Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp, vt 2012

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp, vt 2012 Generation of mutated expression plasmid KRT1 and comparison of HaCaT cells transfected with expression plasmid KRT1 or KRT10 concerning keratin aggregates Jennifer Eriksson Handledare: Hans Törmä, Institutionen för Dermatologi och Venereologi, Akademiska sjukhuset, Uppsala

2 ABSTRACT Introduction The genetic skin disease epidermolytic ichtyosis is caused by mutations in either keratin gene 1 or 10 and leads to blisters and hyperkeratosis of the epidermis. At cellular level the disease is seen as aggregates in the keratin filaments. There is no good treatment available for this disease today, mainly due to lack of reproducible model systems for evaluation of novel drug candidates. In this article we describe how an in vitro model consisting of cells from a stable cell line transfected with expression plasmids to mimic patient cells, may be a possible alternative for screening compounds for therapies. The first step was to generate an expression plasmid required to complete the in vitro model. The model was tested by a preliminary experiment with 4-phenylbuturate (4-PBA) to see if the substance had an effect on the amount of cells with keratin aggregates. Methods The desired 12bp-deletion was incorporated in the wild type keratin 1 plasmid using PCR and primers to generate the expression plasmid. HaCaT cells were transfected with the expression plasmid containing mutated keratin 1. The percentage of cells with keratin aggregates was assessed by fluorescence microscopy. Results/Conclusion Cells containing mutated plasmid had a higher percentage of keratin aggregates compared to cells transfected with wild type plasmid. 4-PBA was found not to affect the amount of cells with keratin aggregates. According to this project the model might be a useful tool for screening compounds, but it needs to be further optimized. KEYWORDS Epidermolytic ichtyosis, keratinocytes, keratinfilaments, keratin gene mutation, 4-PBA FÖRKORTNINGAR EGFP- enhanced green fluorescent protein EI- Epidermolytisk iktyos K- Keratin KRT- Keratingen 4-PBA- 4-fenylbutyrat 2

3 INTRODUKTION Kroppens största organ, huden, är uppbyggd av lagren epidermis, dermis och subcutis. Subcutis sammanfäster huden med ben och muskler, försörjer den med nerver och blodkärl och det är här underhudsfettet finns. Över subcutis finns två lager, stratum papillare och stratum retikulare, som tillsammans bildar dermis. Dermis är ett slitstarkt lager av bindväv innehållande fibroblaster, mastceller, makrofager och leukocyter där även bland annat beröring och smärta registreras av sensoriska nervändar. Över dermis och som kroppens barriär mot omvärlden finns epidermis som delas in i fyra lager, stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum och stratum corneum. Epidermis innehåller mestadels keratinocyter, som prolifierar basalt och differentierar suprabasalt, men även melanocyter, Langerhans celler och Merkelceller. Stratum corneum, hornlagret, består således av döda tillplattade keratinocyter som vandrat dit från stratum basale. I det mänskliga genomet finns bland annat en familj av gener om minst 65 som kodar för intermediära filament, 54 av dessa gener kodar för intermediära filament av typen keratiner. Dessa gener som kodar för keratiner delas även in i två grupper där typ I utgör keratin 9-20 och typ II utgör keratin 1-8. Keratinfilament är fibrösa proteiner som bygger upp keratinocyternas cellskelett genom att bilda ett 10-12nm brett trådlikt nätverk som sträcker sig från cellkärnan och ut i cellens perifera delar och därmed ger cellen dess stabilitet och flexibilitet. Keratinfilamenten i en cell utgörs alltid av keratinpar, där parterna är ett protein av typ I och ett protein av typ II. Paret lindar sig runt varandra och bildar en heterodimer, två heterodimerer kommer sedan bilda en tetramer och två tetramerer bildar ett protofilament. Ett keratinfilament i cellen utgörs sedan av åtta protofilament. Ett exempel på ett keratinpar är keratin 1 (K1) och keratin 10 (K10), som är de keratiner som är genetiskt förändrade vid hudsjukdomen epidermolytisk iktyos (EI), vilket denna studie kommer att handla om. Ibland sker mutationer i keratingenerna och detta kan leda till en rad olika hudsjukdomar, beroende på vilket keratin som blir påverkat [1-2]. Själva keratinfilamenten påverkas på så vis att proteinet kanske aggregerar och keratinocyterna blir mer ömtåliga och kan gå i cytolys [3]. EI eller även kallad Bullous congenital ichthyosiform erythroderma och epidermolytisk hyperkeratos, är en ovanlig hudsjukdom som drabbar ungefär 1 på personer. Sjukdomen nedärvs främst autosomalt dominant men 50% av fallen beror på spontana mutationer och det finns även enstaka fall med autosomalt recessiv nedärvning rapporterade. EI uppstår då det finns en punktmutation, dinukleotidmutation eller deletion i generna för antingen K1 eller K10, och beroende på typ av mutation och lokalisation i genen blir sjukdomen olika svår. Hos ett nyfött barn ses EI som rodnad, blåsor och hyperkeratos på huden och vid milt trauma kan delar av epidermis till och med lossna. Blåsorna uppstår suprabasalt medan de basala keratinocyterna är normala. Eftersom en av hudens viktigaste funktioner är att förhindra vattenavdunstning kan den nyfödda också få problem med elektrolytbalansen. Med åldern minskar bildningen av blåsor och hyperkeratiniseringen uppstår oftare på vissa områden av kroppen, till exempel där hud kommer i kontakt med hud [1, 3-5]. Personer med EI kan också drabbas av bakteriella infektioner i de förtjockade områdena på huden vilket kan leda till en illaluktande odör och i värsta fall sepsis [3]. Det finns olika typer av iktyos, till exempel ichthyosis bullosa of Siemens som beror på defekt i keratingen 2e eller epidermolytic palmoplantar keratoderma som beror på defekt i keratingen 9. Dessa två har vissa symtomatiska likheter med EI, så för att ställa diagnosen EI undersöks bland annat hudbiopsier med immunhistokemi, elektron- och ljusmikroskopi. Man kan även få reda på vilket keratin som är påverkat genom indirekt immunofluorescens där monoklonala antikroppar mot keratinuttryck används. När det är fastställt vilket keratin som är påverkat kan man också få reda på exakt var i genen mutationen är lokaliserad genom mutationsanalys [3]. 3

4 Även om orsaken till EI är känd kan få behandlingar erbjudas för denna livslånga sjukdom och i dagsläget används mestadels mjukgörande krämer. En del patienter har också blivit hjälpta av syntetiska retinoider och kalcipotrol (vitamin D 3 -analog). Det finns även in vitrostudier som beskriver att en liten molekyl, 4-fenylbutyrat (4-PBA), minskar bildningen av aggregat av muterade keratinproteiner. Mekanismen för hur 4-PBA fungerar är inte helt klarlagt men eventuellt fungerar den bland annat som ett kemisk chaperon, det vill säga ser till så att proteiner veckas på rätt sätt [5]. Genom detta projekt ville man skapa ett verktyg som längre fram kan leda till att olika substanser kan prövas in vitro på patogena celler i hopp om att hitta en behandling för EIpatienter. För detta arbete användes expressionsplasmider med en fluorescerande tag, innehållande både keratingen 1 (KRT1) och 10 (KRT10) eftersom de båda är involverade vid EI. Man vill ha dels vildtypen (normal variant) och dels muterade keratiner i plasmiderna för att kunna jämföra dessa. Vildtypsplasmider och muterad KRT10 fanns redan att tillgå på laboratoriet, så som första del i projektet skapades en plasmid KRT1 som hade en deletion på tolv baspar (KRT1 c.508_519del). Deletionen är densamma som hos en känd svensk patient vars sjukdom är svår. Genom PCR av plasmid KRT1vt med primrar som inkorporerade mutationen i PCR-produkten åstadkoms deletionen. För att sedan få större mängd plasmid- DNA transformerades detta genom värmechock in i bakterier som sedan fick växa. Efter att plasmiden renats från bakterier introducerades den sedan till HaCaT-celler, som är en spontanimmortaliserad keratinocytcell-linje [6], för att dessa skulle uttrycka keratinet. Detta steg kallas transfektion och metoden som användes bygger på att DNAt bildar ett positivt laddat komplex tillsammans med ett transfektionsreagens som cellen tar upp genom endocytos. Plasmiderna innehåller en kanamycinresistensgen vilken utnyttjas vid transformationen och odlingen av bakterierna. En CMV-promotor i plasmiderna gör att keratinproteinerna kommer att uttryckas konstant i cellerna och en EGFP-tag gör att man kan studera förekomsten av proteinet (EGFP-märkt keratin) i de transfekterade cellerna i ett fluorescensmikroskop. Det som studerades i fluorescensmikroskopet var antal celler med aggregat bestående av muterat keratin för att se hur proteinuttrycket påverkas vid mutationer i KRT1 och KRT10, eftersom det som tidigare nämnts kan bildas aggregat i keratinfilamenten hos dessa celler. Detta fenomen uppstår ännu hellre om cellen utsätts för stress av något slag och en metod för detta är att utsätta cellerna för värmestress i till exempel ett 42 C-igt vattenbad, vilket gjordes i detta projekt. Eftersom 4-PBA visat sig minska antalet celler med keratinaggregat i en studie på immortaliserade patientceller [5], ville man i detta projekt se om substansen verkar som ett chaperon. Syftena med detta projekt var alltså att 1) ta fram plasmid KRT1 med en deletion c. 508_519del. 2) transfektera in detta konstrukt i HaCaT-celler och jämföra med HaCaT-celler med KRT10 c.c466g med avseende på keratinaggregat. 3) undersöka om 4-PBA har någon effekt på antal celler med keratinaggregat. MATERIAL OCH METOD Ingen etisk prövning krävdes för projektet eftersom det inte involverade varken människor, djur eller material som kan härledas till en individ. Provmaterial För att framställa expressionsplasmid KRT1 c.508_519del (cdna) eller K1 p.asp170_ile173 (proteinnivå) användes plasmid med cdna KRT1vt (Dr. Linda Sandblad, Karolinska Institutet, Sverige) och pegfp-c1 (Takara bio Europe/Clontech, Frankrike). På laboratoriet 4

5 fanns redan KRT10vt (Dr. Linda Sandblad, Karolinska Institutet, Sverige) och KRT10 c. C466G (cdna) eller K10 p.r156g (proteinnivå) som framställts på laboratoriet. HaCaTcellerna var från Norbert Fusenig, DKFZ, Tyskland och DH5α-bakterierna var från Professor Gunnar Westin, Institutionen för kirurgiska vetenskaper, Uppsala Universitet, Uppsala. Framtagning av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del För att ta fram expressionsplasmid KRT1 c.508_519del användes protokollet för QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies Sweden AB, Sverige) med undantag för några ändringar: för att introducera deletionen i KRT1vt utfördes två separata PCR istället för en, en för kodande strängen och en för icke-kodande strängen av plasmiden, detta för att undvika primerdimer då strängarna är komplementära mot varandra. Primrarna hade konstruerats så att de innehöll den önskade deletionen och för den kodande strängen användes 1,25μL av primer 5 - CCCCTCAATGTGGAGATTCAAAAGGTGAAGTCTCGA och för den icke-kodande strängen användes 1,25μL av primer 5 - TCGAGACTTCACCTTTTGAATCTCCACATTGAGGGG. Koncentrationen på primrarna var 100ng/μL. 5μL av KRT1vt med koncentrationen 10ng/μL användes i de båda reaktionerna och PCR-programmet som kördes var 1 cykel 95 C i 60sek, 10 cykler 95 C i 60sek, 55 C i 90sek, 68 C i 7min, för att avslutas på 55 C. Sedan poolades reaktionerna ihop genom att ta 25μL av vardera reaktionen, kodande sträng och icke-kodande sträng, i ett nytt rör och 0,75μL Pfu Ultra HF polymeras (QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, Agilent Technologies Sweden AB, Sverige) tillsattes eftersom enzymet förbrukats i de tidigare reaktionerna. Anledningen till att Pfu Ultra HF polymeras användes istället för Taqpolymeras är att det enzymet har högre noggrannhet. Ovanför vätskan tillsattes 30μL mineralolja och PCR utfördes på PTC 200 DNA engine systems (Bio-rad, USA) enligt 1 cykel 95 C i 60sek, 18 cykler 95 C i 60sek, 55 C i 90sek, 68 C i 7min för att avslutas på 4 C. För att få bort vildtypsplasmid tillsattes sedan restriktionsenzymet Dpn I. Inga kontroller användes under PCR. Plasmid som innehöll deletionen transformerades sedan in i XL10-Gold ultrakompetenta bakterier (QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, Agilent Technologies Sweden AB, Sverige) genom värmechock, det vill säga att provrören var först placerade på is och sen placerades de i ett 42 C-igt vattenbad under 45sek. Istället för NZY + broth användes LBmedium (Lennox broth medium). Plattorna som bakterierna sedan odlades på innehöll 30mL LB-medium och 30µg/mL kanamycin. Inga kontrollplattor odlades. Efter att bakterierna fått växa i 37 C över natt plockades en koloni med ögla och suspenderades i ett provrör med 4mL LB-medium och 4μL kanamycin. Provröret inkuberades sedan på skak i 225rpm i 37 C över natt. Rening av plasmid-dna med QIAprep spin miniprep kit För att rena plasmiden pelleterades bakterierna i 6min, 3825g. Med pelleten gick man vidare enligt protokollet för QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, Sverige), genom vilket bakterierna lyseras alkaliskt så att plasmid-dnat blir lösligt och sedan kan fästa i en kolonngel och till sist elueras ut i ett provrör. 35μl EB-buffert, vilket är elueringsbufferten, tillsattes istället för 50μl. För att sedan bestämma koncentration och renhet av plasmid-dna i provet tillsattes 1,5µL av provet till en Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies, USA). Koncentrationen DNA i provet bestämdes genom att absorbansen vid 260nm mättes medan renheten bestämdes genom att räkna ut en kvot mellan absorbansen vid 260nm (DNA) och 280nm (proteiner). Som blank till instrumentet användes 1,5µL av elueringsbufferten. 5

6 Amplifiering med realtids-pcr och sekvensering av plasmid Enligt absorbansmätningarna hade provet tillräckligt hög koncentration plasmid-dna och tillräckligt bra renhet (A260/A280 >1,8) efter reningen, så det amplifierades upp med hjälp av realtids-pcr. Direkt efter realtids-pcr utfördes en smältkurva, vilken visar vid vilken temperatur DNA-strängarna denatureras. Även KRT1vt togs med i körningen för att kunna jämföra dess smälttemperatur mot KRT1 c.508_519del. Som negativ kontroll användes vatten och dubbelprov kördes på samtliga prover. Som forward primer användes 5 - CCCTCCTGGTGGCATACAA och som reverse primer användes 5 - CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Proverna späddes 1:5000 med vatten. Till mastermixen användes för ett prov: 10µL 2x buffert fast SYBRgreen (Applied Biosystems, Sverige), 7,2µL H 2 O, 0,4µL forward primer 10µM, 0,4µL reverse primer 10µM. Till 96-hålsplattan tillsattes 20µL (18µL mastermix och 2µL prov) per brunn. Plattan täcktes med självhäftande plastfilm och centrifugerades i 1700g i 2min innan realtids-pcr med följande inställningar kördes: 95 C i 20sek, 40 cykler 95 C i 3sek, 55 C i 30sek, efterföljt av en smältkurva: 95 C i 15sek, 60 C i 60sek, 95 C i 30sek, 60 C i 15sek. För att verifiera att mutagenesen lyckats utfördes sedan en sekvensering av provet som amplifierats med realtids-pcr på Uppsala Genome Center, Rudbecklaboratoriet, Uppsala. För provet skickades två rör, ett rör med forward och ett rör med reverse primer så att analysen skedde i två separata reaktioner på båda DNA-strängarna. Provrören innehöll 2µL H 2 0, 12µL plasmid-dna och 4µL primer. Som forward primer användes 5 - TGTTAACCTTGGTGGCAGTAAAAG och som reverse primer användes 5 - CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Sekvenseringen utfördes med AB13730XL DNA analyzer och BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) enligt följande: 94 C i 30sek följt av 35 cykler 94 C i 25sek, 50 C i 15sek, 60 C i 120sek. De erhållna resultaten analyserades på laboratoriet med hjälp av programmen Chromaspro (Technelysium Pty Ltd) och BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) och för att jämföra den erhållna sekvensen med andra användes GenBank (en DNA-sekvensdatabas). Framställning av mer plasmid-dna Då det genom sekvenseringen verifierats att mutagenesen lyckats transfomerades plasmid- DNAt in i DH5α-bakterier för att skapa större mängd av expressionsplasmiden. DH5αbakterier är bra på att ta upp en plasmid och sen syntetisera många nya plasmider. Transformationen gick till enligt följande: DH5α-bakterier som varit frysta i -70 C tinades långsamt på is. Sedan tillsattes 50µL av bakterierna till ett 15mL falcon polypropylen-rör (som i förväg hade kylts på is) och röret inkuberades i 2min på is innan 4µL av plasmid- DNAt spätt 1:10 tillsattes i röret. Lösningen blandades försiktigt och inkuberades på is i 30min. För att föra in plasmiden i bakterierna värmechockades de genom att röret fördes ned i ett 42 C-igt vattenbad i 45sek för att sedan ställas på is i 2min. Till röret tillsattes sedan 0,5mL 42 C-igt medium (5ml LB-medium och 0,1mL 1M glukos) och lösningen inkuberades i 37 C med skak (225rpm) i 1tim. 200µL från röret racklades sedan ut på en LB-agarplatta innehållande 30µg/mL kanamycin och inkuberades i 37 C över natt. För att renodla bakterierna suspenderades sedan två kolonier från LB-agarplattorna i ett rör med 3mL LB-medium och 3µL kanamycin och inkuberades i 37 C, 225rpm i 8tim. Från det röret togs sedan 200µL och tillsattes i en steril e-kolv innehållandes 100mL LB-medium och 100µL kanamycin, vilket inkuberades över natt i 37 C, 225rpm. För att få bort DH5α-bakterierna renades plasmid-dnat enligt protokollet för EndoFree plasmid maxi kit (Qiagen, Sverige) med undantag för att den slutliga pelleten löstes i 75µL buffert TE. Koncentrationen och renheten på plasmid-dnat kontrollerades därefter som tidigare beskrivet med Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop Technologies, USA). 6

7 För att amplifiera plasmid-dnat utfördes återigen en realtids-pcr och efterföljande smältkurva. Denna gång kördes triplikat av KRT1 c.508_519del och KRT1vt och som negativ kontroll användes vatten. Proverna späddes så att de hade någorlunda lika DNA-koncentration innan körningen. Till mastermixen användes för ett prov: 10µL 2x buffert fast SYBRgreen (Applied Biosystems, Sverige), 7,2µL H 2 O, 0,4µL forward primer 10µM, 0,4µL reverse primer 10µM. Som forward primer användes 5 -CCCTCCTGGTGGCATACAA och som reverse primer användes 5 -CAGCAGCTCCCATTTTGTTTG. Till 96-hålsplattan tillsattes sedan 20µL (18µL mastermix + 2µL prov) per brunn. Plattan täcktes med självhäftande plastfilm och centrifugerades i 1700g i 2min innan realtids-pcr med följande inställningar kördes: 95 C i 20sek, 40 cykler 95 C i 3sek, 55 C i 30sek, efterföljt av en smältkurva: 95 C i 15sek, 60 C i 60sek, 95 C i 30sek, 60 C i 15sek. Härmed var framtagningen av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del utförd och del två i projektet, att lyckas transfektera den till HaCaT-celler så att de uttrycker proteinet, kunde påbörjas. Cellodling Celler från cellinjen HaCaT odlades i 75cm 2 -flaskor med 10mL medium vilket innehöll DMEM (Dulbecco s modified Eagle s medium), 10% FCS (fetal calf serum), 2mM L- glutamin, 0,1mM NEAA (non essential amino acids), 50 enheter penicillin, 50µg/mL streptomycin. Mediet i odlingsflaskan byttes varannan dag och cellerna fick växa i 5% CO 2 och 37 C tills de blev cirka 70% konfluenta. För försöket placerades 13 runda 12mm täckglas i en 24-brunns platta och 200µL dilution medium och 2µL coating matrix (Cascade Biologics, USA) tillsattes till samtliga täckglas så att cellerna sedan ska fästa bättre på dem. Detta ska stå i minst 30min. Cellerna i odlingsflaskan splittades sedan för att de skulle kunna sås ut på täckglasen, enligt följande: Mediet i odlingsflaskan sögs bort med en pasteurpipett och därefter tvättades cellerna med 10mL 0,05% EDTA/PBS genom rotation av odlingsflaskan varefter lösningen sögs av. Efter tvätten tillsattes 10mL 0,05% EDTA/PBS och odlingsflaskan inkuberades i 5% CO 2 och 37 C i 15min för att cellerna skulle dra ihop sig och släppa lite från varandra. 0,05% EDTA/PBS sögs av och istället tillsattes 4mL trypsinedta och odlingsflaskan inkuberades i ca 2min 5% CO 2 och 37 C för att lösgöra cellerna. Genom att slå lätt på flaskans sida lösgjordes cellerna ytterligare. Trypsineringen avbröts med 6mL komplett medium (mediet innehåller serum som inhiberar trypsinaktiviteten) och cellerna separerades från varandra genom pipettering. Cellsuspensionen pipetterades över till ett 15mL-rör och 10µL av suspensionen pipetterades till en klack på en Bürkerkammare medan resterande vätska centrifugerades i 180g i 7min. För att få reda på antal celler i 15mL-röret räknades fem stycken B-rutor i Bürkerkammaren med ett mikroskop. Supernatanten från det centrifugerade röret sögs av med en pasteurpipett och pelleten resuspenderades sedan i 10mL HaCaT-medium. Dilution medium och coating matrix sögs av med en pasteurpipett från täckglasen och istället tillsattes cellsuspension så att det blev 5000 celler/täckglas. 24-brunns plattan inkuberades sedan i 5% CO 2 och 37 C under fyra dagar så att cellerna fick växa. Transfektion av plasmider till HaCaT-celler med jetpei reagent Till cellerna som vuxit på täckglasen transfekterades plasmiderna enligt protokollet för jetpei in vitro DNA transfection reagent (In Vitro Sweden AB, Sverige) med undantag att bara 0,5μg plasmid-dna användes per täckglas. För varje plasmid KRT1vt, KRT1 c.508_519del, KRT10vt och KRT10 c.c466g transfekterades 3 täckglas och ett täckglas transfekterades med båda muterade plasmider KRT1 och KRT10. Då transfektionsreagenset och plasmid-dnat var 7

8 tillsatt inkuberades 24-brunns plattan i 5% CO 2 och 37 C under 48tim. Med hjälp av en pincett och en kanyl fördes åtta täckglas (två per olika plasmid) över till en ny 24-brunnsplatta med 0,5mL HaCaT-medium/brunn, cellerna uppåt. Denna platta fick sedan flyta i ett 42 C-igt vattenbad i 30min för att värmestressa cellerna. Täckglaset som innehöll båda muterade plasmiderna behölls ostressat. Efter värmestressen placerades 24-brunnsplattan i 5% CO 2 och 37 C under 15min för att cellerna skulle få återhämta sig. För att sedan fixera cellerna gjordes följande: mediet sögs bort från täckglasen med en pasteurpipett och 0,5mL 1x PBS tillsattes till varje täckglas som tvättning. 1x PBSen sög därefter av och istället tillsattes 0,5mL 50:50 aceton/metanol-lösning (som stått i frysen) och plattan fick stå 10min i frysen för att fixera cellerna. Därefter tvättades täckglasen återigen med 1x PBS innan de slutligen tvättades med vatten. Täckglasen monterades med cellerna nedåt mot objektglas med en droppe monteringsmedel Vectashield with DAPI (Vector Laboratories, USA). DAPI (4, 6- diamidino-2-phenylindole) i monteringsmedlet binder till cellkärnorna och gör så att de fluorescerar blått. Sedan räknades antal celler med keratinaggregat utav tvåhundra transfekterade celler (ses som gröna på grund utav att plasmiderna innehåller en EGFP-tag) per täckglas, med ett fluoroscensmikoskop (Zeiss Axiophot, Carl Zeiss AB, Sverige). Behandling av transfekterade celler KRT1 c.508_519del och KRT10 c.c466g med 4-PBA Cellerna splittades, såddes ut och transfekterades som tidigare beskrivet, men denna gång såddes celler/täckglas ut och de fick växa under ett dygn innan transfektionen. Totalt 4 täckglas transfekterades, 2 täckglas per plasmid KRT1 c.508_519del och KRT10 c.c466g. Cirka 24tim efter transfektionen tillsattes sedan till ett täckglas av varje plasmid 1µL 4-PBA (Sigma Aldrich, USA) 537mM och plattan inkuberades i 5% CO 2 och 37 C tills det gått 48tim. Ett täckglas av varje plasmid behölls obehandlat. Täckglasen fixerades och monterades sedan som tidigare beskrivet, innan återigen antal celler med keratinaggregat utav 200 transfekterade celler per täckglas räknades i fluorescensmikroskop (Zeiss Axiophot, Carl Zeiss AB, Sverige). RESULTAT Framtagning av expressionsplasmid KRT1 c.508_519del Som indikation på att mutagenesen lyckats PCR-amplifierades vildtyp och muterad expressionsplasmid och PCR-produkternas smälttemperatur analyserades. Smälttemperaturen för KRT1vt (Figur 1a) var 79,58 C men för KRT1 c.508_519del (Figur 1b) var den 0,34 C lägre (79,24 C), vilket gav en indikation på att den var några baspar kortare, eftersom en lite kortare sekvens borde denatureras vid lite lägre temperatur. Sekvenseringsanalyserna visade att provet innehöll KRT1-DNA med en deletion (c.508_519del). 8

9 Figur 1. Smältkurvsanalys för vildtyp- och muterad KRT1 -expressionsplasmid. Figuren visar medelvärdet av smälttemperaturen, vid vilken DNA-strängarna denatureras för triplikatprov av a) KRT1vt och b) KRT1 c.508_519del. (n=3). Transfektion av plasmider till HaCaT-celler med jetpei reagent Expressionsplasmiden som tagits fram transfekterades in i HaCaT-celler med hjälp av jetpei DNA transfection reagent (In Vitro Sweden AB, Sverige) men transfektionsgraden av cellerna var låg. Uppskattningsvis var endast 5-10% av cellerna på ett täckglas transfekterade. Men oberoende av vilken expressionsplasmid de transfekterade cellerna innehöll så uttryckte de proteinet och bildade keratinfilament och även olika grad av keratinaggregat (Figur 2). Aggregaten uppstod oftast perifert i cellerna men ibland sågs även keratinfilament med aggregat vid cellkärnan, se ett exempel på detta samt en cell utan aggregat i figur 2. Figur 2. Detektion av EGFP i HaCaT-celler transfekterade med KRT10vt. Bilden visar värmestressade celler som tagit upp plasmid KRT10vt (gröna). Cellen till vänster uppvisar tydliga keratinfilament men innehåller inga keratinaggregat medan cellen till höger innehåller keratinaggregat både perifert och vid cellkärnan. Av de 200 räknade cellerna (per plasmid), sågs att i ostressade celler som innehöll KRT1vt hade 16% av cellerna keratinaggregat men vid värmestress var andelen något högre (Figur 9

10 Celler med keratinaggregat (%) Celler med keratinaggregat (%) 3a). I ostressade celler som innehöll KRT1 c.508_519del däremot hade strax över hälften av cellerna keratinaggregat och vid värmestress var andelen lite högre (Figur 3a). För celler som var ostressade och innehöll KRT10vt var det också 16% av cellerna som hade keratinaggregat men vid värmestress var andelen högre (Figur 3b). I celler som transfekterats med KRT10 c.c466g hade de flesta cellerna keratinaggregat och det var ingen nämnvärd skillnad på om cellerna var värmestressade eller inte. Celler som innehöll KRT10 c.c466g jämfört med KRT1 c.508_519del hade 24% mer aggregat utan värmestress och 13% mer vid värmestress (Figur 3a och b) Ej VS VS KRT1vt KRT del Plasmid Ej VS VS KRT10vt KRT10 C466G Plasmid Figur 3. Procentuell andel av celler transfekterade med a) KRT1vt och b) KRT1 c.508_519del som uppvisade keratinaggregat med och utan värmestress (VS). Data redovisar medelvärdet för 200 EGFPpostitiva celler på 1-2 täckglas (n=2 när standardavvikelse är inkluderad). VS står för värmestress. Celler som innehöll både KRT1 c.508_519del och KRT10 c.c466g överlevde och uttryckte proteinet. De skiljde sig inte till utseende från de andra cellerna. Keratinaggregat kunde ses i 81% av cellerna (visas ej). Behandling av transfekterade celler KRT1 c.508_519del och KRT10 c.c466g med 4-PBA Eftersom 4-PBA visat sig kunna minska antalet celler med keratinaggregat i en tidigare in vitro studie behandlades celler med 4-PBA under ett dygn innan de fixerades. I detta försök sågs dock ingen nämnvärd skillnad i antal celler med keratinaggregat. Keratinaggregaten blev heller inte synbart mindre i storlek eller färre per cell. 10

11 DISKUSSION Utbudet av behandlingar för patienter med EI är låg och detta projekt var en del i arbetet att skapa en bra modell för att testa olika substanser som potentiellt skulle kunna komma att ingå i en behandling. Andra modeller som prövats för detta ändamål är bland annat en modell där patientceller immortaliserades för att skapa en cellinje [5]. Nackdelarna med en sådan modell är besväret det innebär för patienten, samtidigt som det inte finns så många patienter, samt att den kräver mycket tid. Ännu en annan modell är att använda sig av möss, till vilkas genom en muterad keratingen är introducerad [7], men att använda en sådan modell för att screena massor av substanser skulle vara oetiskt samt tidsödande och väldigt kostsamt. Musmodellen är mer lämplig för att verifiera positiva resultat som framtagits med en smidigare modell, till exempel där plasmider transfekteras in i en stabil cellinje, därav detta projekt. HaCaT-celler, vilket användes i detta försök, är svårtransfekterade, så den uppskattade transfektionsgraden på 5-10% var inte så förvånande. Även om jetpei in vitro DNA Transfection Reagent (In Vitro Sweden AB) som användes för transfektionen rekommenderar 1µg plasmid-dna användes det i försöket endast 0,5µg. Anledningen till att en lägre mängd plasmid-dna användes i försöket var att om för mycket DNA tillsätts till cellerna kan det få konsekvensen att proteinet aggregerar på grund av det, vilket gör att cellen inte mår bra. Så kanske skulle mängden plasmid-dna om något varit ännu lägre för att få bättre transfektionsgrad. Vad sedan gäller stressen av keratinocyter för att de ska bilda keratinaggregat så finns det olika sätt att göra detta. Ett exempel är genom osmotisk stress, där cellerna till exempel kan behandlas med 150mM urea [8]. I detta försök användes istället värmestress, där cellerna inkuberades i ett 42 C-igt vattenbad under 30min. Men enligt resultaten i detta försök skulle modellen kunna användas utan att värmestressa cellerna eftersom det hade sådan liten effekt på celler med muterad plasmid. Det blev mycket celler som hade keratinaggregat även utan stressmomentet. I celler med vildtypsplasmid däremot vill man ha så få celler som möjligt med aggregat eftersom de ska representera friska celler. Men i försöket var det dock en ganska stor andel celler med vildtypsplasmid som hade keratinaggregat och speciellt om de var värmestressade. Detta kan eventuellt bero på att även om vildtypsplasmiden inte innehåller någon muterad gen så innehåller den bland annat en EGFP-tag, vilken kanske påverkar cellskelettet så att det blir mindre stabilt och därmed gör att även dessa celler bildar aggregat vid stress. Men skillnaden i hur mycket keratinaggregat som bildas i celler med muterad jämfört med vildtypsplasmid är fortfarande så pass stor att modellen inte blir opålitlig. Resultaten visar alltså att celler som transfekterats med muterad plasmid bildar keratinaggregat i mycket högre utsträckning än celler som transfektereats med vildtypsplasmid. En observation var också att celler som innehöll KRT1 c.508_519del oftare hade fler och kraftigare keratinaggregat än celler med KRT10 c.c466g. De verkade alltså mer påverkade i det avseendet. Transfekterade celler med KRT1 c.508_519del och transfekterade celler med KRT10 c.c466g behandlades med 4-PBA då denna substans visat sig minska bildande av keratinaggregat [5] samt ha chaperonliknande egenskaper [9]. I detta försök sågs dock ingen nämnvärd skillnad mellan celler som behandlats eller inte. Så med tanke på detta försöks resultat tillsammans med resultaten från in vitro-studien på patientceller [5] så är det då troligt att 4-PBA inte verkar på ett redan uttryckt protein utan att det snarare har en effekt på gennivå. Det finns även andra förslag för behandlingar än att använda sig av substanser. Till exempel forskas det i om man kanske kan använda sig av short-interfering RNA (sirna). sirna är dubbelsträngade RNA-molekyler som har nitton nukleotider med ett överhäng på två nukleotider i 3 -ändarna och dessa skulle då användas som en metod för att allelspecifikt 11

12 kunna tysta en muterad gen på proteinnivå utan att det har någon nämnvärd påverkan på den normala allelen [10]. Studier med just sirna har prövats vid en annan keratingenssjukdom, pachyonychia congenita, och fått positiva resultat. De studierna, där modeller med både HaCaT-celler och möss använts, pekar på att specifika sirna s är effektiva för att hämma uttrycket av muterade gener [11]. Sammanfattningsvis så tog vi i detta försök fram sista verktyget i form av expressionsplasmid KRT1 c del, för att kunna skapa en modell som innehåller expressionsplasmider och en stabil cellinje, samt gjorde ett mindre försök med 4-PBA för att se om modellen fungerar att screena substanser med. Modellen behöver i framtiden prövas och utvecklas mera för att säkerställa dess användbarhet och specificitet. ACKNOWLEDGEMENTS Jag skulle vilja tacka alla på institutionen för dermatologi och venereologi vid Akademiska sjukhuset i Uppsala som gjort min tid för examensarbetet spännande och mycket trevlig. Tack för all handledning så väl praktisk som teoretisk, de givande diskussionerna och allt det roliga jag haft! Jag vill även tacka mina nära och kära som alltid ger mig stöd, hopp och kärlek. REFERENSER [1] J C Chamcheu, I A Siddiqui, D N Syed, V M Adhami, M Liovic, H Mukhtar. Keratin gene mutations in disorders of human skin and its appendages. Archives of biochemistry and biophysics, 2011(508), p [2] E B Lane, W H I McLean. Keratins and skin disorders. Journal of pathology, 2004(204), p [3] N L Lacz, R A Schwartz, G Kihiczak. Epidermolytic hyperkeratosis: a keratin 1 or 10 mutational event. International journal of dermatology, 2005(44), p.1-6 [4] H Törmä. Regulation of keratin expression by retinoids. Dermato-Endocrinology, 2011(3), p [5] JC Chamcheu, I Pihl Lundin, C E Mouyobo, T Gester, M Virtanen, A Moustakas, H Navsaria, A Vahlquist, H Törmä. Immortalized keratinoctes derived from patients with epidermolytic ichthyosis reproduce the disease phenotype: a useful in vitro model for testing new treatments. British journal of dermatology, 2011(164), p [6] P Boukamp, R T Petrussevska, D Breitkreutz, J Hornung, A Markham, N E Fusenig. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. The journal of cellbiology, 1988(106), p [7] M J Arin, D R Roop. Inducible mouse models for inherited skin diseases: implications for skin gene therapy. Cells tissues organs, 2004(177), p [8] D R Beriault, O Haddad, J V McCuaig, Z J Robinson, D Russell, E B Lane, D S Fudge. The mechanical behavior of mutant K14-R125P keratin bundles and networks in NEB-1 keratinocytes. PLoS One, 2012(7), e

13 [9] D H Perlmutter. Chemical chaperones: a pharmacological strategy for disorders of protein folding and trafficking. Pediatric research, 2002(52), p [10] W H I McLean, C B T Moore. Keratin disorders: from gene to therapy. Human molecular genetics, 2011(20), p [11] F J D Smith, R P Hickerson, J M Sayers, R E Reeves, C H Contag, D Leake, R L Kaspar, W H I, McLean. Development of therapeutic sirnas for Pachyonychia congenita. Journal of investigative dermatology, 2008(128), p