Detection of Honey Bee Viruses in Apis mellifera and Apis cerana Malin Lindström

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete C-nivå, Vt 11 Detection of Honey Bee Viruses in Apis mellifera and Apis cerana Malin Lindström Handledare: Eva Forsgren, Sveriges Lantbruksuniversitet

ABSTRACT Two species of bees in the genus Apis, real honey bees, has long been of interest for man. These two are the European honey bee, Apis mellifera, and the Asian honey bee, Apis cerana. In Vietnam, beekeeping is of great importance, both with A.cerana and A.mellifera. The aim of this project was to investigate if the introduction of the European honey bee in Asia has affected the Asian honey bee, and whether different pathogens from A.mellifera have been transferred to A.cerana. Totally 40 samples, 20 from every species, were analysed for 8 different viruses. RNA was extracted and analysed with qrt-pcr. The results showed that 5 different viruses were present in the samples, DWV, CBPV, BQCV, SPV and SBV. SPV and SBV were only found occasionally while DWV, CBPV and BQCV were present in the majority of the samples. Differences in virus titres between the two bee species were significant for CBPV and BQCV, however the result for DWV titres was not considered significant. DWV therefore seem to be a ubiquitous virus in Vietnamese beekeeping irrespective of species. Further, the results cannot describe the influence or origin of the viruses but only confirm their presence. Additional investigations are needed in order to answer this question. Keywords: qrt-pcr, Vietnam, RNA virus, SYBR Green, Mann Whitney s U-test.

INTRODUKTION Det finns många olika arter av bin och några av dessa skapar samhällen bestående av flera tusen individer. Dessa bisamhällen består av en drottning, omkring 40 000 60 000 arbetsbin och några hundra drönare. Arbetsbina är icke-reproducerande honor som bland annat samlar in nektar och pollen. Drönare är haploida hanar som endast har till uppgift att befrukta drottningen. Varje enskilt bi lever som individ i samhället, men på egen hand klarar de sig inte länge. Det krävs minst några hundra arbetsbin och en drottning för att ett samhälle ska kunna fungera och expandera [1]. Två arter av bin inom genuset Apis, äkta honungsbin, har länge uppmärksammats av människan. Dessa två är det europeiska biet, Apis mellifera, och det liknande men mindre till storleken, asiatiska honungsbiet, Apis cerana [2]. Under de senaste århundradena har det europeiska honungsbiet transporterats över hela världen medan det asiatiska honungsbiet är begränsat till Södra Asien, Kina, Östra Ryssland och Japan. Dessa bins förmåga att producera honung gör att de är av stort intresse för människan [3]. De är även en av de viktigaste pollinatörerna och detta innebär att en stor mängd av alla livsmedel som människan konsumerar är beroende av honungsbin [1]. Det ekonomiska värdet av denna pollinering har uppskattats till flera miljarder dollar. Dessa för människan viktiga bisamhällen hotas av en rad olika patogener vilket anses kunna vara en av orsakerna till att antalet bisamhällen på senare år har minskat. Kunskap vad gäller bland annat epidemiologi hos dessa patogener är otroligt viktigt för att förhindra sjukdomsutbrott [4]. I Asien, och även i Vietnam, har biodling länge varit tradition. SLU har just nu ett pågående samarbete med Bee Research and Development center (BRDC), en statlig organisation som har aktiviteter kring biodling i hela Vietnam. Arbetet syftar till att förbättra vietnamesisk honungsproduktion och även till att bidra till utvecklingen på landsbygden med hjälp av förbättrade biodlingsmetoder. Över 80 % av honungsproduktionen sker med A.mellifera men

även biodling med den mindre produktiva A.cerana är av stor betydelse. Sedan man införde det europeiska honungsbiet i Asien vet man inte hur det har påverkat det asiatiska honungsbiet. Syftet med denna studie är att undersöka om införseln kan ha fört över sjukdomar från A.mellifera till A.cerana. Man vill även undersöka om olika patogener från A.cerana kan ha anpassat sig till A.mellifera [5]. Bland de olika patogener som finns utgör virus ett stort hot mot honungsbin. Infektioner kan angripa flera utvecklingsstadier såsom ägg, larver, puppor och även vuxna bin. Normalt finns dessa virus som latenta infektioner och ger inte upphov till några synliga symptom. Intresset för virusinfektioner har dock tagit fart i samband med att det parasiterande kvalstret Varroa destructor påträffats hos det europeiska honungsbiet. Virus som replikerar sig vid injektion i binas kroppsvätska har genom kvalstret fått en helt annan genomslagskraft. Kvalstret föder sig på och rör sig regelbundet mellan bin och är därmed en viktig smittväg. Dessutom inducerar kvalstret replikering av virus hos bin med latenta infektioner. Flera virusinfektioner kan övergå från en latent infektion utan påvisbar effekt till att bli akut och symptomgivande, bara genom att skada huden eller genom att injicera främmande protein i kroppsvätskan. Varroakvalstrets födosök innebär just sådana skador samt att främmande substanser kommer in i kroppsvätskan [1]. Hittills har totalt ca 18 olika bivirus identifierats, de flesta av dessa är enkelsträngade RNA virus [6]. De vanligast förekommande av dessa 18 är Deformed Wing Virus (DWV), Black Queen Cell Virus (BQCV), Kashmir Bee Virus (KBV), Sacbrood Virus (SBV), Slow Bee Paralysis Virus (SPV), Acute Bee Paralysis Virus (ABPV), Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV) och Israeli Acute Bee Paralysis Virus (IABPV). Dessa virus är mest välbeskrivna och även kända för att vara mest skadliga för bin [6,7].

DWV finns spritt över hela världen [8]. Majoriteten av de infekterade bina får inga symptom men som namnet antyder så kan bina ha deformerade vingar [7]. ABPV, KBV och IABPV tillhör alla ett komplex av nära besläktade virus. ABPV och KBV är noga studerade vad gäller spridning och patologi, medan IABPV nyligen lades till i denna grupp. Dessa tre är spridda världen över, men generellt verkar ABPV vara den mest förekommande av dessa tre i Europa [9]. Dessa tre virus verkar även vara mindre förekommande än de allra vanligaste, som DWV, BQCV och SBV. CBPV har detekterats från varje kontinent förutom Sydamerika [10]. Tillsammans med ABPV var de två de första som blev isolerade [11]. SBV hos A.mellifera har varit känt sedan 1964. Hos A.cerana upptäcktes den först 1976 i Thailand och på grund av vissa skillnader hos virusen så döptes denna till Thai Sacbrood Virus (TSBV) [12,13]. SPV är ett relativt ovanligt virus som enbart hittats i England, Fiji och västra Samoa. SPV är ett av de virus som anses vara kopplat till kvalstret V. destructor [14]. BQCV är en av de mest förekommande virusinfektionerna och det har påvisats i Norra Amerika, Central Amerika, Europa, Asien och mellanöstern [10]. En viktig aspekt hos dessa virusinfektioner är hur själva smittspridningen går till. På grund av att bin är sociala insekter och lever mycket nära varandra med många sociala interaktioner, finns det många möjligheter för smittspridning. Generellt kan överföring av virus ske horisontellt och vertikalt. Med horisontell smittspridning menas smitta som överförs mellan individer inom en generation. Denna typ av spridning kan sedan delas in i indirekt eller direkt smitta. Direkt horisontell smitta innebär infektion som smittar via föda som är kontaminerad och dessa bin kan sedan föra vidare infektionen via avföringen. Indirekt horisontell smitta kan ske via en annan värdorganism (vektor), till exempel kvalstret V. destructor [12]. Vertikal spridning innebär istället att smitta sker mellan individer mellan olika generationer [1]. Vid denna typ av smitta sprids virus från moder till avkomma, från drottning till ägg [12].

Dessa typer av smittspridning sker på individnivå, men när det gäller bisamhällen, finns det även smittspridning på koloninivå. Detta innebär att spridningen sker mellan olika samhällen. Horisontell spridning på koloninivå sker till exempel när ett smittat bi flyger in i fel samhälle eller när de rövar foder från ett annat samhälle. Vertikal smittspridning på koloninivå sker istället när samhällen svärmar. Detta innebär att den äldre drottningen lämnar samhället tillsammans med några av arbetarbina och drönarna och skapar ett nytt samhälle. Detta sker när det gamla bisamhället har en ny drottning på gång [1]. För att kunna utföra virusanalyser hade prover samlats in från olika platser i Vietnam. Proverna hämtades från områden där man enbart hanterar A.cerana och även platser där både A.cerana och A.mellifera hanteras tillsammans. Samtliga prov analyserades för åtta olika virus; DWV, ABPV, KBV, IABPV, CBPV, SPV, SBV och BQCV. DNA/RNA extraherades från proverna. Det DNA som extraherades användes till analys av andra patogener (bakterier och mikrosporidier) och är inte relevant vid analysering av virussjukdomar. Efter extraktionen utfördes qrt-pcr för att undersöka om proverna var positiva för något av de åtta virusen. METOD OCH MATERIAL Provmaterial 40 bitarmar från A.cerana och A.mellifera analyserades. Dessa hade samlats in oktober 2010 från olika platser i Vietnam och frysförvarades efter detta i RNAlater (QIAGEN). RNA/DNA Extraktion Innan preparation förbereddes extraktionsroboten (QIAcube, QIAGEN, Venlo, Nederländerna) enligt aktuellt protokoll (All Prep DNA/RNA mini kit(qiagen) eller Rneasy mini kit(qiagen)). Tarmbitarna placerades i 2mL rundbottnade plaströr och krossades med

en teflonmortel. Röret doppades ned i flytande kväve och tarm-materialet mortlades sedan ytterligare. 350μL RLT-buffert blandat med 14,3M β-merkaptoetanol (1mL RLT buffert blandat med 10μL β-me) tillsattes till varje rör. Detta mortlades tills det var homogent. Rören placerades i extraktionsroboten och aktuellt protokoll startades beroende på om RNA eller RNA/DNA extraherades. Efter genomgånget program togs 1,5mL uppsamlingsrören ut och kolonnerna kastades. Mängden extraherat RNA alikvoterades i 2 rör med 25μL i varje och förvarades i -80C. qrt-pcr Virus En mastermix tillräcklig för antalet prov förbereddes med hjälp av iscript TM One-Step RT- PCR Kit With SYBR Green (BIORAD). I eppendorfrör blandades 1x IQ SYBRGreen mix, 0,2μM primer F, 0,2μM primer R, 1x reverse transcriptase. Totalvolymen justerades till 20μL med hjälp av nukleasfritt vatten. Blandningen vortexades och centrifugerades. 17μL av varje mastermix pipetterades på korrekt plats i en PCR-platta(96-håls platta). Till varje brunn tillsattes sedan 3μL prov till en total reaktionsvolym på 20μL. Som negativ kontroll användes nukleasfritt vatten och som positiv kontroll användes syntetiskt virus-rna. β-actin inkluderades även i körningen för att kontrollera kvaliteten på RNA. En PCR(Chromo4 TM Real-time PCR Detector (BIORAD, Californien, USA)) utfördes med följande program: cdna syntes, 50C i 10min; Reverse transcriptase inactivation, 95C i 5min; följt av 40 cykler av PCR cycling and detection, 58C i 30sek; smältkurvsanalys 1min i 95C, 1min i 45C, 10sek i 45C. Efter körningen förvarades PCR- plattan i -18C för eventuell sekvensering senare. Bearbetningen av resultaten utfördes med programmet Opticon Monitor 3. Cq värdena (quantification cycle) gjorde det möjligt att urskilja skillnader i ursprungsmängd och med hjälp av smältpunkter, T m, särskiljdes rätta produkter från eventuella specifika produkter.

Tabell 1. Primers som användes till qrt-pcr. ASSAY PRIMER SEQUENCE (5-3 ) DWV complex DWV ABPV KBV IABPV BQCV CBPV SBV SPV B-actin mrna DWV-F1153 DWV-B1806 DWV-F1425 DWV-B1806 ABPV-F6548 KIABPV-B6707 KBV-F6639 KIABPV-B6707 IAPV-F6627 KIABPV-B6707 BQCV-qF7893 BQCV-qB8150 CBPV1-qF1818 CBPV1-qB2077 SBV-qF3164 SBV-qB3461 SPV-F3177 SPV-B3363 Am-actin2-qF Am-actin2-qB ATTAAAAATGGCCTTTAGTTG CTTTTCTAATTCAACTTCACC CGTCGGCCTATCAAAG CTTTTCTAATTCAACTTCACC TCATACCTGCCGATCAAG CTGAATAATACTGTGCGTATC CCATACCTGCTGATAACC CTGAATAATACTGTGCGTATC CCATGCCTGGCGATTCAC CTGAATAATACTGTGCGTATC AGTGGCGGAGATGTATGC GGAGGTGAAGTGGCTATATC CAACCTGCCTCAACACAG AATCTGGCAAGGTTGACTGG TTGGAACTACGCATTCTCTG GCTCTAACCTCGCATCAAC GCGCTTTAGTTCAATTGCC ATTATAGGACGTGAAAATATAC CGTGCCGATAGTATTCTTG CTTCGTCACCAACATAGG Statistiska beräkningar För att tolka resultaten och jämföra de olika grupperna utfördes statistiska beräkningar med hjälp av Excel och GraphPad Instat. Med dessa program beräknades medianen och med hjälp av metoden Mann Whitneys U-test beräknades signifikanta skillnader. RESULTAT Totalt analyserades 40st prover för åtta olika virus, DWV, ABPV, SBV, BQCV, CBPV, KBV och SPV. Dessa 40 prover delades in i två grupper bestående av 20 prov vardera, en grupp med prov från A.cerana och en med prov från A.mellifera. Antalet positiva prover visas i figur 1 där skillnader mellan de två olika arterna även visas.

25 20 Antal positiva 15 10 5 A.mellifera A.cerana 0 DWV ABPV SBV BQCV CBPV KBV SPV Figur 1. Antal positiva prov för varje virus från de två olika grupperna bestående av 20 prov från A.mellifera och 20 från A.cerana. Vid PCR analysen fick varje positivt prov ett specifikt C (t) värde. Från dessa värden räknades medianen ut för varje grupp och dessa resultat redovisas i figur 2 nedan. Figur 2. Median av C (t) värdena beräknat från de virus som var mest förekommande hos A.mellifera och A.cerana. En jämförelse gjordes även mellan dessa grupper och P-värdet för DWV blev 0,38, för BQCV <0,0001 *** och för CBPV 0,045 *. En jämförelse gjordes även mellan A.cerana och A.mellifera för DWV, BQCV och CBPV och P-värden erhölls genom ett Mann Whitneys U-test. P-värdet för DWV- resultaten blev 0,38, för BQCV <0,0001 *** och för CBPV 0,045 *. Signifikansnivån sattes till 0,05.

DISKUSSION I denna pilotstudie ingick 40 olika prover bestående av bitarmar från både A. cerana och A. mellifera. Dessa prover samlades in oktober 2010 från olika platser i Vietnam och analyserades sedan för åtta olika virus, DWV, BQCV, IABPV, ABPV, KBV, SBV, SPV och CBPV. Dessa analyser utfördes med hjälp av qrt-pcr efter att RNA hade extraherats. Flera metoder har tidigare använts för att detektera bivirus. Vanligast var förr att man använde serologiska metoder, till exempel ELISA och immunodiffusionstest [15]. På senare år har man däremot mer och mer gått över till molekylärbiologiska metoder då dessa är ett mycket bra alternativ då de är snabba, specifika och reproducerbara. PCR som framförallt används sparar mycket tid, speciellt då stora mängder prov analyseras och därmed effektiviseras analyserna och gör det möjligt att få snabba svar. Idag finns PCR utvecklat för större delen av de bivirus man har upptäckt [16]. Nackdelen med PCR är dock att metoden är så känslig att man även kan detektera icke levande virus. Detta gör att det inte är möjligt att urskilja aktiva infektioner. På grund av den höga känsligheten så är metoden även känslig för kontaminering och förarbetet är därmed ett kritiskt moment som kräver särskilda rutiner. Resultaten från analyserna med qrt-pcr gav positivt utslag för DWV, BQCV, CBPV, SBV och SPV. SPV och SBV påträffades bara i enstaka prov medan DWV, BQCV och CBPV påträffades i större delen av proverna, se figur 1. CBPV har aldrig tidigare påträffats hos A.cerana. Det asiatiska honungsbiets sjukdomar är överlag relativt outforskade i jämförelse med det europeiska, men man har tidigare identifierat fem olika virus hos A.cerana; Apis Iridescent Virus (AIV), BQCV, DWV, KBV och Thai Sacbrood Virus (TSB) [17]. Dessa resultat är baserade på C (t) - värden som erhölls med hjälp av qrt-pcr. Under projektets gång stötte vi dock på ett problem med kontaminering av BQCV och CBPV. Detta innebär att alla dessa C (t) värden inte är helt att lita på. Efter att ha studerat de olika resultaten

drog vi slutsatsen att dessa prover var positiva från början eftersom C (t) värdena var annorlunda i jämförelse med kontamineringen. Nästa gång bör man tänka på att under extraktionens gång byta de buffertar man använder med jämna mellanrum inklusive de kärl de är förvarade i, och åtminstone varannan extraktion inkludera en negativ kontroll för att se så att ingen kontaminering äger rum. Det man dessutom kan tänka på vid fortsatta studier är att man kan få ett säkrare resultat genom att analysera en större mängd bin. Detta kan man göra genom att poola ihop ett antal bitarmar och köra det som ett prov, i detta fall använde vi enbart 1 bitarm per prov. Från de C (t) värden som erhölls utfördes statistiska beräkningar för att få fram P-värdet. För att göra detta användes en icke- parametrisk metod, kallad Mann Whitneys U-test. En icke parametrisk metod användes på grund av att resultaten inte är normalfördelade. Det kan mycket väl vara vitt spridda värden mellan de olika proverna (något enstaka bi kan innehålla mycket stora mängder av virus medan andra är negativa) och därför är det bättre att räkna median och inte medelvärde som tar hänsyn till de extrema värdena. Med icke parametriska metoder kan man jämföra två grupper och ta hänsyn till slumpens inverkan. Ett Mann Whitneys U-test utgår ifrån att det är två oberoende slumpmässiga urval. Utifrån detta test fick vi fram P-värden för de olika grupperna. I detta fall sattes signifikansnivån till 0,05 vilket innebär att vi har en säkerhet på 95 %. Ett resultat som överskrider detta värde inte är signifikant. Därmed, eftersom resultatet för DWV blev 0,38, är slutsatsen att det troligtvis inte är någon skillnad mellan de båda grupperna vad gäller förekomst av detta virus. Emellertid så ser man att DWV är vanligt förekommande hos båda arterna och detta överensstämmer med resultat från andra liknande studier som har utförts på Apis mellifera i Danmark och Thailand [18,19]. När det däremot gäller CBPV och BQCV så fick vi signifikanta skillnader mellan grupperna. För CBPV blev P-värdet 0,045 och räknas

som signifikant. Hos BQCV så blev värdet <0,0001 och räknas som extremt signifikant. Hos båda grupperna verkar virusmängderna vara störst hos A.mellifera. Representativa prover från dessa resultat bör skickas till sekvensering för att konfirmera PCR- produkterna, samt för att jämföra sekvensen hos det för första gången isolerade CBPV hos det asiatiska biet med de sekvenser som hittats i A. mellifera. Sammanfattningsvis kan man säga att trots problemet med kontaminering uppmuntrar denna pilotstudie till vidare undersökningar, för att förhindra förluster orsakade av sjukdomar hos dessa bin. CBPV påträffades hos A.cerana för första gången och detta ger bara ett större intresse för vad som mer kan ha anpassat sig hos de olika arterna. Dessutom kan man inte utifrån dessa undersökningar säga vad dessa virusinfektioner har för påverkan utan man bekräftar bara deras närvaro. Flera undersökningar behövs för att kunna göra detta, även experimentella studier. För att få säkrare resultat bör även fler prover av större mängd samlas in och man bör dessutom se till att få prover från platser där arterna har varit isolerade och även från platser där de varit i kontakt med varandra. I detta fall jämfördes bara de två arterna med varandra utan att ta hänsyn till från vilka platser de samlats in ifrån. Att sedan flytta isolerade kolonier av A. cerana till områden med A. mellifera för att se om virus överförs mellan arterna vore ett starkare bevis för en sådan hypotes.

REFERENSER [1] Sjukdomar, parasiter och skadegörare i bisamhället, Fries I, Kristiansen P, Förenade Bigårdars Förlag (2009); ISBN 978-91-633-552-3. [2] Honey Bee Pathology, Bailey L, Ball BV, Academic press (1991); ISBN 0-12-073481-8. [3] Kajobe R, Marris G, Budge G et al. 2010. First molecular detection of a viral pathogen in Ugandan honey bees. Journal of Invertebrate Pathology. 104: 153-156. [4] Kukielka D, Sánchez-Vizcaino JM. 2009. One-step real-time quantitative PCR assays for detection and field study of Sacbrood honeybee and acute bee paralysis viruses. Journal of Virological Methods. 161: 240-246. [5] Fries I. 2011. Biodling i norra Vietnam. Bitidningen. 3:19-21. [6] Boncristianti H, Prisco G, Pettis J et al. 2009. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virology Journal. 6: 221 [7] Berényi O, Bakonyi T, Derakhshifar I et al. 2006. Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries. Applied and environmental microbiology. 72: 2414-2420 [8] Bowen-Walker P.L, Martin S.J, Gunn A. 1998. The transmission of Deformed Wing Virus between Honeybees (Apis mellifera L.) by the Ectoparasitic Mite Varroa javobsoni Oud. Journal of Invertebrate Pathology. 73: 101-106. [9] de Miranda JR, Cordani G, Budge G. 2010. The acute bee paralysis virus-kashmir bee virus- Israeli acute paralysis virus complex. Journal of invertebrate pathology. 103: 30-47 [10] Chen Y.P, Siede R. 2007. Honey Bee Viruses. Advances in Virus Research. 70: 33-79. [11] Ribière M, Oliver V, Blanchard P. 2010. Chronic bee paralysis: A disease and a virus like no other? Journal of Invertebrate pathology. 103: 120-131. [12] Chen Y, Evans J, Feldlaufer M. 2006. Horizontal and vertical transmission of viruses in the honey bee. Journal of Invertebrate Pathology. 92: 152-159. [13] Verma LR, Rana BS, Verma S. 1990. Observations on Apis cerana colonies surviving from Thai Sacbrood Virus infestation. Apidologie. 21: 169-174. [14] De Miranda JR, Dainat B, Locke B et al. 2010. Genetic characterization of slow bee paralysis virus of the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of General Virology. 91: 2524-2530. [15] Chen YP, Higgins JA, Feldlaufer MF. 2004. Quantitative Real-Time Reverse Transcription-PCR Analysis of Deformed Wing Virus Infection in the Honeybee (Apis mellifera L.). Applied and environmental microbiology. 71: 436-441.

[16] Grabensteiner E, Bakonyi T, Ritter W. 2006. Development of a multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of three viruses of the honeybee (Apis mellifera L.): Acute bee paralysis virus, Black queen cell virus and Sacbrood virus. Journal of Invertebrate Pathology. 94: 222-225. [17] Allen M, Ball B. 1996. The incidence and world distribution of honey bee viruses. Bee world. 77: 141-162. [18] Sanpa S, Chantawannakul P. 2009. Survey of six bee viruses using RT-PCR in Northen Thailand. Journal of Invertebrate Pathology. 100: 116-119. [19] Nielsen SL, Nicolaisen M, Kryger P. 2007. Incidence of acute bee paralysis virus, black queen cell virus, chronic bee paralysis virus, deformed wing virus, Kashmir bee virus and sacbrood virus in honey bees (Apis mellifera) in Denmark. Apidologie. 39: 310-314.