EQUALIS Användarmöte, Molekylärdiagnostik 2012 Quality Hotel, Ekoxen, Linköping 7 8 november, 2012 DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER Majid Osman, kemist, PhD Klinisk kemi, Linköping
DNA stabilitet Provtagning Extraktion Rör DNA integritet Medium Transport Analysresultat Förvaring
Rör Laboratoriemedicin Färgkoder för säkerhetskork på vakuumrör för provtagning av venöst blod enligt SVENSK STANDARD SS-872805
Förvaring av blod för DNA-analys Rumstemperatur +4 C -20 C -80 C DNA yields after blood storage. DNA was purified in triplicate from 300 µl fresh whole blood preserved in ACD, EDTA, or heparin on day 0 and after storage for 3 days, 1 week, 2 weeks, or 4 weeks at room temperature (22 C), 4 C, 20 C, or 80 C using the Gentra Puregene Blood Kit. (http://www.qiagen.com)
ph och jonstyrka påverkar DNAstabilitet DNA skador Depurinering, (depyrimidinering) hydrolys Deaminering Oxidativ attack Icke-enzymatisk metylering Nature 1993;362(6422):709 715.
ph och jonstyrka påverkar DNAstabilitet TE-buffert (ph 9.0) Nucleas-fri H 2 0 (ph 6 7) DNA was eluted in Buffer AE or water, and stored for 8 years at 2 8ºC or 20ºC. M: marker (λ HindIII). http://www.qiagen.com
Extraktion av DNA från blod Lysering av celler (helblod/ buffy coat) Detergenter, salter, alkalisk behandling, etc. vätske-vätske extraktion Kolonnfiltrering Magnetisk rening Centrifugering Etanolfällning Centrifugering Centrifugering/ vakuum Tvätt Eluering med H 2 O/ TE-buffert Tvätt Eluering med H 2 O/ TE-buffert
Hur mycket DNA kan vi få från blod? En diploid cell innehåller ~ 6 pg DNA (haploider ~ 3 pg). En vuxen person har 3,5 8,8 x 10 9 leukocyter/l blod. Teoretiskt utbyte: 21 53 ng DNA/µL blod.
Hur mycket DNA får vi? Jämförelse mellan 3 DNA extraktionsrobotar Instrument Teknik Företag Utbyte (ng DNA/µL blod) EZ1 Biorobot MagNA Pure LC system iprep Purification Instrument Magnetisk partiklar Magnetisk partiklar ChargeSwitch ligand Qiagen 20 40 Roche 19 36 Life Technologies upptill 43
Hur mycket DNA behöver vi? Jämförelse mellan olika qpcr kemi* Kemi LOD (# kopior DNA) TaqMan (probe baserad) 20 100 LNA (probe baserad) 4 20 CPT (probe baserad) 20 400 LUX (fluorescerande primer) 4 200 Plexor (fluorescerande primer) 4 100 LOQ (# kopior DNA) Gasparic et al. BMC Biotechnology 2008, 8:26 *Transkript=Växt-invertas LOD: Limit of detection (detektionsgräns) LOQ: Limit of quantification (lägsta kvantifierbara mängd)
PCR-inhibitorer i DNA prover Heparin Polyaminer Polysackarider Fenoler Hemolys (hemgruppen) SDS Proteinase K Guanidinium Natriumacetat M. fl. Ursprung: provrör blod extraktionsreagens etc
PCR-inhibitorer i DNA prover NTC Ospätt A 10 spätt A Ospätt B Marker 10 spätt B Ospätt C 10 spätt C En okänd PCRinhibitor förhindrar sekvensamplifiering Inhibitorn späds ut och sekvensen kan amplifieras
Inhibitorer ändrar PCR-effektivitet Utan inhibitor y = -3,3454x + 35,35 Effektivitet = 99% Med inhibitor y = -2,0414x + 32,243 Effektivitet = 209% E = 10^(-1/k) -1 k = lutning Lutning Effektivitet -3,20 105% -3,32 100% -3,5 93% -3,6 90% -3,8 83% -4,0 78% Acceptabel effektivitet: 90 105% ( 3.6 lutning 3.20)
Buccal DNA (DNA från kindens insida) + Enkel provtagning Lämplig för genotypning Lämplig för epidemiologiska och GWAS studier Stora inter-individuella variationer Kontaminerad av bakterie DNA Fragmentstorlek?
Tekniker för extraktion av DNA från kindceller Skrap från kindens insida/ pelleterade celler från munskölj Värmelysering, inaktivering av föroreningar i hög temperatur Kemisk lysering Salting -out Alkoholfällning, Centrifugering, m.m. Kemisk lysering Rening med Magnetisk partiklar Tvätt, eluering Kemisk lysering DNAsuspension Kolonnfiltrering Centrifugering, tvätt, eluering Epicentre Qiagen Life Technology, Qiagen Promega
Buccal DNA: inom-individ variation och kvalitet Satia-Abouta et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002, 11:1130
Kvantifiering av DNA Garcia-Closas et al. Biomarkers 2006, 11(5):472
Kvantifiering av DNA Nanodrop ger falskt förhöjda DNA mängder vid låga värden Buccal DNA extraherat med kit från Epicentre Utbyte enligt leverantören (ng/µl) 2 14 18 55 Observerade koncentrationer (ng/µl) (n = 35)