Didemnin. Yesica Bendezu. Biologisk aktiva naturproduker i läkemedelsutveckling VT-2007

Didemnin Yesica Bendezu Biologisk aktiva naturproduker i läkemedelsutveckling VT-2007 1

Innehållsförteckning Historisk bakgrund 3 Hur och varför projektet startades.5 Isolering av didemnin 5 Biologisk aktivitet..6 1. Antiviral aktivitet 7 2. Antitumör aktivitet..7 3. Immunosuppressiv aktivitet.8 Kliniska effekter och användning...8 Läkemedelsutveckling 9 Diskussion.9 Referenslista.10 2

Historisk bakgrund Den marina miljön är en källa för många organiska komponenter. Dessa innefattar didemniner. Didemniner är en cyklisk depsipeptid som kommer från karibiska tunikat som tillhör till Didemnidae familj (Crampton et al 1984). Didemniner isolerades från ett karibiskt tunikat av släkten Trididemnum. 1978 hade detta tunikat samlats i karibiska havet i närheten av bland annat Honduras, Mexico, Colombia, Belize och Panama. Upprepade tester gjordes av metanol-toluen extrakt av didemnin mot herpes simplex virus typ 1 som växte i njurceller på apor. Man kunde observera dels en hämning av virustillväxt och även cytotoxicitet för njurcellerna. Detta resultat visade att didemnin var en ny typ av depsipeptid som hade hög antiviral och antitumör aktivitet. Man testade extrakter av tunikat från olika områden också mot andra typer av virus och alla extrakt visade en hämning av både DNA och RNA virus. Vid höga doser av extraktet fann man också cytotoxicitet på de virusinfekterade cellerna. Denna effekt försvann vid låga doser. Antitumöra egenskaper bekräftades dessutom tack vare den höga potens mot L1210 murine leukemi celler (Rinehart et al 1981). Upptäckten av didemniner A, B och C rapporterades 1981 av Rinehart et al. Då påstods det att strukturerna innehöll en makrocyklisk kärna bestående av en statin och en α-( α- hydroxyisovaleryl)propionyl (Hip) grupp, tillsammans med leucin (Leu), prolin (Pro), N,Odimetyltyrosin (Me2Tyr) och treonin (Thr). Tyrosinets karboxylgrupp var bunden till treonin genom treoninets hydroxylgrupp. Treoninets karboxylrest var bunden till statinrest genom amidbindning. De föreslagna strukturerna grundades på NMR (nuclear magnetic resonans) metoder, syrahydrolys, masspektrometri och GC (gaskromatografi) analys av de individuella aminosyrorna. De följande åren granskades didemniners struktur och stereokemi många gånger och det bekräftades att makrocykeln inehöll isostatin och inte statin. Skillnaden mellan de olika didemninerna är en sidokedja som är fäst vid treoninets aminogrupp. För didemnin A består sidokedjan av endast N-Me-D-leucin. Didemnin B har en laktylprolin enhet. Didemnin C har en sidokedja bestående av N-Me-D-leucin och en rest av laktosyra (Vera och Joullie 2002). Eftersom didemnin C hittades i små mängder i tunikatet studeras endast didemnin A och B i detalj (Crampton et al 1984). 1982 patenterade Rinehart gruppen isolering och möjliga antivirala applikationer av didemniner A, B och C. Denna patent innefattade också isolering av nordidemniner. De innehöll norstatine istället för isostatin. På det kunde nordidemnin B kallas [Norsta]didemnin B. Skillnaden i strukturen var att nordidemniner hade som sidokedja en isopropylgrupp istället för sec butylgruppen som didemniner har. Följande studier visade att nordidemninb hade samma antitumöra egenskaper som didemnin B. Ytterligare ett patent av Rinehart et al avslöjade strukturen och cytotoxisk aktivitet av dehydrodidemnin B eller aplidin. Det som skiljer aplidin från didemnin är att dess hydroxylgrupp i laktylpositionen är oxiderad till korresponderande keton (Vera och Joullié 2002). Didemniners nomenklatur illustreras i tabell 1 och tabell 2. Makrocykeln består av ovan nämda grupper förutom statin som man kom fram till att det var isostatin (Ist). Tabellerna visar skillnaden mellan de olika didemniner. De innehåller nämligen olika grupper i makrocykeln och har olika sidokedjor. Tabellerna underlättar en särskiljning och beskrivning av olika didemniner och deras syntetiska analoger. 3

Tabell 1. Nomenklatur av didemniner med olika grupper i makrocykeln. Komponent Grupper i makrocykeln Didemnin A Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Didemnin B Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Didemnin C Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Nordidemnin B Norsta Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Dehydrodidemnin B Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Didemnin M Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr Tamandarin A Ist Hiv Leu Pro Me2Tyr Thr Tamandarin B Norsta Hiv Leu Pro Me2Tyr Thr Didemnin makrocykel Ist Hip Leu Pro Me2Tyr Thr- HCL Tabell 2. Nomenklatur av didemniner med olika sidokedjor. Komponent Sidokedja Didemnin A N-Me-D-Leu Didemnin B N-Me-D-Leu Pro Lac Didemnin C N-Me-D-Leu Lac Nordidemnin B N-Me-D-Leu Pro Lac Dehydrodidemnin B N-Me-D-Leu Pro Pyruvat Didemnin M N-Me-D-Leu Pro Lac Gln PGlu Tamandarin A N-Me-D-Leu Pro Lac Tamandarin B N-Me-D-Leu Pro Lac Didemnin makrocykel N-Me-D-Leu Figur 1. Struktur av didemniner A, B och C 4

År 1994 rapporterades didemnin H. Denna struktur skiljer sig från didemnin B genom att sidokedjan är acylerad med en glutamin-pyroglutamatsyra dipeptid och kallas också för didemnin M. Den systematiska beskrivningen skulle vara [Gln, pglu]didemnin B. 1995 rapporterades struktur och cytotoxisk effekt av två nya didemniner [Tyr]didemnin B och [D-Pro]didemnin B. Dessa två strukturer är bland de få didemniner med ursprung från naturen som har flest ändringar i makrocykeln av molekylen. Mer didemniner avslöjades 1995 som nordidemnin N, eller [Norsta, Tyr]didemnin B, en annan som genomgick modifiering i makrocykeln. År 2000 rapporterades strukturerna av tamandarin A och B. Tamandariner isolerades från en brasiliansk ascidian av Didemnidae familjen. I dessa strukturer är Hip gruppen av didemniner ersatt av en mycket enklare hydroxyvarelylsyrahalva (Hiv). Tamandarin A innehåller samma peptidkedja som didemnin B. Tamandarin B har samma sidokedja men dess makrocykel innehåller norstatin istället för isostatin. Preliminära tester visade att tamandarin A har en mycket liknande biologisk aktivitet som didemnin B (Vera och Joullié 2002). Figur 2. Trididemnum solidum som växer på stjärnkorallen Moncastraeae fareolata (Backner 2007) 5

Hur och varför projektet startade Upptäckten av didemniner väckte nyfikenhet bland forskare över hela världen och satte i gång ett spännande kapitel inom naturprodukters kemi. Didemniners ovanliga struktur tjänade som modell för framställning av syntetiska analoger. Tack vare den biologiska aktivitet som kunde observeras genom in vivo och in vitro studier kunde didemninerna genomgå kliniska prövningar på människa i USA. Där var det första gången som en marin naturprodukt mot cancer användes på människor. Detta öppnade också möjligheten för forskning av dehydrodidemnin B (aplidin), en andra generation av didemnin. Didemniner har bidragit till förståelse för hur naturprodukters kemi kan användas som ett kritiskt verktyg för forskning inom cellbiologi (Vera och Joullié 2002). Isolering av didemnin Extrakter av metanol-toluen av tunikatet blandades med en lösning av natriumnitrat. Sedan extraherades den vattenlösliga delen med kloroform. Lagret av kloroformen koncentrerades och kromatografi över kiselgel med en gradient av metanol i kloroform användes för att få didemniner C, B och A genom eluering. Detta kunde renas vidare genom att använda thin-layer chromatografi (TLC) med samma system. Didemniner A, B och C hade både de antivirala och cytotoxiska aktiviteter som extrakterna (Rinehart et al 1981). Man kunde också använda isopropanolextrakt av Trididemnum solidum vilket koncentrerades för att ta bort isopropanolet och sedan extrahera med kloroform (Hossain et al 1988). Separation genom Tunnskiktskromatografi (TLC) Tunnskiktskromatografi är en vätskekromatografisk metod som används för att separera ämnen i en s.k. öppen bädd. Denna öppna bädd brukar vara en platta av t ex glas. Se figur1. På plattan finns det en fast fas där analyten kan stoppas. Sedan placeras plattan i en behållare med vätska. Vätskan börjar vandra längs plattan och beroende på analytens egenskaper förflyttas analyten tillsammans med vätskan. På det sättet separeras analyter med olika egenskaper då de fördelas olika till fasta fasen (Hedeland och Pettersson 2005). Figur 3. En tunnskiktsplatta som är placerad i en behållare där elueringsmedel finns på bottnet (Romar 2006). 6

Biologisk aktivitet En studie visade att Trididemnum solidum hade förmågan att producera sekundära metaboliter för att undvika att bli uppäten av fiskar. Eftersom dessa tunikat ofta lever i områden där rovgirigheten är stor har dessa egenskaper utvecklats som en försvarsmekanism för att överleva. De sekundära metaboliterna i fråga är nämligen didemniner och ger en dålig smak för fiskarna (Lindquist 1992). Många år efter de första rapporterna av didemniners isolering och strukturbestämning var det klart att de hade fler biologiska effekter in vitro och in vivo. Den främsta biologiska aktiviteten av didemniner är hämning av virusspridning, tumörcellstillväxt och immunitet (Vera och Joullie 2002). 1. Antiviral aktivitet Rinehart et als forskning visade som ovan nämnt, antiviral aktivitet. De jämförde koncentrationer av antivirala komponenter som behövs för att orsaka en logaritmisk reduktion av herpes simplex virus. Adenosin arabinosin, ett kliniskt antiviralt verkningsmedel krävde koncentrationer över 10 µm medan didemnin A endast krävde 1µM och didemnin B en koncentration på endast 0,05 µm. Eftersom didemnin B var mycker mer potent än didemnin A varnades för att didemnin B också var mer toxiskt mot däggdjursceller och att det krävdes mer forskning för att bedöma den terapeutiska effektiviteten. Andra forskare visade att didemnin A och B hade effekt på Rift Valley fever (RVF) virus. I studien kunde didemniner skydda möss från dödliga doser av viruset. Det finns ingen rapporterad effektiv terapi mot detta virus men båda didemninerna visade hämning av det och andra virus som t ex gula febern. Doserna liknade de som Rinehart et al hade använt i sin forskning. Effekt mot denghe virus visades också, med cytotoxicitet vid höga doser (Vera och Joullié 2002). Effekt av didemniner A och B mot herpes simplex virus typ 2 rapporterades också. Det blev en framgångsrik in vivo studie på möss som hade varit infekterade med detta virus. Didemnin skyddade mössen mot viruset. Liksom andra resultat var också didemnin B betydligt mer potent än didemnin A (Rinehart et al 1983). Andra studier av Rinehart gruppen rapporterades också. Många naturella och semisyntetiska didemniner studerades för att observera deras antivirala aktivitet. Många av dem var effektiva för hämning av RNA replikation av vesikulös stomatit virus och DNA herpes simplex virus typ 1. Ingen av dem hade effekt på replikation av HIV virus (Sakai et al 1996). 2. Antitumör aktivitet Det första beviset för didemniners antitumöra aktivitet kom fram efter in vivo och in vitro tester. In vitro studier av L1210 celltillväxt visade att didemnin A orsakade 50% av celltillväxthämning men didemnin B var än mer potent. Didemnin Bs högre potens jämfört med didemnin A kunde påvisas av in vivo studier. Didemnin B hade mer effekt hos möss med P388 leukemi tumörceller än didemnin A (Rinehart et al 1981). 7

Didemnin Bs effekt på människotumörer visades efter en studie gjord på färska tumörceller av biopsi prov från 39 cancerpatienter. Denna studie mätte hämningseffekten av didemnin B hos tumörkolonier in vitro. Vid låga koncentrationer visades antitumör aktivitet mot karcinom i bröst, äggstockar och njure. Dessa resultat ger grund för att genomföra fas I kliniska prövningar. In vitro studier skulle hjälpa att särskilja tumörtyper för studier i fas II av detta anticancer läkemedel (Jiang T et al 1983). Andra studier visade antitumör effekt för nordidemnin B. Det rapporterades att nordidemnin B var lika effektiv som didemnin B mot P388, L1210 och B16 celler. Denna observation bekräftade att den sortens variation inte förändrar antitumöreffekten in vitro. 1996 fortsatte studierna och det förekom att dehydrodidemnin B visade större cytotoxisk aktivitet gentemot didemninb. Därför fick dehydrodidemnin B mer uppmärksamhet som en ny klinisk kandidat i cancerterapi. (Vera och Joullié 2002). Didemnin B har som effekt tillväxthämning i en bred variation av tumörceller hos människor vid koncentrationer på nanomolar nivå. Vid dessa koncentrationer har didemnin B cytostatisk effekt på celler fastän det verkar som om effekten är irreversibel vid långtidsexponering för läkemedlet. Didemnin B är cytotoxiskt och kan inducera programmerad celldöd genom att det hämmar proteinsyntes i celler. Denna effekt är den främsta orsaken för cytotoxiciteten hos didemnin B. Dock har visats att endast hämning av proteinsyntes är otillräcklig för att inducera celldöd (Ahuja et al 2000). 3. Immunosuppressiv aktivitet En studie gjordes på kulturer av murine celler där didemnin B applicerades. Resultatet visade hämning av lymfocytproteinsyntes men cellens livsduglighet och RNA syntes vara oförändrad. Det ansågs att eftersom lymfocyt syntes var viktig för många immunaktiviteter verkade didemnin B ha immunosuppressiva effekter. Det visades också att didemnin B var mycket mer potent än cyklosporin. Resultatet föreslog att didemnin B kan ha effekt på cellerna i tidigt skedde av lymfocytaktivering. (Montgomery och Zukoski 1985). Kliniska effekter och användning På grund av den höga antitumöra aktiviteten som studier in vitro visade; öppnades möjligheten för fas I kliniska prövningar på människan tillsammans med det nationella cancerinstitutet. Didemnin B skulle vara den första marina naturprodukt som genomgick anticancer prövningar på människor. Målorganen för didemnin Bs toxicitet hos möss, råttor, och hundar var lever, njurar, lymfa samt mag- och tarmkanalen (Chun et al 1986). Fas II prövningar på 10 patienter som fick didemnin B genomfördes för att studera didemnin Bs farmakokinetik. En enzymimmunoassay genomfördes i vilken en snabb clearance från plasma observerades. Man kunde inte identifiera metaboliter. In vitro experiment visade att didemnin B inte var bundet till albumin i plasma och en mindre del av läkemedlet kunde associeras med röda blodkroppar (Benvenuto et al 1992). Studier i fas II prövningar bland alla studier kring didemninb hade en gemensam slutsats. Vid dessa doser som användes upplevdes låg effektivitet men stora toxiska effekter. Det smala 8

terapeutiska fönstret skulle kunna bli bredare om man hittade en mer potent struktur så att klinisk toxicitet kunde minskas (Vera och Joullié 2002). Dehydrodidemnin B har i andra studier visat sig vara betydligt mer potent än didemnin B. (Sakai et al 1996). Läkemedels utveckling Didemniner A B och C som hade extraherats från Trididemnum solidum och som höll på att genomgå fas II kliniska prövningar blev syntetiserade. Den nya strukturen innehöll en ny aminosyra (Rinehart et al 1988). Sedan gjordes strukturerna om så att de blev mer syntetiserbara, genom att använda en stereokontrollerad beredning av isostatinresten och en syntetisk väg för den dyra D-alloisoleucin. En annan ändring som fick framgång var genom att använda en sekundär amin som en nukleofil. Annan typ av syntes gjordes genom att inkludera strategiska element av stereokontroll på både Ist och Hip. Efter att genomgå många strukturändringar kom man fram till syntetisering av tamandarin A, [(2S)-Hiv]didemnin M och tamandarin B (Vera och Joullié 2002). En annan didemnin analog så kallad nordidemnin blev syntetiserad genom att ersätta laktylresten med mandelyl och 3-(p-hydroxyfenyl) propionyl rester. Dessa ändringar förändrade inte den cytotoxiska aktiviteten mot P388 leukemi (Jouin et al 1991). En ny syntetisering av didemnin A och dehydrodidemnin B gjordes genom att använda salter för att bilda sekundära och tertiära amidbindningar. Dehydrodidemnin har den högsta reproduktionshämmande effekten. Det gjordes också olika ändringar genom att ersätta olika grupper från makrocykeln. Detta resulterade i syntes av didemnin A som blev identisk med den naturprodukten. (Jou et al 1997). Diskussion Historien om Didemniner är mycket lärorik och upplyser om hur ett läkemedel kan utvecklas. Den beskriver hur olika användningsområden har hittats, hur nya liknande produkter syntetiserats samt upptäckten att även andra naturprodukter har liknande kemiska strukturer. Dessa strukturer är förknippade med antivirala, cytotoxiska och immunosuppressiva effekter. Man kan också observera att små skillnader i struktur av olika substanser kan ha en så stor påverkan på både effektivitet och toxicitet. Forskningen om didemninb har minskat den senaste tiden på grund av den toxiska profil som tydligt påvisats i flera studier. Det är dock mycket viktigt med didemninets upptäckt för att fortsätta forskning av liknande substanser från marina naturprodukter. Det innebär att didemnin har givit idéer och öppnat möjligheter för att arbeta med mer potenta cancerläkemedel som t ex aplidin. Eftersom aplidin har visats vara effektivare och mindre toxiskt är det naturligt att studier och utveckling fortsätter för denna substans samtidigt som intresset för didemnin B har avtagit. 9

Referenslista Ahuja D, Geiger A, Ramanjulu J, Vera M, SirDeshpande B, Pfizenmayer A et al. Inhibition of protein synthesis by didemnin B: how EF-1alpha mediates inhibition of translocation. J Med Chem 2000;43:4212-4218. lus&list_uids=10757982&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Benvenuto J, Newman R, Bignami G, Raybould T, Raber M, Esparza L, et al. Phase II clinical and pharmacological study of didemnin B in patients with metastatic.invest New Drugs 1992;10:113-7. lus&list_uids=1500265&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Buckner A. NOAA fisheris hemsida. URL http://www.marinebiotech.org/images_large/trididemnum_solidum.jpg 2007.02.06 Chung H, Davies B, Holth D, Suffness M, Plowman J, Flora K, et al. Didemnin B. The first marine compound entering clinical trials as an antineoplastic agent. Invest New Drug 1986;4:279-84. lus&list_uids=3546184&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Crampton S, Adams E, Kuentzel S, Li L, Badiner G, Bhuyan B. Biochemical and cellular effects of didemnins A and B. Cancer Research 1984;44:1796-1801. lus&list_uids=6713383&itool=iconfft&query_hl=1&itool=pubmed_docsum Hedeland M och Pettersson C. Kurkompendium i analytisk farmaceutisk kemi. Institutionen för läkemedelskemi: Uppsala Universitet; 2005. Hossain M, Van Der Helm D, Antel J, Sheldrick G, Sanduja S. Crystal and molecular structure of didemnin B, an antiviral and cytotoxic depsipeptide. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:4118-4122. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=3380783 Jiang T, Liu R, Salmon S. Antitumor activity of didemnin B in the human tumor stem cell assay. Cancer Chemother Pharmacol 1983;11:1-4. 10

lus&list_uids=6883622&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Jou G, Gonzales I, Albericio I, Lloyd Williams P, Giralt E. Total Synthesis of Dehydrodidemnin B. Use of Uronium and Phosphonium Salt Coupling Reagents in Peptide Synthesis in Solution. J Org Chem 1997;62:354-366. lus&list_uids=11671410&itool=iconabstr&query_hl=3&itool=pubmed_docsum Jouin P, Poncet J, Dufour M, Aumelas A, Pantaloni A, Cros S, Francois G. Antineoplastic activity of didemnin congeners: nordidemnin and modified chain analogues. J Med Chem 1991;34:486-91 lus&list_uids=1995869&itool=iconabstr&query_hl=7&itool=pubmed_docsum Lindquist N, Hay M, Fenical W. Defense of Ascidians and Their Conspicuous Larvae: Adult vs. Larval Chemical Defenses. Ecological Monographs 1992;62:547-568. http://www.esajournals.org/esaonline/?request=get-abstract&issn=0012-9615&volume=062&issue=04&page=0547 Montgomery D och Zukoski C. Didemnin B: a new immunosuppressive cyclic peptide with potent activity in vitro and in vivo. Transplantation 1985;40:49-56. lus&list_uids=2409649&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Rinehart K Jr, Gloer J, Hughes R Jr, Renis H, McGovren JP, Swynenberg E, Stringfellow D, Kuentzel S, Li L. Didemnins: antiviral and antitumor depsipeptides from a caribbean tunicate. Science 1981;22:933-5. lus&list_uids=7233187&itool=iconabstr&query_hl=1&itool=pubmed_docsum Rinehart K, Gloer J, Wilson G, Hughes R, Li L, Renis H, Mc Grovn J. Antiviral and antitumor compounds from tunicates. Federation Proceedings 1983;42:87-90. lus&list_uids=8709112&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Rinehart K, Kishore V, Bible K, Sakai R Sullins D, Li K. Didemnins and tunichlorin: novel natural products from the marine tunicate Trididemnum solidum. J Nat Prod 1988;51:1-21 11

lus&list_uids=3373220&itool=iconabstr&query_hl=5&itool=pubmed_docsum Romar H. Edu.fi hemsida URL http://www.edu.fi/svenska/page.asp?path=499,12989,49266,54789,55835,55902 2006.12.04 Sakai R, Rinehart K, Kishore V, Kundu B, Faircloth G, Gloer J, et al. Strukture-aktivity relationships of the Didemnins. J Med Chem 1996;39:2819-34. lus&list_uids=8709112&itool=iconabstr&query_hl=17&itool=pubmed_docsum Vera M, Joullie M. Natural products as probes of cell biology: 20 years of didemnin research. Med Res Rev 2002;22:102-45 lus&list_uids=11857636&query_hl=2&itool=pubmed_docsum 12