COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tester P/N: 03500756 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tester P/N: 03502295 001 AVSEDD ANVÄNDNING COBAS TaqMan HBV-test, för användning med High Pure System (HPS), är ett nukleinsyraamplifieringstest in vitro för kvantifiering av hepatit B-virus (HBV) DNA i humant serum eller plasma. Testet använder High Pure System Viral Nucleic Acid Kit för manuell (Virusnukleinsyrautrustning för High Pure System) beredning av prover samt COBAS TaqMan 48 Analyzer för automatisk amplifiering och detektion. COBAS TaqMan HBV test är inte avsett att användas som screeningtest av blod eller blodprodukter för förekomst av HBV eller som diagnostiskt test för att bekräfta förekomst av HBV-infektion. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET Hepatit B-virus (HBV) är ett av flera virus som man vet kan orsaka virusspridd hepatit. Över två miljarder människor världen över har infekterats med HBV, och över 350 miljoner av dessa är kroniskt smittade bärare 1. Personer som är kroniska bärare av viruset löper hög risk för långsiktiga komplikationer av sin infektion, bland annat kronisk hepatit, cirros och hepatocellulärt karcinom 2,3,4. Serologiska markörer används allmänt vid diagnos och/eller prognos på akut eller kronisk HBV-infektion. Den vanligaste markören för HBV-infektion är förekomsten av HBV ytantigen (HBsAg). Även om personer som bär på viruset kan klara sig från HBsAG eller från att utveckla antikroppar mot HBsAg verkar de ändå löpa risk för allvarliga leverkomplikationer längre fram i livet 5,6. HBV e- antigen (HBeAg) används normalt som sekundär markör för att påvisa aktiv HBV-replikation associerad med progressiv leversjukdom. Oförmåga att avsöndra HBeAg verkar öka risken för leversjukdom i slutstadiet 7,8. Olika varianter av HBV kan antingen producera HBeAg som inte är detekterbart i serum eller förlora förmågan att bilda HBeAg även vid aktiv infektion 9. Därför kan det vara mindre effektivt att använda denna markör för att övervaka sjukdomens förlopp 10. Möjligheten att detektera HBV DNA i serum har rapporterats vara av betydelse vid prognos av följderna av akut eller kronisk HBV-infektion 11,12,13,14. Metoden kan användas för att detektera HBV DNA efter utsöndring av HBsAg 15 eller HBV som saknar serologiska markörer 16. Ett förhållande mellan serologiska markörer och HBV DNA-nivåerna har emellertid ännu inte fastställts. Effektiviteten hos en antivirusbehandling av HBV-patienter kan också bedömas med hjälp av serologiska markörer eller genom mätning av leverenzymfunktionen. Den mest direkta och tillförlitliga metoden att mäta virusets förökning är genom kvantifiering av HBV-virus-DNA i serum eller plasma 13,17,18,19. En snabb och bestående minskning av HBV DNA-nivåerna hos patienter som behandlas med alfainterferon, Lamivudin eller Ganciclovir har visat sig vara av betydelse ur prognossynpunkt för ett gynnsamt behandlingsresultat 10,20,21,22,23,24. Genom att bevaka nivåerna av HBV DNA kan man förutsäga utvecklingen av resistens mot Lamivudin 25. Därför är kvantitativ analys för mätning av HBV DNA ett värdefullt verktyg som kan användas tillsammans med andra serologiska markörer för att hantera HBV-infektion. TESTPRINCIP COBAS TaqMan HBV-test är baserat på två huvudprocesser: (1) manuell förberedelse av prover för att erhålla HBV DNA, (2) automatisk PCR-amplifiering av mål-dna med hjälp av HBV-specifika komplementära primrar samt detektion av kluvna dubbelt fluorescerande färgmärkta oligonukleotiddetektionsprober som möjliggör kvantifiering av den amplifierade HBV-målprodukten (amplicon) och HBV kvantifieringsstandard-dna som behandlas, amplifieras och detekteras simultant med provet. Master Mix reagensen innehåller primerpar och prober som är specifika för såväl HBV DNA som HBV kvantifieringsstandard-dna. Master Mix har (Mästarblandningen) utvecklats för att garantera likvärdig kvantifiering av HBV gentyp A till G. Detektion av amplifierad DNA sker med hjälp av målspecifika och kvantiterade standardspecifika dubbelt märkta oligonukleotid prober som möjliggör oberoende identifiering av HBV-amplicon och HBV-kvantiterat standardamplicon. 1

Kvantifiering av HBV-virus DNA sker enligt HBV kvantifieringsstandard. HBV kvantifieringsstandard är en icke smittsam linjäriserad plasmid som innehåller identiska primerbindningsplatser som HBV DNA-målet samt en unik probbindningregion som möjliggör urskiljning av HBV kvantifieringsstandardamplicon från HBVmålamplicon. HBV kvantifieringsstandard innefattas i varje enskilt prov och kontroll med ett känt antal kopior och förs vidare genom beredningen av proverna, PCR-amplifieringen och detektionsstegen tillsammans med HBV-målet. COBAS TaqMan 48 Analyzer beräknar antalet kopior HBV DNA i provet genom att jämföra HBVsignalen med signalen från HBV kvantifieringsstandard för varje prov och kontroll. HBV kvantifieringsstandard kompenserar för hämmande och kontrollerande effekter under berednings- och amplifieringsprocesserna så att kvantifieringen av HBV DNA i respektive prov blir korrekt. Provextraktion COBAS TaqMan HBV-test behandlar plasma- och serumprover och isolerar HBV DNA med hjälp av en generisk manuell beredning av prover som är baserad på att nukleinsyra binds till glasfiber. HBVviruspartiklarna lyseras genom inkubation vid förhöjd temperatur tillsammans med en proteas- och chaotropisk lyserings/bindningsbuffert som avsätter nukleinsyror och skyddar frisatt HBV DNA från DNaser i plasma och serum. Ett känt antal HBV kvantifieringsstandard-dna-molekyler tillsätts till respektive prov tillsammans med lyseringsreagensen. Efter detta tillsätts isopropanol till lyseringsblandningen som därefter centrifugeras genom en kolonn med ett glasfiberfilter. Under centrifugeringen binds HBV DNA och HBV-kvantiterat standard-dna till ytan på detta glasfiberfilter. Obundna ämnen, exempelvis salter, proteiner och andra orenheter i cellerna, avlägsnas genom centrifugeringen. De adsorberade nukleinsyrorna tvättas och späds med vattenlösning. 12 prover eller multiplar av dessa kan behandlas parallellt. De behandlade proverna, som innehåller HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard-dna, tillsätts till amplifierings/detektionsblandningen. HBV mål-dna och HBV kvantifieringsstandard-dna amplifieras därefter och detekteras med COBAS TaqMan 48 Analyzer med hjälp av amplifierings- och detektionsreagenserna i testutrustningen. PCR-amplifiering Val av mål Val av mål DNA-sekvens för HBV är beroende av att regioner inom HBV-genomet som uppvisar maximal sekvenskonservering över samtliga genotyper identifieras. På motsvarande sätt är valet av primrar och prober av avgörande betydelse för testets möjlighet att detektera alla kliniskt relevanta genotyper av HBV. Ett område av det delvis enkelsträngade cirkulära DNA-genomet av HBV har visat sig ge maximal konservering av DNA-sekvenser bland genotyperna. COBAS TaqMan HBV-test använder en PCRamplifieringsprimer som definierar en sekvens inom det väl konserverade området före/i HBV-genomets kärna. Amplifiering av mål Behandlade prover tillsätts amplifieringsblandningen i amplifieringsrör (K-rör) där PCR-amplifieringen sker. Termocyklern i COBAS TaqMan 48 Analyzer upphettar reaktionsblandningen för att denaturera dubbelsträngat DNA och exponera de specifika primermålsekvenserna i HBV:s cirkulära DNA-genom samt i HBV kvantifieringsstandard-dna. När blandningen svalnar hybridiseras primrama till mål-dna. Det värmestabila Thermus specie Z05 DNA polymeraset (Z05) förlänger i närvaro av Mn 2+ och ett överskott av deoxynukleotid trifosfater (dntps), bland annat deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin och deoxyuridin (i stället för tymidin) de hybridiserade primrarna längs målmallen så att en dubbelsträngad DNA-molekyl, en s.k. amplicon, bildas. COBAS TaqMan 48 Analyzer upprepar automatiskt denna process under ett angivet antal cykler, där varje cykel är avsedd att fördubbla antalet amplicon-dna. Behövligt antal cykler förprogrammeras i COBAS TaqMan 48 Analyzer. Amplifieringen sker endast i det område av HBV-genuppsättningen som ligger mellan primrarna; hela HBV-genomet amplifieras inte. Selektiv amplifiering Selektiv amplifiering av målnukleinsyra från provet uppnås vid COBAS TaqMan HBV-testet genom användning av enzymet AmpErase (uracil-n-glycosylase) och deoxyuridintrifosfat (dutp). Enzymet AmpErase känner igen och katalyserar destruktion av DNA-strängar som innehåller deoxyuridin 26, men inte DNA som innehåller deoxytymidin. Deoxyuridin förekommer inte i naturligt DNA, men finns alltid i amplicon på grund av att deoxyuridintrifosfat ingår som en av dntp:erna i Master Mixreagensen. Därför innehåller endast amplicon deoxyuridin. Deoxyuridin gör kontaminerande amplicon känsliga för destruktion av enzymet AmpErase före amplifiering av mål-dna. Eventuella ospecifika produkter som bildats efter den initiala aktiveringen av Master Mix med mangan förstörs också av AmpErase-enzymet, vilket förbättrar sensitiviteten och specificiteten. Enzymet AmpErase som ingår i Master Mix reagensen katalyserar klyvning av deoxyuridin innehållande DNA vid deoxyuridinresterna genom att deoxyriboskedjan öppnas vid position C1. Vid upphettningen i det första värmesteget i cykeln går amplicon-dna-kedjan av vid deoxyuridinets position och gör det omöjligt att amplifiera DNA. Enzymet AmpErase är inaktivt vid temperaturer över 55 C, d.v.s. genom hela värmecykeln och förstör därför inte den målamplicon som bildats under amplifieringen. 2

Detektion av PCR-produkter i COBAS TaqMan Test COBAS TaqMan HBV Test använder sig av PCR-teknik i realtid 27,28. Genom att använda dubbelmärkta fluorescerande prober kan man detektera ackumuleringen av PCR-produkt i realtid genom att övervaka den fluorescerande rapportfärgningens intensitet, när denna frigörs under amplifieringsprocessen. Proberna består av HBV och HBV kvantifieringsstandardspecifika oligonukleotider som är märkta med en rapportfärg samt en utsläckningsfärg (quencher). I COBAS TaqMan HBV Test är HBV och HBV kvantifieringsstandard-prob märkta med olika fluorescerande rapportfärger. När de dubbel-fluorescerande färgmärkta proberna är intakta hämmas rapportfluorescensen av utsläckningsfärgens närvaro på grund av energiöverföringseffekter av Förstertyp. Under PCR hybridiserar proben till en målsekvens och klyvs av den 5' 3' nukleasaktiviteten i det värmestabila Z05 DNA-polymeraset. Så snart rapport- och utsläckningsfärgen frisläpps och separeras sker inte längre någon släckning och rapportfärgens fluorescerande aktivitet ökar. Amplifieringen av HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard-dna mäts oberoende av varandra vid olika våglängder. Denna process upprepas i ett angivet antal cykler, där varje cykel effektivt ökar emissionsintensiteten av de enskilda rapportfärgerna, så att oberoende identifiering av HBV-DNA och HBV kvantifieringsstandard DNA blir möjlig. Signalens intensitet är relaterad till mängden startmaterial i början av PCR. Grundläggande om kvantifiering med COBAS TaqMan HBV Test COBAS TaqMan HBV Test ger noggranna kvantitativa resultat över ett mycket brett dynamiskt intervall eftersom övervakning av amplicon sker under amplifieringens exponentiella fas. Ju större mängd HBV i ett prov, desto tidigare stiger rapportfärgens fluorescens i HBV-proben över den basala fluorescensnivån (se Figur 1). Eftersom mängden HBV kvantifieringsstandard (QS) DNA är konstant för alla prover bör fluorescensen från rapportfärgen för HBV QS-proben visa sig vid samma cykel för samtliga prover (se Figur 2). Om amplifiering och detektion av QS påverkas genom att den hämmas av dålig provåterhämtning, dyker fluorescensen upp senare vilket gör det möjligt att justera beräknad mängd HBV-mål-DNA i motsvarande grad. Förekomsten av den specifika fluorescerande signalen rapporteras som ett kritiskt tröskelvärde (Ct). Ct definieras som det fraktionella cykelnummer där fluorescensen från rapportfärgen överstiger en i förväg fastställd tröskelnivå (angiven fluorescensnivå) och påbörjar den exponentiella tillväxtfasen för denna signal (se Figur 3). Ett högre Ct-värde tyder på en lägre mängd initial HBV-mål-DNA. En 2-faldig ökning av titer korrelerar med en minskning med 1 Ct för mål-hbv-dna, medan en 10-faldig ökning av mängden korrelerar med en minskning med 3,3 Ct. I Figur 1 visas måltillväxtkurvor för en spädningsserie virus som sträcker sig över ett 5-log 10 -intervall. När koncentrationen av viruset ökar skiftar tillväxtkurvorna till tidigare cykler. Därför motsvarar tillväxtkurvan längst till vänster den högsta virustiternivån, medan kurvan längst till höger motsvarar den lägsta virustiternivån. Figur 1 3

Figur 2 visar tillväxtkurvor för kvantifieringsstandard för prover från en virusspädningsserie som sträcker sig över ett 5-log 10 -intervall. Mängden kvantifieringsstandard som tillsatts varje prov är konstant för varje reaktion. Ct-värdet för kvantifieringsstandard är likartad oavsett mängden virus. Figur 2 Figur 3 visar ett exempel på hur fluorescensvärdena för varje cykel normaliseras för varje tillväxtkurva. Det fraktionella cykelnumret (Ct) beräknas där fluorescenssignalen korsar angiven fluorescensnivå. Figur 3 Kvantifiering av HBV DNA COBAS TaqMan HBV Test kvantiterar HBV-virus-DNA genom att använda en andra målsekvens (HBV kvantifieringsstandard) som tillsätts varje prov med känd koncentration. HBV kvantifieringsstandard är en icke smittsam linjäriserad plasmid-dna-konstruktion som innehåller fragment av HBV-sekvenser med primer bindningsregioner som är identiska med HBV-målsekvensens. HBV kvantifieringsstandard genererar också en amplifieringsprodukt av samma längd och baskomposition som HBV-mål-DNA. Den detektionsprobsbindande regionen i HBV kvantifieringsstandard har modifierats så att den särskiljer mellan HBV kvantifieringsstandard amplicon och HBV mål-amplicon. 4

Under hybridiseringsfasen av PCR i COBAS TaqMan 48 Analyzer blir proverna belysta och exciterande med filtrerat ljus och filtrerade avgivna fluorescensdata samlas in för varje prov. Avläsningarna från respektive prov korrigeras därefter för fluktuationer i instrumentet. Dessa fluorescensavläsningar skickas av instrumentet till AMPLILINK-programmet och lagras i en databas. Förkontroller används för att bestämma om HBV DNA- och HBV kvantifieringsstandard-dna-data representerar giltiga uppsättningar. Flaggor genereras om data ligger utanför förinställda gränser. När alla förkontroller är klara och godkända behandlas fluorescensavläsningarna så att Ct-värden genereras för HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard-dna. Batchens specifika kalibreringskonstanter som medföljer COBAS TaqMan HBV Test används för att beräkna ett titreringsvärde för proverna och kontrollerna baserat på CT-värdena för HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard-dna. COBAS TaqMan HBV Test är standardiserat enligt WHO:s HBV International Standard för NAT Testing 97/746 29 och titreringsresultaten rapporteras i internationella enheter (IU/ml). REAGENSER High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 tester High Pure System virusnukleinsyrautrustning (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (Lyserings/bindningsbuffert) Tris 52 % Guanidin-HCl < 1 % urea 20 % Triton X-100 Xn 52 % Guanidin-HCl (viktprocent) + Hälsoskadlig CAR (Bärar-RNA, lyofiliserat) PK (Proteinas K, lyofiliserat) + 99 % Proteinas-K, lyofiliserat Xn 99 % Proteinase-K, lyofiliserat 2 x 2 mg 2 x 100 mg Hälsoskadlig IRB (Buffert för inhibitoravlägsnande) Tris 65 % Guanidin-HCl (tillsätt 20 ml etanol) Xn 65 % Guanidin-HCl (viktprocent) + 1 x 33 ml Hälsoskadlig WASH (Tvättbuffert) Tris NaCl (tillsätt 80 ml etanol) ELB (Elueringsbuffert) 1 x 20 ml 1 x 30 ml 5

RS 4 x stycken (Kassettuppsättning för High Pure System virusnukleinsyratest) Lyseringskassett Filterrörskassett med fast avfallskassett Elueringskassett Täckkassett Handtag WR 8 x stycken (HPS avfallskassett för virusnukleinsyra) COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 tester (P/N: 03500756 190) Provförberedelse-och Kontrollreagens HBV QS 2 x 1,0 ml (COBAS TaqMan HBV kvantifieringsstandard) Tris-HCl buffert EDTA < 0,001 % linjäriserad, dubbelsträngad plasmid-dna innehållande införda HBVprimerbindningssekvenser samt ett unikt prob-bindningsområde. Amarantfärg < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [HBV hög (+) kontroll] < 0,001 % linjäriserad, dubbelsträngad plasmid-dna innehållande HBV-sekvenser. Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt testmetoder som är godkända av FDA i USA avseende antikroppar mot HCV, HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA samt HBV DNA ej detekterbara med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [HBV låg (+) kontroll] < 0,001 % linjäriserad, dubbelsträngad plasmid-dna innehållande HBV-sekvenser. Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt testmetoder som är godkända av FDA i USA avseende antikroppar mot HCV, HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA samt HBV DNA ej detekterbara med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan Negativ kontroll (human plasma)] Negativ human plasma, icke-reaktiv enligt testmetoder som är godkända av FDA i USA avseende antikroppar mot HCV, HIV-1/2, HIV p24 antigen och HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA samt HBV DNA ej detekterbara med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 Amplifierings- och detektionsreagenser HBV MMX 2 x 24 tester (COBAS TaqMan HBV Master Mix) 2 x 1,4 ml Tricinbuffert Kaliumhydroxid Kaliumacetat Glycerol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % uppströms och nedströms primrar för området före/i HBV:s kärna < 0,001 % fluorescensmärkta oligonukleotidprober specifika för HBV och HBV kvantifieringsstandard < 0,001 % oligonukleotid aptamer < 0,05 % Z05 DNA polymeras (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobiellt) 0,09 % natriumazid CTM Mn 2+ 2 x 24 tester (COBAS TaqMan manganlösning) 2 x 1,0 ml < 1,2 % manganacetat Itättika 0,09 % natriumazid 6

VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER A. FÖR IN VITRO-DIAGNOSTISK ANVÄNDNING. B. Detta test är avsett att användas med human plasma som samlats in i antikoagulant-edta och humant serum. C. Pipettera inte med munnen. D. Undvik att äta, dricka eller röka i laboratoriets arbetsområden. Använd engångshandskar, skyddsrock och skyddsglasögon när du hanterar prover och reagensutrustning. Tvätta händerna noggrant efter hantering av prover och reagensutrustning. E. Undvik mikrobiell och ribonukleas kontamination av reagens när du avlägsnar portioner från reagensflaskor. F. Användning av sterila engångspipetter och DNase-fria pipettspetsar rekommenderas. G. Samla inte reagens från olika satser eller olika flaskor inom samma sats. H. Blanda inte reagenser från olika utrustningar. I. Släng oanvända reagenser, avfall och prover enligt nationella, internationella, regionala och lokala bestämmelser. J. Använd inte utrustningen efter angivet utgångsdatum. K. Varuinformationsblad (Material Safety Data Sheets = MSDS) kan på begäran erhållas från din lokala Roche-representant. L. Prover ska hanteras som smittsamma med säkra laboratorierutiner, exempelvis enligt anvisningarna i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 och CLSI dokument M29-A 31. Rengör och desinficera noggrant alla arbetsytor med en nytillredd lösning av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. OBS! Kommersiellt tillgängliga blekmedel för hushållsbruk innehåller normalt natriumhypoklorit med en koncentration av 5,25 %. Spädning 1:10 av sådant blekmedel ger 0,5 % natriumhypokloritlösning. M. VARNING: CTM ( ) C, HBV L(+)C och HBV H(+)C innehåller human plasma som deriverats från humanblod. Källmaterialet har testats med testmetoder som är godkända av FDA i USA och visat sig vara icke reaktivt för hepatit B ytantigen (HBsAg), antikroppar mot HIV 1/2 och HCV samt HIV p24 antigen. Test av negativ humanplasma med PCR-metoder visade inget detekterbart HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA. Inga kända testmetoder kan fullständigt garantera att produkter som deriverats från humanblod inte överför smittsamma ämnen. Därför ska allt material av humant ursprung betraktas som potentiellt smittsamt. CTM ( ) C, HBV L(+)C och HBV H(+)C ska hanteras som smittsamma med säkra laboratorierutiner, exempelvis enligt anvisningarna i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 och CLSI dokument M29-A 31. Rengör och desinficera noggrant alla arbetsytor med en nytillredd lösning av 0,5 % natriumhypoklorit i avjoniserat eller destillerat vatten. N. HBV MMX, HBV QS och CTM Mn 2+ innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparledningar och bilda mycket explosiva metallazider. Om natriumazidhaltiga lösningar hälls ut i avloppet i laboratoriet ska detta spolas med stora mängder vatten för att undvika aziduppbyggnad. O. Använd skyddsglasögon, skyddsrock och engångshandskar vid hantering av reagenser. Undvik kontakt med hud, ögon eller slemhinnor. Spola omedelbart med stora mängder vatten om kontakt inträffar. Om kontaktplatsen inte behandlas kan brännskador uppstå. Späd med vatten innan du torkar upp eventuella utspillda reagenser. FÖRVARING OCH HANTERING Provförberedelsereagenser A. Förvara High Pure Systems virusnukleinsyrareagenser i 15 25 C efter leverans. B. Elueringsbuffert (ELB) och lyserings-/bindningsbuffert (LYS) ska förvaras i 15 25 C. När de öppnats ska ELB och LYS förvaras i 15 25 C. Öppnade ELB och LYS måste användas inom 30 dagar eller före utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. C. Efter tillsats av elueringsbuffert (ELB) för rekonstitution av bärar-rna och proteinase-k ska oanvänd rekonstituerad bärar-rna (CAR) samt oanvänd rekonstituerad proteinas-k (PK) förvaras i 15 till 25 C. Efter rekonstitution måste bärar-rna och proteinas-k användas inom 30 dagar eller före utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. 7

D. Efter tillsats av etanol ska Inhibitoravlägsnande buffert (IRB) och Tvättbuffert (WASH) förvaras i 15 25 C. Dessa arbetslösningar är stabila i 30 dagar eller till utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. E. Lyserings-/bindningsarbetslösningen [Lyserings-/bindningsbuffert med bärar-rna, Proteinas-K och HBV QS] måste användas omedelbart efter beredningen. Eventuellt överskott måste slängas. Amplifierings- och detektionsreagenser A. Frys inte reagenser eller kontroller. B. HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS och CTM Mn 2+ ska förvaras i 2 8 C. Oöppnade är dessa reagenser stabila till angivet utgångsdatum. Så snart de öppnats och en andel avlägsnats för en batchstorlek på 12 prover ska återstående HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS och CTM Mn 2+ förvaras i 2 8 C. Så snart de öppnats är HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS och CTM Mn 2+ stabila i 2 8 C i 30 dagar eller till utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. Så snart den öppnats måste oanvända delar av CTM ( ) C slängas. C. Working Master Mix (bereds genom tillsats av CTM Mn 2+ till HBV MMX) måste förvaras mörkt i 2 8 C. Beredda prover och kontroller måste tillsättas inom 2 timmar från det att Working Master Mix bereddes. D. Behandlade prover och kontroller är stabila i upp till 3 timmar i 20 30 C, upp till 24 timmar i 2 8 ºC samt frusna vid 20 C i upp till 1 vecka. E. Amplifieringen måste startas inom 3 timmar från den tidpunkt då de behandlade proverna och kontrollerna tillsattes till Working Master Mixen. MATERIAL SOM MEDFÖLJER Provförberedelsereagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit High Pure System virusnukleinsyrautrustning (P/N: 03502295 001) LYS (Lyserings-/bindningsbuffert) CAR (bärar-rna) PK (Proteinas K) IRB (Inhibitoravlägsnande buffert) WASH (Tvättbuffert) ELB (Elueringsbuffert) RS (Kassettuppsättning för High Pure System Viral Nucleic Acid Kit) WR (Avfallskassett för High Pure System Viral Nucleic Acid Kit) Amplifierings- och detektionsreagenser B. COBAS TaqMan HBV Test (P/N: 03500756 190) HBV QS (COBAS TaqMan HBV kvantifieringsstandard) HBV H(+)C [HBV hög (+) kontroll] HBV L(+)C [HBV låg (+) kontroll] CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (human plasma)] HBV MMX (COBAS TaqMan HBV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan manganlösning) HBV HPS 8

MATERIAL SOM BEHÖVS MEN SOM INTE MEDFÖLJER Instrument och programvara COBAS TaqMan 48 Analyzer AMPLILINK programvara, v3.1 eller högre Datastation för AMPLILINK programvara Bruksanvisning till COBAS TaqMan 48 Analyzer K-rörslock (P/N: 03516539001) COBAS TaqMan HBV PCR testfil på CD ROM (P/N: 04673182190) Engångsartiklar K-rör, kartong med 12 x 96 (P/N: 03137082001) Krav på centrifugen Sigma 4 15 C, bänkcentrifug eller motsvarande mikrotitreringsplattcentrifug med prestanda för 4600 x g centrifugalkraft Sigma-centrifug utsvängningsbar rotor, P/N: 11118 (2 hinkar ingår, P/N: 13218 samt 2 platthållare, P/N: 17978) eller motsvarande ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE MEDFÖLJER Isopropanol (> 99 %) - som uppfyller ACS-specifikationerna eller bättre Etanol (96 100 %) - som uppfyller ACS-specifikationerna eller bättre Justerbara pipetter*: (kapacitet 250 µl och 1000 µl) DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutningsmekanism Pipetteringshjälpmedel: Drummond (P/N: 4-000-100) eller motsvarande Vattenbad vid 50 C (± 2 C) Torrt värmeblock vid 70 C (± 2 C) Sterila serologiska pipetter för engångsbruk: 5, 10 och 25 ml Sterila konformade rör av polypropylen: 15 ml och 50 ml Corning (P/N: 430052 och P/N: 430290) eller motsvarande Sterila 2,0 ml mikrocentrifugrör: Sarstedt (P/N: 72.693.005) eller motsvarande Vortexmixer Provrörskassetter Engångshandskar, talkfria Kalibrerade termometrar för vattenbad och torrt värmeblock * Pipetterna ska ha 3 % noggrannhet för angiven volym. DNase-fria spetsar med aerosolbarriär eller positiv förskjutning måste användas där så anges för att förhindra korskontamination mellan prover och amplicon. PROVTAGNING, TRANSPORT OCH FÖRVARING AV PROVER OBS! Hantera alla prover som potentiellt smittbärande. A. Provtagning COBAS TaqMan HBV Test får endast användas med prover av serum eller plasma. Blod ska samlas in i BD SST serumsepareringsrör eller rör som använder EDTA (ljuslila lock) som antikoagulantia. Förvara helblod i 2 25 C i högst 1 dygn. Användning av EDTA-plasma eller serum ger testresultat som är ungefär likvärdiga. Figur 4 visar effekten av matristypen på patientprovernas HBV DNA-resultat. 9

Figur 4 Jämförelse mellan EDTA-plasma och serumprover 12,00 Plasmaprover Genomsnittligt resultat (Log HBV DNA IU/ml, n=2) 10 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Serumprover Genomsnittligt resultat (Log 10 HBV DNA IU/ml, n = 2) Separera serum eller plasma från helblod inom 1 dag från provtagningen genom centrifugering vid 800 1600 x g i 20 minuter i rumstemperatur. Överför serum eller plasma till ett sterilt polypropylenrör. Figur 5 visar data från dessa provtagningsstudier. Figur 5 HBV-stabilitet i helblod med EDTA antikoagulantia eller i serumsepareringsrör före separering till plasma eller serum Genomsnittligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (IU/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 < 1 timma 25-30 C 6 timmar 25-30 C 24 timmar 25-30 C 48 timmar 25-30 C 72 timmar 25-30 C < 1 timma 2-8 C 6 timmar 2-8 C 24 timmar 2-8 C 48 timmar 2-8 C 72 timmar 2-8 C Prov-ID B. Transport av prover Transport av helblod, serum eller plasma måste uppfylla nationella, regionala och lokala bestämmelser för transport av etiologiska ämnen 32. Helblod måste transporteras i 2 25 C och behandlas inom 1 dag från provtagningen. Plasma och serum kan transporteras vid 2 8 C eller fruset i 20 C till 80 C. C. Förvaring av prover Serum- och plasmaprover kan förvaras i rumstemperatur i upp till 3 dagar, vid 2 8 C i upp till 7 dagar eller frusna i 20 C till 80 C i minst sex veckor. Proverna bör förvaras i alikvoter om 800 900 µl i sterila, 2,0 ml polypropylenrör med skruvlock (exempelvis Sarstedt P/N: 72.694.006). Figur 6 visar data från dessa provförvaringsstudier. 10

Figur 6 HBV:s stabilitet i EDTA-plasma eller serum Genomsnittligt HBV DNA-resultat Log HBV DNA (IU/ml n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Plasma-5 Serum-1 Serum-2 tid 0 1 dag RT 3 dagar RT 5 dagar RT 7 dagar RT 1 dag 2-8 C 3 dagar 2-8 C 5 dagar 2-8 C 7 dagar 2-8 C 6 veckor -80 C Prov-ID Serum- och plasmaprover kan frysas och tinas upp till fem gånger utan förlust av HBV DNA. Figur 7 visar data från frys-upptiningsstudier. Figur 7 HBV-resultat efter upp till fem frysnings-upptiningscykler 4,5 Genomsnittligt resultat Log HBV DNA (IU/ml n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 Kontroll 1 F-U 2 F-U 3 F-U 4 F-U 5 F-U 2,0 Plasma-1 Plasma-2 Plasma-3 Plasma-4 Serum-1 Serum-2 Prov-ID BRUKSANVISNING OBS! Ytterligare anvisningar finns i användarhandboken till COBAS TaqMan 48 Analyzer. OBS! Samtliga reagenser ska ha rumstemperatur före användning. Ta ut dem ur kylskåpet (2 8 C) minst 30 minuter före användning. OBS! Serum- och plasmaprover måste stå 15 30 minuter i rumstemperatur innan de används. OBS! Använd pipetter med spets med aerosolbarriär eller positiv förskjutning om så anges. Var ytterst noga med att undvika smitta. Omgångsstorlek: Varje sats innehåller reagens som räcker till fyra omgångar om 12 tester. Dessa kan utföras separat eller simultant. Ett replikat vardera av CTM ( ) C, HBV L(+)C och HBV H(+)C måste ingå i varje testserie av upp till 24 prover och kontroller (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifierings- och detektionsreagenserna är förpackade i 24-tests flaskor för dubbel användning. För effektivast möjliga användning av reagenserna bör prover och kontroller behandlas i omgångar som är multiplar av 12. 11

Extraktion av prover och kontroller OBS! Vid användning av frusna serum- eller plasmaprover ska proverna placeras i rumstemperatur tills de har tinat helt och vortexas i 5 10 sekunder innan de används. OBS! Låt reagenserna uppnå rumstemperatur innan du fortsätter. Värm upp värmeblocket till 70 C (± 2 C) och vattenbadet till 50 C (± 2 C) innan du startar reningsreaktionerna. A. Reagensberedning OBS! Tillred lyserings/bindningslösningen först när alla prover och kontroller har uppnått jämvikt i rumstemperatur i 15 30 minuter. 1. Tillred inhibitoravlägsningsbufferten genom att pipettera 20 ml 96 100 % etanol till inhibitoravlägsningsbufferten (IRB). Blanda genom att vända 5 10 gånger. Detta är tillräcklig rekonstituerad inhibitoravlägsningsbuffert för 48 tester. 2. Tillred tvättbufferten genom att pipettera 80 ml 96 100 % etanol till tvättbufferten (WASH). Blanda genom att vända 5 10 gånger. Detta är tillräcklig rekonstituerad tvättbuffert för 48 tester. 3. Värm elueringsbufferten (ELB) i 70 C (± 2 C) i ett 2,0 ml mikrocentrifugrör med skruvlock. Flera rör kan användas. Elueringsvolymen per prov är 75 µl. Värm upp de volymer som står angivna i nedanstående tabell enligt antalet tester. Antal replikat Reagens 12 24 Elueringsbuffert (ml) 2,0 4,0 4. Pipettera den volym isopropanol som står angiven i nedanstående tabell enligt antalet tester i ett rent sterilt rör. Antal replikat Reagent 12 24 Isopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipettera 0,5 ml elueringsbuffert (ELB) i bärar-rna (CAR). Sätt tillbaka stoppkorken, vänd på flaskan och vortexa tills allt bärar-rna lösts upp. Denna mängd rekonstituerad bärar-rna räcker till 24 tester. Oanvänd rekonstituerad bärar-rna kan förvaras i 15 till 25 C i upp till 30 dagar eller tills utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. 6. Pipettera 5,0 ml elueringsbuffert (ELB) i Proteinas-K (PK). Sätt tillbaka stoppkorken, vänd på flaskan och vortexa tills all Proteinas-K har lösts upp. Denna mängd rekonstituerad Proteinas-K räcker till 24 tester. Oanvänd rekonstituerad Proteinas-K kan förvaras i 15 till 25 C i upp till 30 dagar eller tills utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. 7. Bered lyserings/bindningslösningen enligt följande genom att pipettera de volymer som anges i nedanstående tabell beroende på antal prover och kontroller som ska behandlas: Antal replikat Reagens 12 24 Lyserings-/bindningsbuffert (ml) 7,0 14,0 Bärar-RNA (µl) 140 280 HBV QS (µl) 39 78 Proteinas-K (ml) 1,4 2,8 OBS! Volymen HBV QS är specifik för COBAS TaqMan HBV Test. OBS! Om fryst rekonstituerad bärar-rna eller Proteinas-K ska användas ska den tinas i rumstemperatur och vändas flera gånger innan den används. Tillsätt angiven mängd lyserings/bindningsbuffert till ett rent sterilt 50 ml provrör. Tillsätt angiven mängd rekonstituerad bärar-rna till provröret med lyserings/bindningsbuffert. Vortexa HBV QS i 3 5 sekunder och tillsätt angiven volym HBV QS i provröret med lyserings/bindningsbuffert och rekonstituerad bärar-rna. 12

Sätt lock på provröret och blanda genom att vända det 10 15 gånger. Vortexa EJ - om du vortexar skapas bubblor i lösningen. Tillsätt angiven mängd rekonstituerad Proteinas-K till provröret med lyserings/bindningsbuffert. Sätt lock på provröret och blanda genom att vända det 10 15 gånger. Vortexa EJ - om du vortexar skapas bubblor i lösningen. Börja dispensera lyserings/bindningslösningen omedelbart efter det att Proteinas-K har tillsatts och blandats med lyserings/bindningsbufferten. Oanvänd lyserings/bindningsbuffert (LYS) kan förvaras i 15 25 C i upp till 30 dagar eller tills utgångsdatum, beroende på vilket som infaller först. Oanvänd lyserings/bindningslösning måste slängas. B. Extraktion av prover och kontroller OBS! Justerbara pipetter med aerosolbarriär rekommenderas för denna procedur. OBS! Pipett för flergångsbruk med steril kombispets av lämplig storlek kan användas för steg 14, 16, 19 och 22. Man bör då vara extra försiktig för att undvika stänk av reagenser och korskontamination. 1. Pipettera 625 µl lyserings/bindningslösning i varje brunn i lyseringskassetten (I, genomskinligt). Tryck fast locken i täckande position. 2. Öppna en brunn åt gången och pipettera 500 µl prov eller kontroll i önskad brunn. När samtliga prover och kontroller har tillsatts trycker du på locket tills det snäpper fast och försluter brunnen väl. 3. Blanda genom att vortexa den fyllda lyseringskassetten i cirka 10 sekunder när samtliga prover och kontroller har tillsatts. Kontrollera visuellt att samtliga brunnar vortexas och blandas väl. 4. Inkubera lyseringskassetten i föruppvärmt 50 C (± 2 C) vattenbad i 10 minuter. Placera lyseringskassetten i ett vattenbad fyllt med cirka 5 7 cm vatten. Torka lyseringskassetten när den tagits upp ur vattenbadet. 5. Centrifugera lyseringskassetten i 10 20 sekunder med en inställning på 4600 x g på mikroplattscentrifugen. Det kan hända att centrifugen inte når inställd hastighet. 6. Öppna en brunn åt gången och pipettera 250 µl isopropanol i varje brunn. Efter varje tillsats trycker du på locket tills det snäpper fast och försluter brunnen väl. OBS! Volymen isopropanol är specifik för COBAS TaqMan Test. 7. Blanda proverna genom att vända kassetten tre gånger och vortexa den därefter i cirka 10 sekunder. Kontrollera visuellt att samtliga brunnar vortexas och blandas väl. 8. Centrifugera lyseringskassetten i 10 20 sekunder med en inställning på 4600 x g på mikroplattscentrifugen. Det kan hända att centrifugen inte når inställd hastighet. 9. Öppna en brunn åt gången och överför 750 µl prov- eller kontrollblandning till motsvarande brunnar på filtreringsrörskassetten (II, gult) med monterad avfallskassett (vitt). När samtliga prover och kontroller har tillsatts trycker du på locket tills det snäpper fast och försluter brunnen väl. 10. När samtliga prover eller kontroller har tillsatts centrifugeras filtreringsrörskassetten i 2 minuter vid 4600 x g i mikroplattscentrifugen. 11. Öppna en brunn åt gången och överför återstående prov- eller kontrollblandning till motsvarande brunn i filtreringsrörskassetten. När samtliga prover eller kontrollblandningar har tillsatts ska brunnslocket förslutas väl. Kasta lyseringskassetten på lämpligt sätt. 12. Centrifugera filtreringsrörskassetten i 2 minuter vid 4600 x g i mikroplattcentrifugen. 13. Avlägsna filtreringsrörskassetten från avfallskassetten genom att trycka på de båda snäpplåsen på filtreringsrörskassettens ovansida. Släng avfallskassetten. Byt ut den mot en ny avfallskassett och snäpp fast filtreringsrörskassetten på avfallskassetten. 14. Öppna alla lock på filtreringsrörskassetten med handtagen och pipettera 400 µl inhibitoravlägsningslösning (IRB) längs respektive brunns sida. Rör inte vid brunnens sidor. När inhibitoravlägsningsbuffert tillsatts i samtliga brunnar ska alla lock förslutas väl. 15. Centrifugera filtreringsrörskassetten i 2 minuter vid 4600 x g i mikrobrunnscentrifugen. 16. Öppna alla lock med handtagen och pipettera 700 µl tvättbuffert (WASH) längs sidan på respektive brunn. Rör inte vid brunnens sidor. När tvättbuffert tillsatts i samtliga brunnar ska alla lock förslutas väl. 17. Centrifugera filtreringsrörskassetten i 2 minuter vid 4600 x g i mikrobrunnscentrifugen. 18. Avlägsna filtreringsrörskassetten från avfallskassetten genom att trycka på de båda snäpplåsen på filtreringsrörskassettens ovansida. Kasta avfallskassetten. Byt ut den mot en ny avfallskassett och snäpp fast filtreringsrörskassetten på avfallskassetten. 13

19. Öppna alla lock med handtagen och pipettera 700 µl tvättbuffert längs sidan på respektive brunn. Rör inte vid brunnens sidor. När tvättbuffert tillsatts i samtliga brunnar ska alla lock förslutas väl. 20. Centrifugera filtreringsrörskassetten i 3 minuter vid 4600 x g i mikrobrunnscentrifugen. 21. Avlägsna filtreringsrörskassetten från avfallskassetten genom att trycka på de båda snäpplåsen på filtreringsrörskassetten ovansida. Placera filtreringsrörskassetten på elueringskassetten (IIIA, blå) och snäpp fast filtreringsrörkassetten på elueringskassetten. Kasta avfallskassetten på lämpligt sätt. 22. Öppna alla lock med handtagen och pipettera 75 µl förvärmd elueringsbuffert (ELB) mitt på varje filter utan att vidröra filtren. OBS! Tillsätt inte elueringsbuffert genom att dispensera den längs brunnens sida. När elueringsbuffert tillsatts i samtliga brunnar ska alla lock förslutas väl. Inkubera elueringskassetten i rumstemperatur i minst 3 minuter efter det att elueringsbuffert tillsatts i den sista brunnen. 23. Centrifugera filtreringsrörskassetten i 3 minuter vid 4600 x g i mikrobrunnscentrifugen. 24. Avlägsna filtreringsrörskassetten från elueringskassetten genom att trycka på de båda snäpplåsen på filtreringsrörskassettens ovansida. Kasta filtreringsrörskassetten på lämpligt sätt. 25. Placera täckkassetten (IIIB, blå) på elueringskassetten (IIIA, blå). Tryck ner snäpplåsen ordentligt på elueringskassetten. Förslut alla lock. 26. Behandlade prover och kontroller används direkt för PCR. Använd 50 µl behandlade prover och kontroller för amplifiering. Tillsätt de behandlade proverna och kontrollerna till Working Master Mix inom 3 timmar från fullbordad beredning av prover och kontroller. Om behandlade prover och kontroller inte kan användas inom 3 timmar efter beredningen kan de förvaras i 2 8 C i upp till 24 timmar i den täckta elueringskassetten eller frysas i 20 C i upp till 1 vecka i sterila 2,0 ml polypropylenrör med skruvlock (t.ex. Sarstedt, P/N: 72.694.006). Amplifiera de bearbetade proverna och kontrollerna inom 3 timmar efter att de tillsats i Working Master Mix. Amplifiering och detektion OBS! K-bärare och K-bärarhållare ska torkas av med en luddfri trasa fuktad med 70 % isopropanollösning. C. Reagensberedning OBS! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), Working Master Mix (Working MMX) och Working Master Mix plus behandlade prover och kontroller är ljuskänsliga. Skydda dessa reagenser från ljus. OBS! COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX) och COBAS TaqMan manganlösning (CTM Mn 2+ ) måste uppnå jämvikt i rumstemperatur under minst 30 minuter innan Working Master Mix tillreds. OBS! Iordningställ Working MMX när beredningen av prover och kontroller är klara. OBS! Working MMX måste användas inom 2 timmar efter beredningen. OBS! Så snart behandlade prover och kontroller har tillsatts till Working Master Mix måste amplifieringen startas inom tre timmar. 1. Låt en flaska HBV MMX och en flaska CTM Mn 2+ uppnå jämvikt i rumstemperatur under minst 30 minuter. 2. Placera en K-bärare i K-bärarhållaren. 3. Placera nya K-rör i K-bäraren utan att vidröra K-rörens sidor. OBS! Om färre än 24 rör ska köras måste position 1, 2, 5, 20, 23 och 24 vara upptagna för att K-bäraren ska ha balans i termocyclern. 4. Ta bort locken på K-rören med verktyget för K-rörslock. Placera locken i K-rörshållarens parkeringsposition. 5. Förbered Working MMX på följande sätt: För 24 tester tillsätts 191 µl CTM Mn 2+ till en flaska HBV MMX. Sätt lock på flaskan och blanda väl genom att vända den 10 gånger. Vortexa inte Working MMX. Skydda Working MMX från ljus och använd inom 2 timmar. För 12 tester avlägsnas 660 µl HBV MMX och placeras i ett 2 ml provrör. Tillsätt 90 µl CTM Mn 2+ till 2 ml röret med HBV MMX, sätt lock på provröret och blanda väl genom att vända det 10 gånger. Skydda Working MMX från ljus och använd inom 2 timmar. Förvara resten av det oanvända HBV MMX och CTM Mn 2+ i originalflaskorna vid 2 8 C. Efter att de öppnats är HBV MMX och CTM Mn 2+ stabila i 2 8 C i 30 dagar eller fram till utgångsdatum, beroende på vilket som inträffar först. 14

OBS! Volymen CTM Mn 2+ är specifik för COBAS TaqMan HBV Test. 6. Pipettera 50 µl Working MMX i varje K-rör. OBS! Om behandlade prover och kontroller förvarats frusna före amplifieringen ska de tinas i rumstemperatur innan du fortsätter med steg 7. 7. Tillsätt 50 µl av varje behandlat prov och kontroll i lämpligt K-rör med Working MMX med en mikropipett med aerosolbarriär eller spets med positiv förskjutning. Blanda försiktigt varje prov upp och ner tre gånger med mikropipetten utan att generera bubblor. 8. Upprepa steg 7 för varje behandlat prov och kontroll tills samtliga har överförts till K-rör. Använd en ny spets för varje prov och kontroll. Inspektera visuellt att det inte finns några bubblor och avlägsna dessa om det behövs. Sätt lock på K-rören med verktyget för K-rörslock. Verifiera visuellt att lämpliga volymer har tillsatts. 9. Amplifieringen måste startas inom 3 timmar från den tidpunkt då de behandlade proverna och kontrollerna tillsattes K-rören med Working MMX. D. Laddning och systemdrift av COBAS TaqMan 48 Analyzer 1. Slå på arbetsstationens dator och logga in i Windows XP med lämpligt användar-id och lösenord. 2. Slå på COBAS TaqMan 48 Analyzer. Kontrollera att instrumentet initialiseras och är klart för bruk enligt beskrivningen i Bruksanvisningen till COBAS TaqMan 48 Analyzer. Om K-bärare från tidigare omgång(ar) fortfarande finns kvar i någon av termocyklerna ska dessa avlägsnas med K-bärartransportören enligt beskrivningen i Bruksanvisningen till COBAS TaqMan 48 Analyzer. 3. Öppna AMPLILINK-programmet på datorn. Logga in med lämpligt användar-id och lösenord. 4. Klicka på ikonen Orders för att skapa K-bärarorder för de prover som ska testas. Välj fliken Sample och klicka därefter på knappen New och ange ordernumret för varje prov med tangentbordet eller streckkodsläsaren. Välj testdefinitionen HBV_HPS. Upprepa detta för varje prov. Klicka på knappen Save. OBS! Om färre än 24 rör ska köras måste position 1, 2, 5, 20, 23 och 24 vara upptagna för att K-bäraren ska ha balans i termocyclern. 5. Ange kvalitetskontrollinformation genom att välja fliken Quality Control i fönstret Orders. Klicka på knappen New och ange informationen från COBAS TaqMan HBV Testvärdeskontrollkort som medföljer satsen med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Ange batchnummer för COBAS TaqMan HBV-testet, utgångsdatum, låga (+) och höga (+) kontrollintervall samt batchspecifika kalibreringskoefficienter i därför avsedda utrymmen. Klicka på OK. 6. Ge omgången ett K-bärarnummer genom att klicka på fliken K-Carrier i fönstret Orders. Klicka på New i fönstret K-Carrier. Ange K-bärarnumret från streckkoden på K-bäraren i cellen till höger om K-Carrier ID med hjälp av tangentbordet eller streckkodsläsaren. Observera att resultaten från en föregående behandling med samma K-bärar-ID måste accepteras. Välj testet HBV_HPS i testpanelen nertill i fönstret. 7. Välj den första raden i kolumnen Type (T) i Worklist. Markera detta fält för att öppna rullgardinsmenyn och därefter välja önskad typ av kontroll. Dubbelklicka därefter i fältet sample ID (prov-id) på samma rad. Fönstret LookUp Control öppnas med alla tillgängliga kontroller. När kontrollen har valts visas motsvarande kalibrerings- och kontrollvärden i informationspanelen till höger nertill. Upprepa denna process för alla kontroller som behövs. 8. För att lägga till prover i Worklist dubbelklickar du på den första positionen (raden) för inskrivning av prover. Då öppnas fönstret Lookup Sample med tilldelade provbeställningar. Använd tangenterna Shift + Arrow för att markera mer än ett beställningsnummer. Verifiera att samtliga beställningar har tilldelats HBV_HPS-testet. 9. Klicka på Save för att spara K-bärarbeställningen. E. Amplifiering och detektion 1. Välj ikonen Systems på fliken System och klicka på Open för att öppna termocyklern. När locket till termocyklern är helt öppet och orden Ready to Load visas i fönstret Systems lyfter du upp locket på termocyklern och håll det öppet. Använd K-bärartransportören och förflytta den laddade K-bäraren med de lockförsedda K-rören med Working Master Mix, prover och kontroller till termocyklern enligt anvisningarna i Bruksanvisningen till COBAS TaqMan 48 Analyzer. Stäng locket till det termocyklern instrumentet. 2. Bekräfta att HBV_HPS testdefinitionsfilen är inläst för denna behandling. Klicka på Start i fönstret Systems nedanför ikonen TC för att stänga locket till termocyklern och starta omgången. 3. Amplifiering och detektion utförs automatiskt av COBAS TaqMan 48 Analyzer. 15

RESULTAT OBS! Anvisningar om hur man skriver ut resultaten och tolkar flaggor och kommentarer finns i bruksanvisningen till COBAS TaqMan 48 Analyzer. Resultatberäkning COBAS TaqMan 48 Analyzer fastställer automatiskt mängden HBV DNA i provet eller kontrollen. HBV DNA-mängden uttrycks i internationella enheter (IU)/ml. Konverteringsfaktorn mellan HBV-kopior/ml och HBV internationella enheter/ml är 5,82 kopior/iu om man använder WHO:s HBV internationella standard för NAT-test 97/746 29. COBAS TaqMan 48 Analyzer: Fastställer cykelns tröskelvärde (Ct) för HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard DNA. Fastställer mängden HBV DNA baserat på Ct-värdena för HBV DNA och HBV kvantifieringsstandard DNA samt de batchspecifika kalibreringskoefficienterna. Avgör om den beräknade mängden i IU/ml för HBV L(+)C och HBV H(+)C ligger inom specificerade intervall. Kör validering Kontrollera i AMPLILINKs resultatfönster eller på utskriften om det finns några flaggor eller kommentarer för att kontrollera att omgången var giltig. OBS! Ytterligare information om utskrift av resultat och tolkning av flaggor och kommentarer finns i användarhandboken till COBAS TaqMan 48 Analyzer. Omgången är giltig om inga flaggor visas för COBAS TaqMan HBV-kontrollerna. Omgången är inte giltig om någon av följande flaggor visas för COBAS TaqMan HBV-kontrollerna. Negativ kontroll: Flagga Resultat Tolkning Ett ogiltigt resultat eller ett N_NC_INVALID Invalid giltigt resultat som inte var negativt för HBV-målet HBV låg positiv kontroll: Flagga Resultat Tolkning L_LPCINVALID < 6.00E+00 IU/mL Kontrollen under intervallet Target Not Detected Kontrollen under intervallet En numerisk mängd X.XXE+XX IU/mL Kontrollen utanför intervallet > 1.10E+08 IU/mL Kontrollen över intervallet Invalid Ett ogiltigt resultat HBV hög positiv kontroll: Flagga Resultat Tolkning H_HPCINVALID < 6.00E+00 IU/mL Kontrollen under intervallet Target Not Detected Kontrollen under intervallet En numerisk mängd X.XXE+XX IU/mL Kontrollen utanför intervallet > 1.10E+08 IU/mL Kontrollen över intervallet Invalid Ett ogiltigt resultat Om omgången är ogiltig måste hela omgången göras om inklusive beredning av prover och kontroller, omvänd transkription, amplifiering och detektion. 16

Tolkning av resultat: Kontrollera varje enskilt prov för att se om det finns några flaggor eller kommentarer på resultatutskriften för en giltig omgång. Tolka resultaten på följande sätt: En giltig omgång kan innehålla både giltiga och ogiltiga provresultat beroende på om flaggor och/eller kommentarer erhålls för de enskilda proverna. Provresultaten tolkas på följande sätt: Kommentar Target Not Detected Orsak Ct-värdet för HBV ligger över analysens gräns, eller också har inget Ctvärde för HBV erhållits. Rapportera resultaten som HBV DNA ej detekterat. < 6.00E+00 IU/mL Beräknad IU/ml ligger under analysens intervall. Rapportera resultatet som HBV DNA-detekterat, mindre än 6 HBV DNA IU/ml. 6.00E+00 IU/mL och Beräknade IU/ml-resultat ligger under den lägre gränsen för analysens < 2.90E+01 IU/mL linjära intervall. Dessa resultat har en hög grad av variation och kan därför inte anses vara korrekta. Dessa resultat ska tolkas med försiktighet. 2.90E+01 IU/mL och Beräknade resultat som är större än eller lika med 29 IU/ml och mindre än 1.10E+08 IU/mL eller lika med 1,10E+08 IU/ml ligger inom analysens linjära intervall. Beräknad IU/mL ligger över analysens intervall. Rapportera resultatet som större än 1,10E+08 HBV DNA IU/mL. Om ett kvantitativt resultat önskas > 1.10E+08 IU/mL ska originalprovet spädas med HBV-negativ human plasma eller serum, beroende på matrisen för det ursprungliga provet, och analysen göras om. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. OBS! Prover som ligger över analysens intervall kan också ge ett ogiltigt resultat med flaggan QS_INVALID. Om ett kvantitativt resultat önskas ska originalprovet spädas med HBV-negativ human plasma eller serum, beroende på matrisen för det ursprungliga provet och testet göras om. Multiplicera det rapporterade resultatet med spädningsfaktorn. 17

KVALITETSKONTROLL Ett replikat vardera av COBAS TaqMan negativ kontroll, COBAS TaqMan HBV låg (+) kontroll och COBAS TaqMan HBV hög (+) kontroll måste ingå i varje testkörning av upp till 24 prover och kontroller Vid alla nya laboratorierutiner ska nya operatörer överväga att använda ytterligare egna kontroller varje gång testet utförs tills en hög grad av självförtroende uppnåtts rörande den egna förmågan att utföra testet på korrekt sätt. Det finns inga krav vad gäller kontrollernas position i K-bäraren. Kontrollera i utskriften av omgången om det finns några flaggor eller kommentarer för att kontrollera att omgången är giltig. Se Bruksanvisningen till COBAS TaqMan 48 Analyzer om hur man skriver ut resultat och tolkar flaggor och kommentarer. Negativ kontroll CTM ( ) C måste ge resultatet Target Not Detected, dvs. Ct-värdet för HBV DNA låg över gränsen för testet, eller också erhölls inget Ct-värde för HBV DNA, men ett giltigt Ct erhölls för HBV kvantifieringsstandard DNA. Om CTM ( ) C inte uppfyller detta kriterium är hela omgången ogiltig. Gör om hela processen (beredning av prover och kontroller, amplifiering och detektion). Kontakta ert lokala Roche-kontor för teknisk hjälp om CTM ( ) C vid upprepade tillfällen är ogiltig. Positiva kontroller Det angivna intervallet för HBV L(+)C och HBV H(+)C är specifikt för varje kontrollbatch och står angivet på värdekortet för COBAS TaqMan HBV testkontroller, vilket medföljer utrustningen. Dessa intervall skrivs in på datastationen med AMPLILINK-programmet med hjälp av COBAS TaqMan 48 Analyzers streckkodsläsare eller tangentbordet. HBV DNA IU/ml för såväl HBV L(+)C som HBV H(+)C måste ligga inom det intervall som står angivet på värdekortet för COBAS TaqMan HBV testkontroller som medföljer utrustningen. Om den en eller båda de positiva kontrollerna inte uppfyller detta kriterium är hela omgången ogiltig. Gör om hela processen (beredning av prover och kontroller, amplifiering och detektion). Om beräknad HBV DNA-mängd för ena eller båda de positiva kontrollerna upprepade gånger ligger utanför angivet intervall bör du kontakta ert lokala Roche-kontor för teknisk hjälp. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 1. God laboratorieteknik är, i likhet med alla testprocedurer, mycket viktig för att denna test ska utföras korrekt. På grund av den höga analytiska känsligheten hos detta test måste man vara extremt försiktig för att bevara satsreagensernas och amplifieringsblandningarnas renhet. Du måste noggrant kontrollera att alla reagenser är rena. Släng eventuella misstänkta reagenser. TESTETS BEGRÄNSNINGAR 1. Detta test har validerats för användning med humant serum eller human plasma som samlats in i EDTA-antikoagulantia. Test av andra provtyper kan ge felaktiga resultat, falskt negativa eller falskt positiva resultat. 2. Tillförlitliga resultat är beroende av adekvat provtagning, transport, förvaring och behandling. 3. Förekomst av AmpErase-enzym i COBAS TaqMan HBV Master Mix minskar risken för amplicon kontaminering. Kontaminering från HBV-positiva kontroller och kliniska prover kan endast undvikas genom god laboratorierutin samt att de procedurer som specificeras i denna bipacksedel följs noggrant. 4. Denna produkt får endast användas av personal som är utbildad i PCR-teknik. 5. Denna produkt kan endast användas tillsammans med COBAS TaqMan 48 Analyzer. 18