Nikotin - i kampen mot tobak

Nikotin - i kampen mot tobak Av: Adam S. Darwich Uppsala universitet

Innehållsförteckning Adam Darwich 1. Sammanfattning 03 2. Frågeställning och metodik 03 3. Bakgrund 04 3.1 Introduktion 04 3.2 Historik 04 4. Substansen nikotin och dess biologiska aktivitet 05 4.1 Nikotinets kemiska struktur och biosyntes 05 4.2 Nikotins roll i växten 06 4.3 Nikotins humanfysiologiska verkan 06 4.3.1 ADME: Absorption, distribution, metabolism och elimination 06 4.3.2 Verkningsmekanism 07 4.3.3 Toxikologi 07 4.3.4 Beroendeframkallande 09 5. Metoder för extraktion och isolering 09 6. Klinisk effekt och farmaceutisk användning 10 7. Klinisk effekt och läkemedelsutveckling 11 7.1 Nikotinvaccin 11 7.2 Nikotin Ett potentiellt läkemedel vid behandling av Parkinsons sjukdom? 12 8. Diskussion 12 9. Referenser 13 2

1. Sammanfattning Adam Darwich Substansen nikotin förekommer främst i Nicotiana tabacum och Nicotiana rustica, mer kända i folkmun som tobaksplantan. Nikotin syntetiseras naturligt i dessa växter via biosyntes från främst ornitin och kan vara en del av växternas försvarsmekanism mot insekter. Substansen kan extraheras med hjälp av bland annat headspace co-distillation. Tobak har använts och odlats i årtusenden och är idag utbrett över hela världen, främst i form av rökning. Prevalensen av tobaksrökning ligger på 49% för män och 8% för kvinnor i låginkomstländer, 37% för män och 21% för kvinnor i höginkomstländer. Nikotins verkningsmekanism hos människa är komplex. Substansen aktiverar sympatikus nervsystemet genom att binda till och fungera som agonist på de nikotinerga kolinerga receptorern. Detta stimulerar frisättningen av en mängd olika neurotransmittorer som kommer att bidra till nikotinets psykofarmakologiska effekt i CNS, däribland dopamin och serotonin. Vid upprepad exponering för nikotin uppkommer en neurologisk adaption till vissa av nikotinets effekter, samtidigt sker en uppreglering av nikotinerga acetylkolinerga receptorer vilket leder till fysiologiskt beroende. Över tiden kan nikotinanvändning leda till hjärtarytmier, ischemi och hjärtinfarkt genom att bland annat bidra till åderförkalkning, ett ökat blodtryck och hjärtfrekvens. Idag används nikotin i nikotinsubstituenter för tobaksavvänjning. Kliniska studier sker vad gäller tre nya nikotinvaccin. 2. Frågeställning och metodik I denna litteraturstudie om nikotin ligger huvudsaklig fokus på hur nikotin som substans kan extraheras och isoleras. Därutöver ska frågeställningen om hur nikotin verkar rent biologiskt och hur den kan användas kliniskt för läkemedelsutveckling besvaras. Till detta följer en bakgrund om substansen samt en diskussion och slutsats kring nikotinets användningsområden. Informationen bygger till största del på vetenskapliga artiklar hämtade ur vetenskapligt erkända tidsskrifter och kommer fungera som en sammanfattning av nutidens kunskap om ämnet. 3

3. Bakgrund 3.1 Introduktion Adam Darwich Nikotin är en substans som de flesta människor kan relatera till, främst i form av tobak. Tobaksplantan tillhör familjen Solanaceae där genuset Nicotiana representerar undergruppen som i folkmun brukar kallas för tobaksplantan. Två typer av tobaksplantor används idag för odling och beredning av förbrukningstobak, som röktobak och dylikt. Den första tobaksplantan som odlas industriellt är Nicotiana tabacum och den andra varianten är Nicotiana rustica (Stewart, 1967). 3.2 Historik Tobaken och i sin tur nikotinet, som är dess aktiva substans, har i årtusenden använts som ett traditionellt naturläkemedel och rusmedel. Den första dokumenterade användningen av tobak är från de syd- och nordamerikanska indianerna som brukade röka tobak som naturmedicin och som en del av religiös dyrkan. Den första personen att nämna tobaken i skrift var Christofer Columbus som, år 1452, när han upptäckte att amerikanska indianer använde denna planta han aldrig hade sett förut i en mängd olika medicinska och spirituella syften. Vid den här tiden var tobaken redan utspridd och allmänt använd bland indianer över hela Nord- och Sydamerika. Bland några av tobakens dåtida naturmedicinska användningsområden finns dokumentation från 1400-1500-talet där man nämnde att indianerna bland annat använde tobaken mot trötthet, hosta, astma, sår, brännsår, dämpa törst och för behandling av allmän sjukdom där tobaken användes för att driva ut onda andar. Även de första dokumentationerna av tobakens skadliga effekter kommer från Christofer Columbus skrifter där han drog slutsatsen att indianernas dåliga tandhälsa troligtvis berodde på tobaken de tuggade (Stewart, 1967). Efterkommande resenärer till den amerikanska kontinenten kom att hämta med sig tobaken till Europa och på sätt kom plantan och dess användning att sprida sig över hela världen (Stewart, 1967). Idag är tobaksanvändningen utbredd över hela världen, dess hälsovådliga och beroendeframkallande effekter är väl utredda. Den uppskattade prevalensen av tobaksrökning ligger på 49% för män och 8% för kvinnor i låginkomstländer, 37% för män 4

och 21% för kvinnor i höginkomstländer (enligt statistik från år 2008), därtill tillkommer andra konsumtionsformer av tobak (Slama, 2008). Som sagt handlar detta arbete inte om tobak utan främst om substansen nikotin. Spridningen av tobak är dock onekligen tätt sammanknuten med nikotinets verkan, detta kommer klargöras ytterligare nedan. Dessutom står tobak för det huvudsakliga intaget av nikotin. 4. Substansen nikotin och dess biologiska aktivitet 4.1 Nikotinets kemiska struktur och biosyntes Nikotinet finns i huvudsak i plantorna Nicotiana tabacum och Nicotiana rustica, där man kan finna substansen i högst koncentration. Nikotin är en pyridinalkaloid (se figur 1) och vanligt förekommande bland arten Nicotiana såsom anabasin, anatabin, nornikotin samt nikotin som är vanligt förekommande pyridinalkaloider (Häkkinen, et al. 2007). Figur 1: Nikotin, 3-(1-metylpyrrolidin-2-yl)pyridin (IUPAC) (NCBI, 2008). Nikotin är en sekundär-metabolit i växtens biosyntes (se figur 2) som främst produceras i växtens rot men finns i hela plantan. Gener i växten uttrycker ornitin och arginin samt en mängd olika enzymer. Ornitin omvandlas med hjälp av enzymet ornitindekarboxylas (ODC) till den symetriska diaminen diaminen putrescin. Arginin omvandlas indirekt till putrescin men i huvudsak bildas nikotin från ornitin. Genom en N-metylering av putrescin, katalyserad av putrescin N-metyltransferas (PMT), bildas därefter N-metylputrescin. PMT driver biosyntesen från polyaminbildning till bildningen av alkaloider och är därmed viktig för bildningen nikotin. N-metylputrescin omvandlas därefter av enzymet diaminoxidas metylputrescinoxidas, som är ett specifikt diaminoxiderande enzym, till N- metylaminobutanal. N-metylaminobutanal kommer sedan att cykliseras spontant till en N- metylpyrrolinium-katjon som är mycket reaktiv och direktinvolverad i bildningen av tropanalkaloider i andra växter. I Nikotiana-plantorna kommer den reaktiva katjonen att 5

tillsammans med nikotinsyra bilda nikotin (Häkkinen, et al. 2007; Hashimoto & Yamada, 1994). Figur 2: Nikotins naturliga biosyntes i Nikotiana tabacum, samt ytterliggare generell biosyntes. 4.2 Nikotins roll i växten En möjlig förklaring till den sekundära metaboliten nikotins roll i växten är att den fungerar som en skyddsmekanism för växtens överlevnad. Detta är ett vanligt resonemang när det gäller växtproducerade alkaloider i största allmänhet. Alkaloiden nikotin har visat sig vara verksam som insekticid, främst mot insekter inom familjen Aphididae, vilket kan ses som en bekräftelse av detta resonemang (Tomizawa & Casida, 2003). Nikotinet är en relativt ineffektiv insekticid med ett smalt effektspektrum gällande insektsarter. Nikotin har dock använts som insekticid sedan år 1600-talet och används fortfarande idag i Kina. Dessutom har mer aktiva insekticider med mindre miljöpåverkan tagits fram med nikotin som dess derivat, däribland neonikotinoider (Tomizawa & Casida, 2003). 4.3 Nikotins humanfysiologiska verkan 4.3.1 ADME: Absorption, distribution, metabolism och elimination Nikotin är en svag bas med ett pk a på 8,0, absorption genom mukösa membran i buccala och nasala trakten är därmed ph-beroende. Vid rökning når substansen blodcirkulationen 6

snabbt via absorption över lungalveolerna samtidigt som förstapassagemetabolism undviks. Nikotinet når det arteriella blodflödet och passerar snabbt över blodhjärnbarriären men därefter kommer nikotinhalten i hjärnan att sjunka snabbt allteftersom att nikotinet distribueras till annan vävnad (Benowitz 1986; Benowitz, 2008a). Nikotin metaboliseras i levern av CYP2A6 i störst utsträckning men även av CYP2B6 och CYP2E1. Den huvudsakliga metaboliten som bildas är kotinin som vidare metaboliseras av CYP2A6 till 3 -hydroxykotinin. Nikotin har en halveringstid på runt 2 timmar och kotinin en halveringstid på runt 16 timmar. Nikotinet kommer därefter att elimineras via glomerulär filtration och tubulär sekretion och även till en viss del via svettexkretion (Benowitz, 2008a; Hukkanen, et al. 2005). 4.3.2 Verkningsmekanism Nikotins verkningsmekanism är komplex och beroende av en mängd olika faktorer såsom dos, målorgan och tolerans. Nikotin aktiverar sympatikus nervsystemet genom att binda till och fungera som agonist på de nikotinerga kolinerga receptorerna i centrala nervsystemet. Aktivering av de nikotinerga kolinerga receptorerna stimulerar frisättningen av en mängd olika neurotransmittorer som kommer att bidra till nikotinets psykofarmakologiska effekt i CNS. En ökad frisättning av dopamin kommer att leda till njutning och aptitdämpning, noradrenalin leder till ruskänsla och aptitdämpning, acetylkolin leder till rus och ökad kognitiv förmåga, glutamat ökar inlärnings- och minnesförmågan, serotonin ger humörförändringar och aptitdämpning, β-endorfin samt GABA ger minskad oro och stress (Benowitz, 1986; Benowitz, 2008a). Nikotinet har förutom CNS-verkan även perifera effekter. Genom stimulering av neuronala adrenerga receptorer ökar frisättningen av adrenalin och noradrenalin, detta leder i sin tur till kutan vasokonstriktion och minskad perifer blodcirkulation, systemisk venkonstriktion, ökat blodtryck och ökad hjärtfrekvens (Benowitz, 1986). 4.3.3 Toxikologi Nikotin bidrar till att öka andelen very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL) och katekolaminer i blodet. Nikotin stimulerar blodets koagulationsförmåga vilket kan leda till hyperkoagulation. Dessutom stimulerar nikotin till 7

vasokonstriktion av blodkärl och en ökad hjärtfrekvens och kontraktionskraft på grund av dess förmåga att öka halterna adrenalin och noradrenalin. Dessa faktorer kan tillsammans över tiden leda till hjärtarytmier, ischemi och hjärtinfarkt genom att bland annat bidra till åderförkalkning, ett ökat blodtryck och hjärtfrekvens (Benowitz, 1986). I en studie utförd på hamstrar kunde man konstatera att kronisk administrering av nikotin, exempelvis i form av tobak, kan vara en viktig faktor i patogenesen för utveckling av kardiovaskulära sjukdomar på grund av en endotelberoende vaskulär reaktivitet via en syreradikal-intermedierad reaktion (Mayhan & Sharpe, 1999). Det har även visat sig i en in vivo studie utförd på människa att exponering för nikotin är associerad med endoteldysfunktion (Chalon, et al. 2000). Vad gäller nikotins teratogena effekter har man kunnat konstatera i djurstudier utförda på gnagare att signalering via nikotinerga acetylkolinerga receptorer är avgörande vid utvecklingen av neonatala fosters hjärnutveckling hos gnagare. Initialt sker en aktivering av dessa receptorer av nikotin, men detta följs av en inaktivering som i och med detta påverkar utvecklingen och mognaden av fostrets hjärna (Dwyer, et al. 2008). Vad gäller nikotinförgiftning kan detta uppstå vid oral förtäring av tobak, cigaretter, nikotintuggummi eller applicering av ett flertal nikotinplåster. Ett flertal fall har rapporteras där barn av misstag fått i sig toxiska doser av nikotin. De toxikologisk effekter som uppstår vid nikotinförgiftning är beroende av dos, duration och administreringsväg. Nikotin administrerat buccalt, intravenöst eller transdermalt kommer att undvika gastrointestinal och förstapassage metabolism och ger därför en ökad toxisk verkan i jämförelse med oral administrering. Lätt nikotinförgiftning kan uppkomma i så små mängder som 0,2 mg/kg oral dos. Nikotinförgiftningen kan leda till gastrointestinala besvär, yrhet, svaghet och vid högre doser förlorat medvetande, koma, andningsdepression, högt blodtryck och hjärtarytmier. Den toxikologiska effekten beror av samma effekt som vid dess ruskänsla (Wain & Martin, 2004). Vad gäller nikotins möjliga carcinogenicitet finns det inga data som styrker att det skulle vara carcinogent. Substansen har inte heller klassifierats av IARC (IARC, 2008). 8

4.3.4 Beroendeframkallande Vid upprepad exponering för nikotin uppkommer en neurologisk adaption till vissa av nikotinets effekter, samtidigt sker en uppreglering av nikotinerga acetylkolinerga receptorer vilket leder till en desensitisering av nikotinet. Desensitiseringen tros vara en viktig orsak till toleransutvecklingen och beroendeframkallande effekten av nikotin. En möjlig förklaring till den abstinens som uppkommer vid nikotinberoende är att när 4 β 2 -nikotinerga acetylkolinerga receptorerna inte längre binder upp nikotin och har återhämtat sig från den respons som nikotinet framkallat uppkommer abstinens. Som en del av adaptionen till nikotinet kommer en minskad frisättning av dopamin, vid nikotinabstinens, att leda till humörförändringar, fastlöshet, oro, irriterbarhet, minskad koncentrationsförmåga, ökad hunger och sömnsvårigheter (Benowitz, 2008b). 5. Metoder för extraktion och isolering Det finns en mängd olika metoder för att extrahera, isolera och på så sätt kvantitativt analyser nikotin i tobak, däribland kan nämnas ångdistillation, vätske-vätske-extraktion och fastfas-mikroextraktion. Detta eftersom nikotin är en viktig substans vad gäller humanfysiologiska och toxiska effekter. Det finns även stora krav på att nikotinhalter ska kunna bestämmas med stor exakthet och precision då substansen ingår i flera farmaceutiska produkter (Mullett, et al. 1999). Nikotin kan extraheras kvantitativt från tobak med hjälp av en fastfas-extraktion med sur eller basisk lösning med avseende på nikotins pk a. Eftersom en mängd andra organiska substanser även extraheras med i samma lösning som nikotinet krävs det ett framreningssteg. Framreningssteget isolerar nikotinet från tobakplantans andra organiska substanser och kan även användas för att prekoncentrera nikotinet för vidare kvantitativ analys. Ett sätt att rena fram nikotinet är med hjälp av såkallade molecularly imprinted polymers (MIP) som fastfas absorbenter. MIP är en speciellt framställd polymer för att specifikt kunna känna igen bindningsplatser på den utvalda molekylen. Med hjälp av att skölja analyten genom en MIP-mikrokolonn med två olika lösningsmedel med olika karaktäristika, såkallad differential pulselution, kan man rena fram nikotinet från de andra organiska komponenterna. Därefter kan kvantifiering ske med hjälp av UV-detektion. Detta är en mycket snabb och billig metod jämfört med vätskekromatografiska isoleringsmetoder (Mullett, et al. 1999). 9

Den mest elementära metoden för att extrahera nikotin är genom destillation av fin fördelad tobak, där headspace co-distillation (HCD) har visat sig vara den mest effektiva destillationstekniken. I experimentet skakades först tobaksblad i diklormetan över natten. Därefter överfördes analyten till destillerat vatten och renades med hjälp av kvävgas och analyten värmdes på 130 C oljebad i en glasapparatur med kvävgasflöde. Ångan kyldes ner till -5 C. Efter 3 timmars destillation extraherades destillatet fyra gånger med diklormetan och därefter utfördes rullindunstning. Kvantitativ och kvalitativ analys utfördes därefter med hjälp av gaskromatografi kopplat till masspektrometri. Denna teknik leder dock till att en mängd andra organiska substanser från tobaksplantan följer med, därmed har tekniken en låg specificitet (Peng et al. 2004). 6. Klinisk effekt och farmaceutisk användning Idag finns nikotin endast ute på läkemedelsmarknaden i form av nikotinsubstituenter vid avvänjning och lindrande av abstinens avsedd vid försök till tobaksavvänjning. Dessa rekommenderas som förstavalsterapi vid tobaksavvänjning. Nikotinsubstituenter finns i flera olika farmaceutiska formuleringar på marknaden, som transdermala plåster, nässpray, tuggummi, sublingual tablett och inhalator. Dessa olika beredningsformer innebär i sin mångfald alternativ i metodik för tobaksavvänjning, då olika beredningsformer kan passa olika patienter beroende på personliga preferenser och dylikt. Den beredningsform som skiljer sig från de andra är transdermalt plåster som ger en långsam frisättning över tiden medan de andra formerna ger en snabb frisättning. Verkningsmekanismen är den samma som för nikotin, och syftar till att dämpa de abstinensbesvär som är förknippade med tobaksavvänjning och är beroende av nikotin. Behandlingen går ut på att stegvis trappa ner nikotindosen och på så sätt trappa ner beroendet och avvänja patienten. Nikotinsubstitutionsterapi har visat sig inte vara fullt effektiv vad gäller att dämpa rökabstinensen, detta tros bero på att räkning ger en snabbare absorption av nikotin än substituenterna. Ett flertal vetenskapliga studier har pekat på att nikotinsubstituent-terapi dubblar chansen för att sluta röka långvarigt. Ingen nikotinsubstituent har visat sig vara mer effektiv än de andra (Nides, 2008). 10

7. Klinisk effekt och läkemedelsutveckling 7.1 Nikotinvaccin Tanken att kunna vaccinera sig mot nikotin för att på så sätt kunna sluta använda tobak låter som en oerhört spännande framtidsvision. Faktum är att det idag finns nikotinvaccin under klinisk prövning (Foulds, et al. 2004). Nikotinvaccin fungerar genom att kroppen ska identifiera nikotinet som ett främmande ämne, ett antigen, och bilda antikroppar mot nikotin. När nikotinet binder till antikropparna kommer komplexet nikotin-antikropp att vara för stort för att kunna ta sig över blodhjärnbarriären och på så sätt förhindrar man nikotinet tar sig över blod-hjärnbarriären och utöver dess psykoaktiva effekter som är förekommande vid tobaksanvändning. För att nikotinet ska kunna kännas igen som ett antigen måste substansen vara tillräckligt stor, därför har man i vaccinframställningen bundit nikotinet till ett proteinkomplex (Lindblom, et al. 2002; Nides, 2008). Två av nikotinvaccinen under klinisk prövning använder sig av kolera toxin B som bärarprotein, ett annat vaccin i klinisk prövning använder Keyhole Limplet Hemocyanin (KLH) som bärarprotein. Problemet med dagens vaccin under utveckling är att de kräver multipla injektioner för att plasmakoncentrationen antikroppar ska nå en tillräckligt hög nivå (de Villiers, et al. 2002; Nides, 2008). Prekliniska studier på råtta har visat att nikotinvaccinen minskar distributionen av nikotin till hjärnan med 64%. Man kunde dessutom se en minskad effekt av nikotins perifera verkan på blodtryck (Pentel, et al. 2000). Vid en preklinisk studie där råtta självadministrerade nikotin fann man att råttorna avbröt det själv administrerande beteendet efter immunisering med nikotinvaccin IP18-KLH (Lindblom, et al. 2002). I kliniska studier har vaccinen hittills visat goda resultat. Kolera toxin B burna vaccinet, CYT002-NicQb, visade att mellan 21% och 42% hade varit rökfria under en tolvmånadersperiod i jämförelse med placebo 21%. Det andra kolera toxin B burna vaccinet, TA-NIC, visade att 19% till 38% varit rökfria i tolvmånader jämfört med placebo på 8% (Nides, 2008). 11

De hittills observerade biverkningarna av nikotinvaccinen har visat sig vara generella biverkningar vad gäller vaccin, som ömhet, hudirritation, feber och värk (Nides, 2008). 7.2 Nikotin Ett potentiellt läkemedel vid behandling av Parkinsons sjukdom? Nikotin har visat sig ha en skyddande effekt på dopaminerga neuron. Det finns flera hypoteser om vilken reaktion det är som bidrar till att nikotin är neuroprotektiv. En hypotes är att nikotin verkar direkt neuroprotektivt genom att bidra till en förändrad monoaminoxidas aktivitet och inhibera complex I i elektrontransportkedjan och på så sätt fungerar som en antioxidant eller stimulera läkemedelsmetaboliserande enzymer i cytokrom. Alternativt kan den neuroprotektiva effekten bero på nikotins stimulering av nikotinerga acetylkolinerga receptorer. Nikotin uppvisar dessutom en anti-inflammatorisk effekt genom modulering av mikrogliell aktivering. Sammantaget skulle dessa effekter kunna innebära att nikotin har en terapeutisk vid behandling av Parkinsons sjukdom (Park, et al. 2007). I en fransk klinisk pilot kohortstudie gjorde man ett försök att behandla Parkinson-patienter med nikotin via transdermal administrering. Efter en sju veckors behandling med nikotindoser över 45mg/dag kunde man observera möjliga positiva effekter i form av minskade Parkinson-relaterade symptom. Denna studie lämnade dock en del frågetecken då den endast utfördes på sex patienter, dessutom kunde man observera en del biverkningar som kräkning och yrhet. Man påpekade också i studien att det krävs ytterliggare studier för att utreda den möjliga kausaliteten. Det bör tilläggas att dessa idéer är kontroversiella vad gäller nikotins kliniska effekt mot Parkinsonism och skepticismen är stor bland forskare (Villafane, et al. 2007). 8. Diskussion Det är ingen tvekan om att nikotin är en substans med tvetydigt ansikte. Nikotin är beroendeframkallande och har gått hand i hand med tobaksmissbruk vilket har resulterat i stora hälsovådliga och samhällsskadliga effekter över hela världen. Nikotin uppvisar även en mängd toxikologiska effekter. Rent kliniskt har nikotin endast används som ett substitut till tobak, detta har lett till en ökad chans till tobaksavvänjning. 12

Lite forskning har gjort på nikotin som substans, då tonvikten oftast har lagts vid vetenskapliga studier av röknings generella effekt. Nikotin är en mångfacetterad substans som uppvisar en mängd olika fysiologiska effekter. Mer forskning vad gäller nikotinets potentiella farmakologiska effekter bör genomföras, detta skulle kunna visa sig vara gynnsamt både vad gäller förståelsen människans hjärnfysiologi och möjliga nya läkemedel. 9. Referenser Benowitz, N.L. Clinical Pharmacology of Nicotine. Ann Rev Med 1986. 37:21-32. Benowitz, N.L. Clinical Pharmacology of Nicotine: Implications for Understanding, Preventing, and Treating Tobacco Addiction. Clinical Pharmacology & Therapeutics, Vol 83, No 4, April 2008a. Benowitz, N.L. Neurobiology of Nicotine Addiction: Implications for Smoking Cessation Treatment. The American Journal of Medicine, Vol 121, Issue 4, Supplement 1, S3-S10, April 2008b. Chalon, S., Moreno, H.Jr., Benowitz, N.L., Hoffman, B.B. & Blaschke, T.F. Nicotine impairs endothelium-dependent dilatation in human veins in vivo. Clinical Pharmacology & Therapeutics Vol. 67, No. 4, pp. 391-397, 2000. de Villiers, S.H.L., Lindblom, N., Kalayanov, G., Gordon, S., Malmerfelt, A., Johansson, A.M., Svensson, T.H. Active Immunization against Nicotine Supresses Nicotine-Induced Dopamine Release in the Rat Nucleus accumbens Shell. Respiration 2002;69:247-253. Dwyer, J.B., Broide, R.S. & Leslie, F.M. Nicotine and Brain Development. Birth Defects Research (Part C) 84:30-44 (2008). Foulds, J., Burke, M., Steinberg, M., Williams, J.M. & Ziedonis, D.M. Advances in pharmacotherapy for tobacco dependence. Expert Opinion on Emerging Drugs, Maj 2004, Vol 9, No 1, 39-53. 13

Hashimoto, T. & Yamada, Y. Alkaloid Biogenesis: Molecular Aspects. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1994, 45:257-285. Hukkanen, J., Jacob, P.III. & Benowitz, N.L. Metabolism and Disposition Kinetics of Nicotine. Pharmacol Rev 57:79-115, 2005. Häkkinen, S.T., Tilleman, S., Swiatek, A., De Sutter, V., Rischer, H., Vanhoutte, I., Van Onckelen, H., Hilson, P., Inzé, D., Oksman-Caldentey, K-M. & Goossens, A. Functional characterisation of genes involved in pyridine alkaloid biosynthesis in tobacco. Phytochemistry Vol. 68, Issues 22-24: pp 2773-2785, 2007. IARC International Agency for Research on Cancer. 15 Maj 2008 kl 20:00. http://monographs.iarc.fr/eng/classification/crthallalph.php Lindblom, N., de Villiers, S.H.L., Kalayanov, G., Gordon, S., Johansson, A.M. & Svensson, T.H. Active Immunozation against Nicotine Prevents Reinstatement of Nicotine-Seeking Behavior in Rats. Respiration 2002;69:254-260. Mayhan, W.G. & Sharpe, G.M. Chronic exposure to nicotine alters endotheliumdependent arteriolar dialatation: effect of superoxide dismutase. J Appl Physiol 86:1126-1134, 1999. Mullett, W.M., Lai, E.P.C. & Sellergren, B. Determination of nicotine in tobacco by molecularly imprinted solid phase extraction with differential pulse elution. Anal Commun, 1999, 36, 217-220. NCBI 13 Maj 2008 kl 18:00 http://www. ncbi.nlm.nih.gov/ - http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=942&loc=ec_rcs Nides, M. Update on Pharmacologic Options for Smoking Cessation Treatment. The American Journal of Medicine, Volume 121, Issue 4, Supplement 1, April 2008, pp S20- S31. 14

Park, H.J., Lee, P.H., Ahn, Y.W., Choi, Y.J., Lee, G., Lee, D-Y., Chung, E.S. & Jin, B.K. Neuroprotective effect of nicotine on dopaminergic neurons by anti-inflammatory action. European Journal of Neuroscience, Vol. 26, pp. 78-89, 2007. Peng, F., Sheng, L., Liu, B., Tong, H. & Liu, S. Comparison of different extraction methods: steam distillation, simultaneous distillation and extraction and headspace codistillation, used for the analysis of the volatile components in aged flue-cured tobacco leaves. Journal of Chromatography A Volume 1040, Issue 1, 18 June 2004, pp 1-17. Pentel, P.R., Malin, D.H., Ennifar, S., Hieda, Y., Keyler, D.E., Lake, J.R., Milstein, J.R., Coy, R.T., Moon, W.D., Naso, R. & Fattom, A. A Nicotine Conjugate Vaccine Reduces Nicotine Distribution to Brain and Attentuates Its Behavioral and Cardiovascular Effects in Rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, Vol. 65, Iss 1, Jan 2000, pp 191-198. Slama, K. Global perspective on tobacco control. Part I. The global state of the tobacco epidemic. Int J Tuberc Lung Dis 12(1):3-7, 2008. Stewart, G.G. A History of the Medicinal Use of Tobacco 1492-1860. Med Hist 1967 July; 11(3): 228-268. Tomizawa, M. & Casida, J.E. Selective Toxicity of Neonicotinoids Attributable to Specificity of Insect and Mammalian Nicotinic Receptors. Annu Rev Entomal 2003,48:339-364. Villafane, G., Cesaro, P., Rialland, A., Baloul, S., Azimi, S., Bourdet, C., Le Houezec, J., Macquin-Mavier, I. & Maison, P. Chronic high doses transdermal nicotine in Parkinson s disease: an open trial. European Journal of Neurology 2007, 14: 1313-1316. Wain, A.A. & Martin, J. Can transdermal nicotine patch cause acute intoxication in a child? A case report and review of literature.. The Ulster Medical Journal, Volume 73, No. 1 pp. 65-66, May 2004. 15