationszon och graden av uttryck korrelerar till tumörens prognos 2. Experimentella och mekanistiska studier av nya behandlingsmodaliteter a. Mekanismerna för att framkalla apoptos. Publikationslista nr. 4, 7, 14, 17 Selenit är lovande för behandling av mesoteliom. Drogen utvecklar apoptos med störst effekt i tumörens annars behandlingsresistenta sarkomatoida fenotyp. Apoptosen föregås av förlorad mitokondriell membranpotential. Bax upp-reglerades endast i de sarkomatoida cellerna, medan epitelioida celler nedreglerade Bcl-XL följt av caspase-3 activering. Båda cellinjerna ackumulerade p53, men detta proteins DNA-bindande förmåga inaktiveras av selenit. Däremot föreföll p38 och cathepsin B mediera denna apoptos.

2 Dessutom aktiverar selenit uttrycket av HLA-E, vilket ökar de naturliga mördarcellernas förmåga att angripa mesoteliomcellerna. b. Ytterligare studier; utveckling av ex vivo-tekniker för att bestämma sensitivitet för cytostatika vid malignt mesoteliom. Publikationslista nr. 10 När maligna mesoteliomceller exponeras för cytostatika, som används konventionellt, fås ett mycket varierat svar. Detta gäller även när drogerna kombineras. Tidigare oprövade proteasomhämmare och framför allt selenit (se ovan) har bättre effekt jämfört med dagens behandlingalternativ. Den stora variabiliteten motiverar vidare utveckling av test för bestämning av individuell cytostatikakänslighet ex vivo. I samarbete med doc Lászlo Székely, MTC, KI, försöker vi nu vidareutveckla testet med en robotiserad utrustning som möjliggör samtidig bestämning av 29 olika droger. Arbetet fokuserar på tekniker för att renframställa tumörcellerna inför analysen. I våra korttidskulturer ändras cellernas känslighet betydligt när de tvingas bilda cellkomplex ( sfäroider ) på ett sätt som mer liknar tumörens sätt att växa i patienten. Vi har nu standardiserat denna odlingsteknik för det fortsatta arbetet 3. Utveckling av nya diagnostiska markörer för mesoteliom i exsudat a. Ett analysbatteri optimeras med tolkningsalgoritm för diagnostik av MM. Publikationslista nr. 13 (manuskriptet håller på att sammanställas för publikation) Utrustningen för semiautomatiserad Elisa, har införskaffats inom ramen för detta anslag. Totalt har 7 möjliga biomarkörer (hyaluronan, mesothelin, löslig mesothelinrelaterad peptid /SMRP/, osteopontin, thioredoxin, syndekan-1 och syndekan-2) analyserats i ca 322 exsudat, varav 52 kommer från patienter med mesoteliom. Regressionsanalys har visat att hyaluronan, mesothelin, SMRP, osteopontin och syndekan-2 samtliga har diagnostiskt värde, varvid dock SMRP konkurrerar ut den andra studerade mesotelinepitopen.den tolkningsalgoritm analysen ger identifierar specifikt alla mesoteliom utom ett i själva försöksserien. Den sanna sensitiviteten måste dock värderas i separat serie, För detta ändamål har vi nu erhållit en extern preparatsamling (samarbete med Dr Muzzafer Metinsas, Turkiet) bestående av drygt 400 exsudat och 300 sera, varav 80 av vardera sorten kommer från patienter med mesoteliom. Analysen har påbörjats beräknas vara avslutat under våren. Känsligheten i analyserna tillåter också bestämning av halterna i serum. Studien skall nu utvidgas till sådana analyser, också det baserat på det externa materialet. b. Kan ett högt syndekan-2/syndekan-1 förhållande fungera som immuncytokemiskt kriterium för MM. Publikationslista nr. 13 (manuskriptet håller på att sammanställas för publikation) Mesoteliomceller till skillnad från metastatiskt adenocarcinom utrycker oftare syndekan-2 än syndekan-1. Immuncytokemiskt kan detta visas i ca 80% av mesoteliomfallen och 20% av adenocarcinomen. Syndekaner har relativt snabb omsättning i cellmembranet, vilket förklarar svårigheten att studera obduktionsmaterial. För att utvärdera den diagnostiska betydelsen gentemot övriga immuncytokemiska parametrar analyseras vårt material prospektivt, och slutliga resultat föreligger därför ännu inte.

3 Vid analys av Syndekaner i exsudatvätska ses inte samma skillnad, vilket talar för att tumörcellerna utsöndrar dessa ämnen på olika sätt. Halten av båda syndekanerna var stegrad vid mesoteliom, mest uttalat för Syndekan-2. c. Ytterligare studier: Sökande efter ytterligare markörer med proteomics. Celler från två epitelioida och två sarkomatoida mesoteliomcellslinjer samt två korttidskulturer med benignt mesotel har analyserats (samarbete med Janne Lehtyö vid Proteomics Center, CCK), och en serie deregulerade peptider har påvisats. Arbetet fortsätter med korttidskulturer, där mesoteliomceller jämförs med sådana från lungadenocarcinom. d. Ytterligare studier: Ploidianalys med FISH för att differentiera reaktivt och malignt mesoteliom. Publikationslista nr. 5 FISH-analys med kommersiella prober mot kromosomerna 3, 7 och 17 (centromert) samt 9p21 i samtliga fall kunde skilja samtliga maligna och benigna tillstånd. Analysen är säkrare än någon rutinmässigt använd immuncytokemisk metod. I 10/16 mesoteliom var 9p21 homozygot deleterad, något som kan användas differentialdiagnostiskt gentemot adenocarcinom. Proben för 9p21 binder till ett 200 kb stort fragment. Deletionen är välkänd, men kan ibland vara mindre (>90 kb). Vi har nu börjat syntetisera prober för att detektera även kortare deletioner och studera deras ev diagnostiska användbarhet. En algoritm för sammanvägning av olika biomarkörer har redan tagits i bruk vid diagnostik så att fler fall av mesoteliom kan diagnosticeras specifikt baserat på det första erhållna exsudatet. Projetket kan nu utvecklas vidare till stora delar tack vare ett 3-årsanslag från AFA och studierna fortsätter enligt ansökan för detta nya anslag. Nedanstående manuskript kan om så önskas tillhandahållas i pdf-format Gustav Nilsonnes avhandling finns tillgängliga på KIs web: /, medan Fang Zong s endera dagen blir tillgänglig via Publikationslista Artiklar publicerade Hillerdal G, Sorensen JB, Sundström S, Vikström A and Hjerpe A: Treatment of malignant pleural mesothelioma with liposomized doxorubicine: prolonged time to progression and good survival. A Nordic study. The Clininical Respiratory Journal 2(2), (2008). 2. Hillerdal G, Sorensen JB, Sundström S, Riska H, Vikström A, Hjerpe A: Treatment of Malignant Pleural Mesothelioma with Carboplatin, liposomized Doxorubicin, and Gemcitabine: A phase II study. J Thorac Onc, 2008 Nov;3(11): Hjerpe A and Dobra K: Malignant mesothelioma-a connective tissue tumor with proteoglycan-dependent differentiation. Connect Tissue Res. 49(3): (2008). 4. Dobra K and Hjerpe A: Targeted therapy possible new therapeutic option for malignant mesothelioma? Connect Tissue Res. 4983): (2008).

4 Artiklar publicerade Flores-Staino C, Darai-Ramqvist E, Dobra K, Hjerpe A.Adaptation of a commercial fluorescent in situ hybridization test to the diagnosis of malignant cells in effusions. Lung Cancer. (2009). 6. Fthenou E, Fang F, Zafeiropoulos A, Dobra K, Hjerpe A and Tzanakakis G Chondroitin sulfate A regulates fibrosarcoma cell motility, chemotaxis and adhesion. In vivo, 23(1):69-76 (2009). 7. Nilsonne G, Olm E, Szulkin A, Mundt F, Stein A, Kocic B, Rundlöf AK, Fernandes AP, Björnstedt M, Dobra K. Phenotype-dependent apoptosis signalling in mesothelioma cells after selenite exposure. J Exp Clin Cancer Res. 29;28:92 (2009) 8. Zong F, Fthenou E, Castro J, Péterfia B, Kovalszky I, Szilák L, Tzanakakis G and Dobra K. Effect of Syndecan-1 overexpression on mesenchymal tumor cell proliferation with focus on different functional domains. (2009) Cell Proliferation. 9. Zong F, Fthenou E, Wolmer N, Hollósi P, Kovalszky I, Szilák L, Mogler C, Nilsonne G, Tzanakakis G and Dobra K: The nuclear translocation of syndecan-1 is accompanied by FGF-2 and heparanase, but follows divergent transport route from FGF-Receptor 1. (2009) PLoS one. Insända artiklar 10. Szulkin A, Nilsonne G, Mundt F, Souri P, Hjerpe A and Dobra K. Great variation in sensitivity of malignant mesothelioma cell lines to different anti-cancer drugs and their combinations highlights the need for individualized therapy. Journal of Thoracic Oncology, submitted 11. An Z, Dobra K, Lock JG., Strömblad S, Hjerpe A and Zhang H: Kindlin-2 is expressed in malignant mesotheliomas and is required for tumor cell adhesion and migration. International Journal of Cancer, submitted. 12. An Z, Wang Y, Dobra K, Chiou SLL, Rouhikhorasani P, Hjerpe A, Fang W, Cao Y, Strömblad S, and Zhang H: Zhengwen An 1 *, Yunling Wang 1 *, Katalin Dobra 2 *, Samantha Lee Lin Chiou 3, Pegah Rouhikhorasani 3, Anders Hjerpe 2, Weigang Fang 4, Yihai Cao 3, Staffan Strömblad 1, and Zhang H: A Wnt/β-catenin-paralleling Kindlin-2 signalling pathway controls tumour invasion and metastasis. Nature Medicine, submitted. Manuskript 13. Mundt F, Csürös K, Nilsonne G, Backheden M, Nurminen M, Hino O, Dobra K, Hjerpe A: A battery of biomarkers from pleural effusions for improved diagnosis of malignant pleural mesothelioma Manuskript. 14. Carlsten M, Simonsson M, Nilsonne G, Hammarfjord O, Wallin R, Björkström N, Björnstedt M, Hjerpe A, Ljunggren H-G, Dobra K, Malmberg K-J. Selenite Induce Post-Transcriptional Blockade of HLA-E Expression and Sensitize Tumor Cells to CD94/NKG2A-Positive Natural Killer Cells Manuskript 15. Zong F, Fthenou E, Mundt F, Kovalszky I, Szilák L, Brodin D, Tzanakakis G, Dobra K and Hjerpe A. Specific syndecan-1 domains regulate mesenchymal tumor cell adhesion, motility and migration. Manuskript. 16. Darai-Ramqvist E, Nilsonne G, Hjerpe A and Dobra K: Microenviroment-dependent epithelial transition in xenograft model of malignant mesothelioma. Manuskript. Avhandlingar 17. Nilsonne G. Experimental therapeutics for malignant mesothelioma investigations in vitro. Försvarad vid Karolinska Institutet

5 18. Zong F: Studies on syndecan-1 in mesenchymal tumors. Försvaras vid Karolinska Institutet