Cirkulerande tumör-dna för cancerdiagnostik -Behandlingsstyrande tester av EGFR hos patienter med icke småcellig lungcancer Gisela Helenius Laboratoriemedicinska kliniken Universitetssjukhuset Örebro
Sökning i Web of Science: Circulating tumor DNA Published Items in Each Year Citations in Each Year Last 20 years are shown
Mängden cfdna är högre och det är mer fragmenterat hos cancerpatienter jämfört mot friska Mouliere et al. High fragmentation characterizes tumor-derived circulating DNA. PLoS September 6 2011
Mekanismer bakom ctdna? Apoptos Nekros Apoptos är den ledande hypotesen med anledning av den regelbundna storleken på fragmenten <300bp MEN! också lite omdiskuterat eftersom utebliven apoptos är karaktäristiskt för cancerceller Aktiv frisläppning Stödjer hypotes om genometastasis Mittra et al. Circulating nucleic acids damage DNA of healthy cells by integrating into their genomes. J. Biosci. 40(1), March 2015, 91 111,
Olika cancertyper avger olika mängder ctdna Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Muterade fragment / 5 ml plasma Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Mutationer i olika tumörtyper (vävnad) Science (2013) 339, 1546-58
lokal vs.metastaserande sjukdom Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Mängden ctdna ökar i mer avancerad sjukdom Bettegwoda C et.al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19; 6(224)
Hur kan ctdna användas kliniskt? Screening av cancer Cancerpatienter har högre mängd ctdna och mer fragmenterat men det finns ett överlapp med exempelvis inflammatoriska tillstånd. Avger benigna tumörer ctdna? Mer forskning krävs! Diagnos Standardiseradevårdförlopp, Allvarliga ospecifika symptom Behandlingsstyrande tester Prognos Mer forskning krävs. Behövs det? Monitorering under behandling
Lungcancer Incidens 2014, 40/100000 Femårsöverlevnad, 13,6% för män och 19,4% för kvinnor Överlevnaden har inte förbättrats de sista 25 åren Men nu! TKIs mot EGFR och ALK (samt immunterapi) Icke-småcellig lungcancer (NSCLC), adenocarcinom Heterogena tumörer Nya läkemedel under utveckling mot flera av dessa avvikelser TKI mot resistensmutationen T790M
Svårigheter för behandlingsstyrande tester på vävnadsbiopsier/cytologi Finns det tillräckligt med tumörceller i biopsin? Är biopsin representativ för hela tumören eller tumörerna? Räcker materialet till efter övrig diagnostik? Vilket material ska vi analysera, primärtumör eller metastas? Uppföljning av behandling ny biopsi? STORT BEHOV AV EN ICKE-INVASIV PROVTAGNING
EGFR som behandlingsstyrande test Meta-analys baserad på 27 publikationer med parade data Plasma/serum Olika stadie FFPE/färsk frusen vävnad Olika analysmetoder Före och efter behandling Sensitivitet 0,620 Specificitet 0,959
Kommersiella tester finns, bl.a. från Qiagen Entrogen Roche Genomica Biocartis BioRad
Monitorering under behandling Marchetti et al. J Thorac Oncol. 2015;10: 1437 1443
Provmaterial för monitorering under behandling
Nya analysplattformar
LiBio -Detektering av biomarkörer i cirkulerande nukleinsyra hos patienter med lungcancer Diagnosprov Behandlingsstart, T0 Alla patienter som utreds för lungcancer får lämna samtycke och prov (blod och urin). 3-5 dagar 7-9 dagar Diagnosprover från patienter med NSCLC analyseras för EGFRmutationer. METODVALIDERING 14-16 dagar 21 dagar EGFR-muterade patienter som behandlas med EGFR TKIs följs upp enligt forskningsprotokoll. BEHANDLINGSRESPONS 35 dagar 70 dagar
Frågeställningar Vilka karaktäristika har cfdna från lungcancerpatienter jämfört med friska kontrollindivider? Finns någon skillnad mellan ctdna i plasma och i urin? Har ctdna ett diagnostiskt värde i lungcancer? Kan man använda ctdna från plasma eller urins för att monitorera patienter under behandling med TKIs? Ska man använda ett riktat test eller en bred panel? Går det att detektera fusionsgener i ctdna eller ctrna?
Vad händer i projektet nu? Provinsamling pågår Verifiering av metod för extrahering av ctdna från plasma Optimering av metoder för att mäta mängd och fragmentering Koncentrering av urinprover och verifiering av extrahering Test av protokoll för NGS Riktad panel Sekvensering av allt ccfdna
Stor variation i mängd Prov id Diagnos pg/µl pg/µl Entrogen Qubit Tapestation D1000 Ct IC 1011 CRC 687 539 27,8 1018 Kolon hyperplasi? 390 309 28,6 1023 Adenomcarcinom, EGFR neg, KRAS neg, ALK neg 1410 8940 27 1031 Skivepitelcancer 565 548 28,2 1020 Adenocarcinom, EGFR mut, Del exon 19 394 351 28,6 1017 Småcellig cancer 2630 19200 26,4 1021 Adenocarcinom, EGFR mut, L858R 665 753 27,7 1026 NSCLC cancer uns, EGFR neg, KRAS neg, ALK neg 444 244 29,5 1019 NSCLC Adenocarcinom, mol test ej möjlig 1520 4120 26,1 1032 Ej malignt 1910 953 25,8 1029 Fibrom 424 66,5 29,4 1028 Metastas småcellig cancer, pat avliden 98800 80000 19,9 1010 ej malignt 1110 875 26,9 1030 metastas adenocarcinom 728 538 28,8
Tapestation High sensitivity D1000 och D5000
Fragmenterings-PCR https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commo ns/e/e1/chromosome-dna-gene.png Mouliere et al. High fragmentation characterizes tumorderived circulating DNA. PLoS September 6 2011
Till sist ctdna för behandlingsstyrande test och monitorering under behandling är kliniskt användbart för patienter med lungcancer Kan monitorering av ctdna användas för att styra när bilddiagnostik ska användas? ctdna som prognostiskt markör fungerar nog bra men behövs det? ctdna för screening och diagnos kräver mer forskning
Frågor och tack http://www.chemknits.com/2010/01/freepatterns-by-chemknits-summary.html http://www.npr.org/sections/healthshots/2014/11/10/360342623/combining-the-dna-ofthree-people-raises-ethical-questions