Verkningsmekanismer & tillämpningar för nya målinriktade cancerläkemedel Molekylär-Patologi Magnus Sundström, PhD Utvecklingsansvarig Molekylärpatologi, UAS Magnus.Sundstrom@akademiska.se
Molekylärpatologi T7 Bakgrund: Molekylärpatologi / Nya cancerläkemedel Lungcancer: EGFR-inhibitorer Malignt melanom: BRAF-inhibitorer 2
Molekylär-Patologi Akademiska Sjukhuset http://www.akademiska.se/sv/verksamheter/klinisk-patologi 3
Vilka analyser vid vilka sjukdomstillstånd? Diagnos Analys Metod Kolorektalcancer RAS, BRAF, PIK3CA Next Gen. Sekv. Malignt melanom BRAF Pyrosekvensning Mastocytos och GIST c-kit Q-PCR / NGS Lungcancer EGFR, RAS etc. NGS / Q-PCR Lungcancer ALK FISH / Nanostring Bröstcancer HER2 SISH Ärftlig kolorektalcancer BRAF Pyrosekvensning MSI MSI-analys Gliom MGMT-metylering Pyrosekvensning 1p19q LOH MLPA 4
Nya läkemedel och deras målprotein Molekyl Läkemedel Målprotein Cancer Trastuzumab Herceptin Her2 Bröst Cetuximab Erbitux EGFR Kolon Panitumumab Vectibix EGFR Kolon Gefitinib IRESSA EGFR Lunga Erlotinib Tarceva EGFR Lunga Afatanib Giotrif EGFR / Her2 Lunga Osimertinib Tagrisso/AZD9291 EGFR (T790M) Lunga Crizotinib Xalkori ALK Lunga Imatinib Glivec c-kit / BCR-ABL GIST/CML Vemurafenib Zelboraf BRAF Melanom 5
Nya läkemedel = målsökande terapi Substanser som specifikt dödar cancerceller genom att inhibera nyckelmolekyler involverade i cancercellens celldelning / överlevnad. Receptor-tyrosin-kinas c-kit EGFR HER2 PDGFR VEGF 6
Nya läkemedel = målsökande terapi Substanser som specifikt dödar cancerceller genom att inhibera nyckelmolekyler involverade i cancercellens celldelning / överlevnad. Receptor-tyrosin-kinas c-kit EGFR HER2 PDGFR VEGF Mutation Överuttryck(amplifikation) Translokation Autokrin stimulering 7
Två typer av målinriktade (RTK) läkemedel Cetuximab Panitumumab Trastuzumab (Herceptin) RTK EGFR HER-2 c-kit ALK Erlotinib Gefitinib Afatanib Imatinib Crizotinib (Vemurafenib) 8
EGFR-uttryck i cancer Human Protein Atlas Antikropp CAB000035 http://www.proteinatlas.org 9
EGFR-uttryck i lungcancer NSCLC IHC proteinuttryck: 34%-84% 10
Antikroppar EGFR-inhibitorer Cetuximab Erbitux, MERCK Panitumumab Vectibix, AMGEN Små molekyler Gefitinib Iressa, ASTRA-ZENECA Erlotinib Tarceva, ROCHE Afatinib Giotrif, Boehringer Ingelheim - ATPmimics - Korsreaktivitet - Oral applicering, aktiv intracellulärt, kort halveringstid 11
Små molekylära inhibitorer P ATP RTK ATPmimics tex Erlotinib, Gefitinib 12
EGFR-inibitorer (Erlotinib) vid lungcancer 100 Patienter efter cytostatika BR.21-trial 80 Erlotinib Placebo överlevnad [%] 60 40 Placebo Medianöverlevnad: 1-årsöverlevnad: Respons: Erlotinib 6.7 m 30% 9% p < 0.001 4.7 m 20% 1% 20 0 0 6 12 18 24 månader Shepherd et al., 2005, NEJM 13
Vilka har nytta av behandling? Respons var bättre hos kvinnor, icke-rökare, asiater, adenocarcinom EGFR-IHC analys: 57% positiv i IHC? EGFR-FISH : 45% amplifikation eller polysomi EGFR-mutation: 10-22% KRAS-mutation: 10-25% Tsao et al., NEJM, 2005 14
Molekylära markörer för terapirespons EGFR-mutation 5-15% i Europa, 20-40% i Asien 0-2% SCC, 10%-25% AC 60% (30-100%) av responders är muterade 7% av non-responders är muterade Distribution / frekvens: 50% 45% G719C DEL E746-A750 T790M D761Y L858R 18 19 20 21 Sequist et al., JCO, 2007 Modifierad från Yamamoto et al., Lung cancer, 2008 15
SATURN-studien Erlotinib EGFR-mutation som prediktor för terapirespons n=437 Ingen mutation (wt): 388 patienter (89%) EGFR-mutation: 49 patienter (11%) wild-type EGFR mutated EGFR 1.0 0.8 1.0 0.8 p<0.0001 Erlotinib (n=22) 0.6 0.4 Erlotinib (n=199) Placebo (n=189) PFS 0.6 0.4 0.2 0.2 Placebo (n=27) 0 0 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 9 veckor Progression free survival veckor 16
Molekylärpatologiskt utlåtande: Molekylärpatologisk undersökning - mutationsanalys EGFR (remiss XXX från XXX): Genomiskt DNA extraherades från paraffininbäddad vävnad, kloss XXX (tumörcellhalt X% efter makrodissektion) med Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit. Mutationsanalys utfördes med Therascreen EGFR RGQ Kit. Mutationer som kan detekteras i EGFRgenen (exon 18-21) med metoden är p.thr790met, p.leu858arg, p.leu861gln, Ser768Ile, Gly719Ala, p.gly719ser, Gly719Cys, insertioner i exon 20 och deletioner i exon 19. Detektionsgräns (procent av muterat DNA i en wild type bakgrund) för dessa mutationer har definerats till 0,50-7,02 % (Referens: therascreen-egfr-rgq-pcr-kit--- Performance-Characteristics-EN.pdf via Qiagen.com). Ingen EGFR-mutation detekterad. Avsaknad av EGFR-mutation gör att respons vid EGFR-TKI-terapi är osannolik. Användning av fynd/analysresultat som omnämns i utlåtandet får användas för vetenskapliga publikationer endast med tillstånd av medicinskt ansvarig vid Klinisk patologi. Analysen utförd och granskad av Jennifer Jonasson och Magnus Sundström (Molekylärpatologi). 17
Hudcancer Efter bröst- och prostata-cancer är hudcancer den vanligaste cancerformen i Sverige Malignt melanom utgör 9% av all hudcancer Ref: Socialstyrelsen, Cancerfonden 18
Statistik Malignt melanom Hudcancer är den cancerdiagnos som ökar snabbast 19
Signaltransduktion 20
Signaltransduktion i melanom Ref: Girotti, Cancer Discov, 2013 21
Kopplingen mutationer och melanom Ref: Veer et. al, Mol Cell Bio, 1989 Ref: Davies et. al, Nature, 2002 22
Cancer Genome Project (Sanger Institute, Cambridge) Screen (1) of 15 cancer cell lines -The melanoma cell line had BRAF mut Screen (2) of 530 cancer cell lines -59% of melanomas mutated -Also mutations in CRC, LC (AC), ovarian etc Screen (3) of 378 primary cancers 2014: 50% of melanomas and papillary thyroid cancer, 12% of CRC and 7% of ovarian cancer have BRAF mut 23
Malignt melanom - BRAF-mutationer 24
Malignt melanom - Vemurafenib FDA approved in 2011 for BRAF induced MM Small molecular inhibitor Intracellular and active against mutated BRAF Vemurafenib = V600E mutated BRAF inhibitor 25
Signaltransduktion i melanom Vemurafenib Ref: Girotti, Cancer Discov, 2013 26
BRAF is a serine/threonine kinase ATP ATP Inactive BRAF kinase domain, ATP don t fit Active BRAF kinase domain 27
Hur fungerar Vemurafenib? ATP Vemurafenib is a small molecular inhibitor. Binds to mutated (activated) BRAF. Similar action as Gefitinib and Erlotinib. 28
Behandling av melanom 29
Behandling med Vemurafenib Progression free survival n=549 All were BRAF mutated (codon 600) Response rate to Vemurafenib: 47% Fyra av tio patienter med V600K svarade också Chapman et al. NEJM, 2011 30
Analys av BRAF V600 Metoder CE/IVD labeled LOD Cobas (RT-PCR) 5% Pyrosequencing 2-5% Rotor-Gene Q (RT-PCR) 2-4% Enterogen (RT-PCR) 1% Vienna Strip assay (PCR+Hyb) 1% DiaCarta (PNA RT-PCR) 0.1% Anagnostics (PCR+Hyb) 1% Conformité Européenne ( i överensstämmelse med EU-direktiven ) IVD In Vitro Diagnostic Medical Device Produkten uppfyller väsentliga krav ang. säkerhetsaspekter för kliniska prestanda, märkning, manualer etc. 31
Analys av BRAF V600 Metoder Others LOD Sanger sequencing 10-20% Pyrosequencing 2-5% NGS 1-5% Realtids PCR 1-5% Sequenom (Mass Spec) 10%? HRM 5%? 32
Other inhibitors for MM patients Cobimetinib 33
Delaying drug resistance N Engl J Med. 2014 Sep 29. Förbättrad medianöverlevnad från 6,2 till 9,9 månader 34
Mutationsanalyser i Uppsala - statistik 500 450 400 350 Analys / år 300 250 200 150 100 50 KRAS BRAF EGFR NRAS NGS 0 08 09 10 11 12 13 14 15 35
Molekylärpatologiskt utlåtande: Molekylärpatologisk undersökning - mutationsanalys av EGFR, KRAS, NRAS, BRAF och PIK3CA (remiss från ). Genomiskt DNA extraherades (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Qiagen) från paraffininbäddad vävnad, kloss XXX (patologavdelning). Tumörcellshalt % (efter manuell mikrodissektion). Efter extraktion konstruerades ett sekvenseringsbibliotek med hjälp av en etablerad HaloplexTM DiagnPanel_Lung_20150409. I denna panel anrikas och amplifieras DNA-fragment som representerar alla kodande exon i 18 st cancerassocierade gener för sekvensering med ett MiSeq-instrument (Illumina). Vid lungcancer analyseras och rapporteras aktiverande mutationer i kodon 12, 13, 59, 61, 117 och 146 i KRAS (referenssekvens NM_004985) och NRAS (referenssekvens NM_002524), kodon 600 i BRAF (referenssekvens NM_004333), hotspotmutationer i exon 18-21 i EGFR (referenssekvens NM_005228), samt aktiverande mutationer i exon 9 och 20 i PIK3CA (referenssekvens NM_006218). P.g.a. suboptimal täckning i panelen av EGFR kodon 790 analyseras denna position vid behov även med Therascreen EGFR RGQ kit. Sekvensdata analyserades med Burrows- Wheeler aligner (BWA) version 0.7.12, SNPmania version 0.0.7-SNAPSHOT-amplicons_v4, och Pindel version 0.2.4w. Sekvenstäckningen av regionerna beskrivna ovan kontrollerades i en separat screening. Kriterier för rapport av positivt mutationsfynd: 5 % vid sekvensdjup 300 (täckning i minst två oberoende amplikon). Negativt fynd: < 5 % vid sekvensdjup 300 (täckning i minst två oberoende amplikon). Fynd < 5 % respektive fynd baserade på suboptimal täckning eller bortfall av amplikon kan kommenteras nedan. Resultat: Mutation detekteras i EGFR exon 20, kodon (c. p.) (insertion) Insertioner i exon 20 (som ensamma aberrationer i EGFR genen som i detta fall) är betraktade som "resistensmutationer", men är associerade med respons i vissa fall, exempelvis vid behandling med Afatinib (Yang et al., 2015. Lancet Oncol 16(7):830-8). Ingen mutation hittades i övriga kodon i KRAS, NRAS, BRAF eller PIK3CA. Analysen utförd och granskad av Lotte Moens och Magnus Sundström. Användning av fynd/analysresultat som omnämns i utlåtandet får användas för vetenskapliga publikationer endast med tillstånd av medicinskt ansvarig vid Klinisk patologi. 36
Vad ska man veta? Targeted therapy är mest effektiv vid störd proteinfunktion (tex pga mutation, amplifiering eller translokation) Tumörernas tillväxt styrs ofta av aktiverade signaleringsproteiner KRAS / BRAF / EGFR-mutationer, ALK-translokation. Nya cancerläkemedel finns som blockerar cellulär signalering Erlotinib, Gefitinib, Cetuximab, Panitumumab, Vemurafenib Klassiska histologiska tumörtyper består av molekylära subtyper CRC: muterad / omuterad KRAS NSCLC: muterad / omuterad EGFR; ALK-translokation Malignt melanom: muterad / omuterad BRAF 37
Vad ska man veta? Endast patienter med vissa subtyper av specifik cancer har ev. nytta av målinriktad behandling Mutationsstatus eller translokation kan vara avgörande Molekylärpatologiska analyser krävs inför behandlingsbeslut Ex. FISH eller mutationsanalyser (målprotein / signaleringsprotein) 38