Validation of realtime-pcr of Fusarium avenaceum. for detection in wheat

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp, VT 2010 Validation of realtime-pcr of Fusarium avenaceum for detection in wheat Maria Tsakalou Handledare: Elisabeth Fredlund, Ann Gidlund Sveriges Livsmedelsverk, Uppsala Mikrobiologiska enheten

ABSTRACT Mould is a common contamination in cereals. The growth of mould can stimulate mycotoxins production and some of which at critical concentrations cause health problems in humans and animals. Fusarium is one of the fungus species that has been found in crops and can cause major problems for farmers such as reduced harvest and economic losses. A group of Fusarium species, Fusarium avenaceum, Fusarium poae and Fusarium tricinctum express a mycotoxin, enniatin. The limited information available today about enniatin-forming fungi is that they grow out on fields of wheat in colder climates. This project aims at developing methods for detection, quantification and identification of known and unknown fungi present in Swedish cereals during 2009-2011. The project was carried out using two previously published methods, TMAV and MGB, which both use TaqMan probes with realtime-pcr detection. The methods were evaluated for robustness, efficiency, accuracy, inclusion and exclusion. The results showed that both methods, TMAV and MGB, could be used to detect Fusarium avenaceum. The results for the TMAV method were that it could be used with custom annealing temperature and chemical concentrations for the best detection. The MGB method can be used to detect Fusarium avenaceum with Fusarium tricinctum in the same analysis. Both methods can be included in future mapping projects when it is of interest to quantify enniatin producing moulds. KEYWORDS Mycotoxin, Fungus, Mould, Realtime-PCR, Enniatin

INTRODUKTION Detta arbetes fokus var att bidra till utveckling av metoder för upptäckt, identifiering och förekomst av kända och okända mögelsvampsangrepp på spannmålsprodukten vete i Sverige under perioden 2009 2011. Mögel är mikroskopiska svampar som finns naturligt och oundvikligt i vår miljö och förekommer därför också i livsmedel. I huvudsak lever mögel på att bryta ned dött material men kan även växa i levande växter. Vissa mögelsvampar bildar gifter, så kallade mykotoxiner, vilka utgör en hälsorisk för människa och djur. Mykotoxiner är kemiska ämnen som vid höga intag eller lågt intag under längre tid, kan orsaka långsiktiga och allvarliga hälsoproblem då de verkar nedsättande på immunförsvaret (Nicolaisen M, et al. 2009). När det gäller livsmedel är de vanligaste och hälsofarligaste mögelsvampsarterna Aspergillus, Penicillium och Fusarium. Av dessa är Fusarium den som främst angriper spannmål. Svamp orsakar stora problem för jordbruket med minskad skörd och därmed ekonomiska förluster (Waalwijk C, et al. 2004; Nicolaisen M, et al. 2009). En av många studier utförd i Canada har visat stora utbrott av mögelsvampen Fusarium i spannmål på fälten i Canada under det senaste decenniet (Schaafsma A W, et al. 2007). Studien väckte frågeställningen om Fusarium även ökat i tillväxt i de Nordiska jordbruken, eftersom Canada har ett klimat med stora likheter med Norden. Skulle en tillväxt av Fusarium upptäckas vore det nödvändigt att utveckla effektivare metoder för att detektera mögelsvampar och framförallt fusariumarter. Fusariumsvampen kan beroende av klimatförhållandet stimuleras till mykotoxinbildning redan under odlingen ute på fälten, till skillnad från exempelvis aspergillussvampen som bildar sina toxiner under lagringstiden. Klimatet har en avgörande inverkan på tillväxten av mögelsvampar och halten av mykotoxiner i spannmål förändras från år till år (Schaafsma A W, et al. 2007). Sverige har idag ett klimat som kan ge varma och fuktiga höstar, vintern kan

vara kall men snölös eller med snö som ligger länge men att marken därunder dock inte är frusen. Tidigare undersökningar har visat att Fusarium avenaceum är den dominerande arten av mykotoxin i vete i länder med kallare klimat, så som i Finland och Norge (Uhlig S, et al. 2007). Inom det europeiska regelverket finns gränsvärden för vissa fusariumtoxiner till exempel deoxynivalenol, men ännu inte för andra till exempel mykotoxinet enniatin 1. Myndigheten för samhällsskydd och beredskap (MSB) finansierar under perioden 2009 2011 ett projekt på Livsmedelsverket med syfte att öka kunskapen och beredskapen inför en ökning av mögel och mykotoxiner i spannmål till följd av ett förändrat klimat. Syftet med projektet är att utveckla metoder för detektion, kvantifiering och identifiering av kända och okända mögelsvampar samt att kartlägga förekomsten av toxinbildande mögelsvampar i svenskt spannmål under 2009 2011. En kartläggningsstudie utfördes därför av Livsmedelsverket under 2009 där de använde en kemisk multimetod som möjliggjorde detektion och kvantifiering av mykotoxiner som vanligtvis inte analyseras, bland annat enniatiner vilkar produceras av bland annat Fusarium avenaceum, Fusarium tricinctum och Fusarium poae. I Europa har det ännu inte fastslagits några gränsvärden för enniatiner, då kunskapen är dålig om deras toxicitet och förekomst. Dessutom finns endast ett fåtal sedan tidigare publicerade studier över DNA från Fusarium avenaceum och Fusarium tricinctum. Sett till nutidens klimatförändringar med ökande temperaturer och ändrade klimat kan ett gränsvärde komma att vara relevant i framtiden. Detektion och identifiering av fusariumarter har tidigare gjorts morfologiskt och med traditionella odlingsmetoder på Livsmedelsverket (Fredlund E, et al. 2008). Idag finns det molekylära metoder såsom realtids-pcr vilka kan användas för kvantifiering av artspecifik DNA i till exempel veteprover. Realtids-PCR är en snabb, känslig, specifik och effektiv metod som resulterar i en stor mängd identiska DNA-fragment. 1 [EU-förordningen 1881/2006]

I denna studie användes en TaqMan-probe vilken binder mögelsvampens DNA-sekvens under PCR. TaqMan-proben har två specifika molekyler, en quencher och en reporter i respektive ände på probefragmentet. Reportens fluorescence förhindras av närheten till quenchermolekylen. TaqMan-proben och primrarna binder till DNA-målsekvensen vid uppnådd annealingstemperatur. När DNA amplifieras vandrar enzymet DNA-polymeras längs fragmentet, läser av och kopplar nukleotider till varandra så att en komplementär sekvens erhålls. När enzymet stöter på proben klyver DNA-polymeraset proben som även har en nukleasaktivitet, varvid quenchern och reportern separeras och ett fluorescerande ljus kan detekteras. Fluorescensstyrkan som uppmäts är proportionell med mängden DNA (Kubista M, et al. 2006). Resultaten för realtids-pcr redovisas som C T -värden (cykle threshold), vilket innebär det antal cykler som måste genomföras innan fluorescensen passerar tröskelvärdet för detektion. Som fortsättning på kartläggningen från 2009 arbetar Livsmedelsverket med planering av en ny kartläggningsstudie av mögel och mykotoxiner i spannmål under 2010. Det finns idag på Livsmedelsverket validerade metoder för detektion av Fusarium gramnegativ, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium poae och Fusarium langsethiae däremot finns ännu inte någon specifik referens- eller valideringsmetod för Fusarium avenaceum. Fusarium avenaceum är en av tre arter som bildar mykotoxinet enniatin som detekterats i en tidigare studie på Livsmedelsverket. Därför utför Livsmedelsverket nu en validering och utveckling av en kvantitativ metod för Fusarium avenaceum vilket är den del av projektet som jag deltagit i. En metodvalidering för realtids-pcr med TaqMan-metoder gjordes med samma kontrollsteg som i tidigare studier för andra fusariumarter (Fredlund E, et al. 2010). Valideringen utfördes med två TaqMan-metoder då tidigare studier har visat goda resultat för detektion av Fusarium avenaceum med realtids-pcr (Waalwijk C, et al. 2004; Halstensen A,

et al. 2006). TaqMan-metoderna TMAV och MGB är baserade på specifika primrar för Fusarium avenaceum och bör ge en specifik amplifiering. Primrarna är designade utifrån RAPD-fragment (random amplification polymorphic DNA), vilka är korta primrar som amplifierar slumpmässigt valda delar av genomet. Det som undersökts i denna studie är metodernas specificitet, det vill säga förmågan att inkludera sökt DNA och exkludera övriga arters DNA, samtidigt undersöks hur robusta metoderna är gällande deras förmåga att klara av eventuella förändringar i olika parametrar. Dessutom undersöktes metodernas effektivitet, hur effektivt fragmenten amplifieras vid varje cykel samt precision, vilket är detsamma som metodernas reproducerbarhet. För att eventuellt i framtiden kunna effektivisera analysarbetet med reducerat antal analyser gjordes också ett försök till att utföra en duplexanalys för Fusarium avenaceum och Fusarium poae. Det slutliga steget inom studien var att utvärdera om någon av dessa metoder kan användas för detektion av Fusarium avenaceum i naturligt kontaminerade prover från vete. Om metodvalideringsstegen som beskrivits ovan fungerar kommer metoderna att användas för detektion av Fusarium avenaceum i veteprover (Fredlund E, et al. 2010).

MATERIAL Primrar och Prober Primrar och prober användes enligt de av Halstensen A, et al. 2006 samt Waalwijk C, et al. 2004, publicerade detektionsmetoderna TMAV och MGB (tabell 1). Primer- och probesekvenserna beställdes från Eurofins MWG Operon och Applied Biosystems. Inför duplexanalysen användes också primrar och prober (Tempo) för Fusarium poae som tidigare använts vid andra studier vid Livsmedelsverket, även de beställdes från Eurofins MWG Operon. Tabell 1. Sekvenser för primrar och prober för realtids-pcr av F. avenaceum med metodernatmav och MGB. TMAV-sekvenserna från Halstensen A, et al. 2006, MGB-sekvenserna från Waalwijk C, et al. 2004. Primer/Probe Sekvens Art TMAVf 5 -aga tcg gac aat ggt gca tta taa-3 F. avenaceum TMAVr 5 -ggc cct act att tac tct tgc ttt tg-3 F. avenaceum TMAVp 5 -ctc ctg aga ggt ccc aga gat gaa cat aac ttc-3 F. avenaceum MGB-F 5 -cca tcg ccg tgg ctt tc-3 F. avenaceum MGB-R 5 -caa gcc cac aga cac gtt gt-3 F. avenaceum MGB-P 5 -acg caa ttg act att gc-3 F. avenaceum Referensstammar Inför metodvalidering av realtids-pcr gjordes ett urval av stammar från relevanta arter av Fusarium och inför utförandet av inklusions- och exklusionstest. De arter som valdes ut var F. avenaceum, F. acuminatum, F. culmorum, F. graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. tricinctum, F. oxysporum, F. equiseti, F. Solani och F. langsethiae. Sammanlagt

analyserades 19 stammar från tio olika referensarter (tabell 3). Några stammar beställdes från CBS, (Centraalbureau voor Schimmelcultures, http://www.cbs.knaw.nl/ 100317) och några fanns att tillgå vid laboratoriets eget mögelsvampsförråd. Stammarna ympades på PDAplattor, det vill säga agrarplattor med substratet potato dextros, där DNA extraherades för att sedan amplifieras. Spannmål, vete Extraherat DNA från 31 veteprover från en tidigare kartläggningsstudie av andra fusariumarter vilka fanns bevarade i frys -20ºC. Veteproverna kom från den svenska skörden 2009. METOD Frystorkning av mycel till referensstam För att garantera att analyserna utförs med F. avenaceum användes renodlade isolat som referensstammar. Mycelet av referensstammen F. avenaceum J19, som odlats på PDA-plattor, ympades i ME-buljong och inkuberades ca 5 dagar under skakning 1000-g, 25±0,5ºC, för optimal tillväxt. Efter tillväxt tvättades mycelet i sterilt vatten, centrifugerades och frystorkades i -20ºC (Fredlund E, et al. 2008). DNA-extraktion av mögelsvamp, referensstam DNA-extraktion från mycelet F. avenaceum J 19 gjordes med en modifierad metod från Qiagen DNeasy Plant kit (Fredlund E, et al. 2008; Fredlund E, et al. 2010; Fredricks D, et al

2005). Extraktionen gjordes i fyra steg: lysering, bindning, tvättning och eluering. Lyseringen av F. avenaceum-dna gjordes i homogeniseringsrör Lysing Matrix A-rör (BIO101 Systems, Qbiogene). För att en lättare mekanisk sönderdelning ska ske innehåller rören homogeniseringskulor och korn av grafit. Lysatet applicerades i spinnkolonner. Två olika kolonner användes. I den första bands cellulärt avfall och i den efterföljande bands DNA. För att få DNA i en ren form tvättades den senare med AE-buffert varefter DNA eluerades. Extraktionen (Qiagen DNeasy Plant kit) utfördes enligt instruktioner från beställningsföretaget. Cirka 20 mg mycel vägdes upp i fyra FastPrep-rör (BIO101 Systems, Qbiogene). Till varje rör tillsattes 200 µl S3-lysbuffert, 200 µl AP1-buffert (Qiagen), 4 µl RNA och 5µl Protease K. Rören skakades i FastPrep (FP120) för homogenisering i 20 sekunder vid 5000-g och inkuberades sedan under en timme i 65ºC. Efter inkubering tillsattes 130 µl AP2-buffert (Qiagen) och proverna inkuberades i fem minuter på is. Proverna centrifugerades under fem minuter vid 14000-g och supernatanten överfördes till QIAshredder Mini-spinnkolonn med uppsamlingsrör och centrifugerades igen. Lysatet blandades med en volym fenol: kloroform: isoamyalkohol (25:24:1) och centrifugerades fem minuter vid maxhastigheten 14000-g. Den övre fasen pipetterades till ett nytt rör där 1 volym kloroform: isoamyalkohol (24:1) tillsattes. Momentet med kloroform: isoamyalkohol upprepades två gånger. Efter reningsstegen tillsattes 1,5 volym AP3/etanol-buffert (Qiagen) och lysatet pipetterades till DNeasy-spinnkolonn som centrifugerades en minut vid 8000-g. Spinnkolonnen placerades i ett nytt uppsamlingsrör, tvättades med 500 µl AW-buffert (Qiagen) och centrifugerades en minut vid 8000-g. Steget upprepades men nu centrifugerades kolonnen i en minut vid maxhastigheten 14000-g. Spinnkolonnen placerades i ett nytt eppendorfrör och för eluering av DNA tillsattes 100 µl AE-buffert (Qiagen) och inkuberades därefter under fem minuter i rumstemperatur och centrifugerades sedan en minut vid 8000-g. Provet kunde därefter koncentrationsbestämmas för att kontrollera renheten.

Koncentrationsbestämning av extraherat DNA Koncentrationen mättes med hjälp av NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer. Renheten för DNA skall enligt Applied Biosystems rekommendationer vara ca 1,6 1,8 för absorbanskvoten 260/280 och 2,0 för kvoten 260/230. Om renheten var godkänd poolades proven ihop till ett rör och koncentrationen mättes igen. Mätningen upprepades fyra gånger. Provet aliquoterades med 15 µl till 15 eppendorfrör och förvarades i frys -20ºC. Realtids-PCR Realtids-PCR utfördes (tabell 1) utifrån två publicerade metoder, TMAV (Waalwijk C, et al. 2004) och MGB (Halstensen A, et al. 2006). I båda metoderna användes TaqMan-prober. Analyserna utfördes på ABI 7500-Applied Biosystems med 96-hålsplatta. Proverna med extraherat DNA tinades och värmdes i en minut till 90ºC för att minska bildningen av sekundärstrukturer. Koncentrationen på det ospädda provet mättes inför varje analys. Av DNA-koncentratet gjordes en spädningsserie i fem steg med 45 µl sterilt vatten och 5 µl DNA till varje standardkurva med referensarten för F. avenaceum J 19. En reaktionsmix innehållande TaqMan universal Master mix (Applied Biosystems; no:4324018), där primrar och prober blandades till varje metod för bindning av DNA. Mängden av varje reagens beräknades med hjälp av en mall (tabell 2). Från reaktionsmixen pipetterades 21 µl till amplifieringsplattans brunnar (MicroAmp Oprical 96-Well Reaktion Plate with Barcode). Amplifieringsplattans brunnar ska innehålla en total volym på 25 µl, varvid 4 µl från det spädda DNA-koncentratet pipetterades till varje brunn. Plattan analyserades enligt ett förutbestämt program för realtids-pcr (ABI 7500-Applied Biosystems).

Tabell 2. Reaktionsmix till realtids-pcr för F. avenaceum. TaqMan mastermix TaqMan mastermix TMAV-system (Halstensen A, et al. 2006) MGB-system (Waalwijk C, et al. 2004) Ingrediens 1 reaktion Ingrediens 1 reaktion Antal reaktioner 1 Antal reaktioner 1 Mastermix, AB x2 12,5 µl Mastermix, AB x2 12,5 µl TMAVf 10µM 0,9 µl MGB F 10µM 0,9 µl TMAVr 10µM 0,9 µl MGB R 10µM 0,9 µl TMAVp (HEX) 1µM 2,5 µl MGB P (VIC) 1µM 2,5 µl H 2 O 4,2 µl H 2 O 4,2 µl Summa 21 µl Summa 21 µl Templat 4 µl Templat 4 µl Totalvolym 25 µl Totalvolym 25 µl Specificitet För att säkerställa specificiteten för metoderna med realtids-pcr gjordes ett inklusions- och exklusionstest vilka krävs för att kontrollera att metoderna både kan inkludera Fusarium avenaceum och exkludera andra stammar av fusariumarter än målorganismen. Testet gjordes på tio olika referensarter: F. avenaceum, F. acuminatum, F. culmorum, F. graminearum, F. sporotrichioides, F. poae, F. tricinctum, F. oxysporum, F. equiseti, F. Solani och F. langsethiae. Sammanlagt analyserades 19 stammar från de tio olika referensarterna (tabell 3). DNA-extrakt från respektive stam späddes tio gånger och kördes som duplikat. Resultaten anges som positiva eller negativa därför användes en positiv internkontroll (IPC, Applied Biosystems) för att undvika falskt negativa resultat.

Tabell 3. Tabell över referensstammar för inklusion- och exklusionsanalys. Art Stamnummer F. acuminatum CBS 618.87 F. avenaceum J 19 F. avenaceum CBS 170.31 F. culmorum IBT 2303 F. culmorum SIK 157 F. graminearum IBT 1958 F. graminearum IBT 9609 F. graminearum VI 01025 F. sporotrichioides 1310 F. poae 1226 F. poae M 137 F. poae M 388 F. tricinctum IBT 2015 F. tricinctum CBS 393.93 F. oxysporum M 368 F. oxysporum J 23 F. equiseti SIK 182 F. solani M 290 F. langsethiae 1272

Effektivitet För att kontrollera effektiviteten av realtids-pcr utfördes standardkurvor i triplikat av referensstammen F. avenaceum J 19 på båda TaqMan-metoderna TMAV och MGB (Halstensen A, et al. 2006; Waalwijk C, et al. 2004). Extraherat DNA späddes tio gånger i sex steg. Koncentrationen mättes alltid med NanoDrop Spectrophotometer innan spädning (Fredlund E, et al. 2010). Resultatet för kurvans R 2- värde (lutning) och intercept (skärningspunkt och C T -värde) noterades och effektiviteten beräknades. Robusthet Metodernas robusthet kontrolleras genom att undersöka deras förmåga att klara eventuella variationer av till exempel parametrarna annealingstemperatur och kemikaliekoncentration. Robustheten kontrollerades vid tre olika annealingstemperaturer; 58ºC, 60ºC samt 62ºC. Optimal koncentration av använda reagens, enzym och kemikaliekoncentration undersöktes vid ±20 % (Fredlund E, et al. 2010). För varje prov kördes åtta replikat. Annealingstemperaturen på 60ºC används i ursprungsmetoden (Fredlund E, et al. 2010; Waalwijk C, et al. 2004). För att bestämma optimal koncentration av DNA och minska riskerna för hämningar, utfördes robustheten på en 10-3 -spädd koncentration vilket motsvarade koncentrationen 0,02 ng/µl. 4 µl utspätt DNA tillsattes till amplifieringsbrunnarna innehållande 21 µl reaktionsmix med TaqMan (tabell 4). Resultaten angavs i C T -värde, det vill säga vid vilket cykeltal som fluorescensen passerar tröskelvärdet.

Tabell 4. Reaktionsmix för analys av robusthet för realtids-pcr. Ingrediens Optimal +10% 1 reaktion Ingrediens -20% 1 reaktion Ingrediens +20% 1 reaktion Mastermix, AB x2 12,5 µl Mastermix, AB x2 10 µl Mastermix, AB x2 15 µl Primer, R 10µM 0,9 µl Primer, R 10µM 0,72 µl Primer, R 10µM 1,08 µl Primer, F 10µM 0,9 µl Primer, F 10µM 0,72 µl Primer, F 10µM 1,08 µl Probe 1µM 2,5 µl Probe 1µM 2 µl Probe 1µM 3 µl H 2 O 4,2 µl H 2 0-IPC 7,56 µl H 2 0-IPC 0,84 µl Summa 21 µl Summa 21 µl Summa 21 µl DNA 4 µl DNA 4 µl DNA 4 µl Total volym 25 µl Total volym 25 µl Total volym 25 µl Precision Precision för analysmetoden realtids-pcr (ABI 7500-Applied Biosystems), kontrollerades genom att se överensstämmelsen mellan resultat från tre upprepade analystillfällen. Precisionen utfördes under tre dygn av samma person, i samma laboratorium och med samma, ursprungliga DNA-koncentrationer F. avenceum 1624 pg/µl. Analyserna för TMAV- och MGB-metoderna (Halstensen A, et al. 2006; Waalwijk C, et al. 2004), kördes i triplikat med extraherat DNA som späddes tio gånger i sex steg från den ursprungliga koncentrationen (Fredlund E, et al. 2010) vilken mättes med NanoDrop Spectrophotometer. DNA-kvantifiering av två sekvenser i samma analys För att kunna reducera antalet analyser testades en duplexanalys istället för en singelplexanalys. Duplexanalys innebär att man kvantifierar DNA från två eller flera sekvenser samtidigt. För att kunna detektera flera arters sekvenser behövs en specialgjord mastermix, anpassad för detektion av två eller flera sekvenser. Quanta Perfecta (Multiplex

qpcr SuperMix) är en mastermix som kan användas för detta ändamål och är en färdig beställningsvara. I denna metod utvärderades en duplexanalys för F. avenaceum och F. poae. Vid första steget analyserades båda arterna i singelplex med både TaqMan och Quanta Perfecta mastermix (tabell 4). Målet med första steget var att jämföra amplifieringen vid användning av dessa två olika mastermix. Proverna späddes tio gånger i fem steg från ursprungskoncentrationen (F. poae 4,49 ng/µl, F. avenaceum 1,56 ng/µl). Spädningskoncentrationerna mättes och analyserades i duplikat. I andra steget analyserades F. avenaceum och F. poae tillsammans i duplex (tabell 5). Målet i detta steg var att jämföra singelplex med duplex, det vill säga om närvaron av annan art påverkar amplifieringen. DNA från F. avenaceum och F. poae späddes tio gånger i fem steg, därefter tillsattes 5 µl (4,49 ng/µl) DNA av F. poae till samma spädningsrör som F. avenaceum. Samma sak gjordes då 5 µl (1,56 ng/µl) av F. avenaceum-dna tillsattes till F. poaes spädningsserie. Andra steget upprepades för båda F. avenaceum-metoderna. Vid duplexanalyserna användes endast Quanta Perfecta mastermix. Tabell 5. Tabellen beskriver detaljer för den duplexa analysen. Steg 1 - Singelplex Standardkurvor F. avenaceum TaqMan (TMAV/MGB) F. avenaceum Quanta (TMAV/MGB) F. poae TaqMan F. poae Quanta Steg 2 - Singelplex och duplex med Quanta Perfecta F. avenaceum Singelplex (TMAV/MGB) F. avenaceum Multiplex (TMAV/MGB) 5 µl (4,49 ng/µl) F. poae F. poae Singelplex F. poae 5 µl (1,56 ng/µl) F. avenaceum

Detektion av Fusarium avenaceum i veteprover Målet var att kunna komplettera Livsmedelsverkets kartläggningsstudie med förekomsten av F. avenaceum i veteprover. Analysen gjordes på 31 naturligt kontaminerade veteprover tagna från den svenska skörden 2009. Eftersom proverna redan analyserats tidigare för andra fusariumarter, fanns redan extraherat DNA från samtliga prov bevarade i frys -20ºC. Samtliga prover späddes tio gånger och analyserades i duplikat för de båda F. avenaceum-metoderna TMAV och MGB med realtids-pcr. Inför amplifieringen förbereddes en standardkurva med referensstammen F. avenaceum J 19 där ursprungskoncentrationen 1,3 ng/µl mättes och analyserades i duplikat och därefter späddes tio gånger i fem steg.

RESULTAT Specificitet Av de 19 olika referensstammarna från mögelsvampsarten Fusarium som analyserades användes stammen J 19 från F. avenaceum som referenskontroll vid metodvalideringen av realtids-pcr. Resultatet visade att båda metoderna TMAV och MGB, kunde inkludera två stammar av F. avenaceum J 19 och CBS 170.31. TMAV-metoden kunde exkludera samtliga av de övriga fusariumarterna medan MGB-metoden även visade detektion av stammarna F. tricinctum IBT 2015 och CBS 393.93. Effektivitet Effektiviteten för realtids-pcr var 94 % respektive 98 % (tabell 6). För en godkänd kvantifiering rekommenderas effektiviteten ligga mellan 80 och 110 %. Inom det intervallet fördubblas produkten av realtids-pcr i varje cykel. Resultaten för båda analysmetoderna låg inom detta referensintervall. Effektiviteten fås genom att först i programmet för realtids-pcr (Applied Biosystem 7500), skriva in standardprovernas spädningskoncentrationer som är 18,75 ng/µl för TMAV-metoden och 16,99 ng/µl för MGB-metoden. Standardproverna kan då få en standardkurva med hjälp av interceptvärdet och R 2 -värdet. Med hjälp av dessa värden kunde amplifieringseffektiviteten (E) beräknas. En god amplifiering med en fördubbling av produkten av realtids-pcr per cykel, har en lutning på standardkurvan mellan minus 2 och minus 3. R 2 värdet ska ligga nära 1, då fås en effektivitet som ligger mellan de godkända intervallerna 80 och 110 %.

Tabell 6. Effektiviteten för realtids-pcr vid analysering av F. avenaceum. Prov Primer/probe Lutning Intercept C T R2-värde Effektivitet % F. avenaceum standardkurva TMAV -3,47 42,82 1 94 F. avenaceum standardkurva MGB -3,38 44,16 0,99 98 Robusthet Resultaten visade en stor skillnad i robusthet och metoderna redovisas enskilt med diagram. Figur 1 illustrerar resultaten från TMAV-metoden. C T -värdet var högre ju lägre annealingstemperaturen var och det skilde nästan två enheter mellan 58ºC och 62ºC. Reagenskoncentrationerna påverkade också C T -värdet och generellt var C T -värdet lägre ju lägre reagenskoncentrationen var. MGB-metodens resultat illustreras i figur 2. MGB-metoden visade omvända resultat jämfört med TMAV-metoden. C T -värdet ökade vid högre annealingstemperatur. C T -värdet påverkades inte vid 58ºC av reagenskoncentrationen men vid högre annealingstemperatur blev C T -värdet högre vid lägre reagenskoncentration.

Ct-värde 33 32,5 32 31,5 31 30,5 30 29,5 29 20% Mindre Reagenskonc. Optimal Reagenskonc. 20% Mer Reagenskonc. 28,5 58 60 62 Annealingstemperatur (grader) Figur 1. Variation i annealingstemperaturer och reagenskoncentrationer för TMAV-metod ger olika C T -värden. 37 36 35 Ct-värde 34 33 32 31 20% Mindre Reagenskonc. Optimal Reagenskonc. 20% Mer Reagenskonc. 30 58 60 62 Annealingstemperatur (grader) Figur 2. Variation i olika annealingstemperaturer och reagenskoncentrationer för MGB-metoden ger olika C T -värden.

Precision Analyserna utfördes under tre dygn med tre olika spädningsserier. Figur 3 illustrerar resultaten för sammanlagt nio analyser för varje spädning. R 2 -värdet är nära 1 vilket innebär att båda metoderna var linjära fram till spädningskoncentrationerna 1,6 pg/µl. TMAVmetoden gav lägre C T -värden i jämförelse med MGB-metoden och var linjärt en tiopotens lägre, det vill säga 0,16 pg/µl. Den största spädningen, 10 6 för båda metoderna, valdes att tas bort i figuren då inget DNA kunde detekteras med realtids-pcr. Variationskoefficient (CV) är ett spridningsmått och gör standardavvikelsen för olika skalor jämförbara. En jämförelse mellan CV för varje datapunkt visade att TMAV-metoden varierade mellan 0,48 % och 1,56 % och MGB-metoden varierade mellan 1,2 % och 2,2 % (tabell 7). Precisionsvariationen var större vid lägre koncentration för båda metoderna. 40,00 38,00 36,00 y = 3,1079x + 23,785 R 2 = 0,9891 34,00 Ct-värde 32,00 30,00 y = 3,3636x + 21,466 R 2 = 0,9988 TMAV-metod MGB-metod 28,00 26,00 24,00 22,00 1624 162 16 1,6 0,16 Spädningskoncentration (pg/µl) Figur 3. Precisionen för realtids-pcr för TMAV- och MBG-metoderna med referensstammen F. avenaceum J 19.

Tabell 7. Resultat från precisionsanalysen. Variationsskillnad mellan metoderna vid CV. Koncentration(pg/µl) Medelvärde C T -värde Standardavvikelse CV % TMAV MGB TMAV MGB TMAV MGB 1624 24,86 26,65 0,12 0,59 0,48 2,23 162 28,12 29,99 0,2 0,36 0,7 1,2 16 31,46 33,23 0,33 0,47 1,06 1,42 1,6 35,23 36,98 0,36 0,58 1,01 1,56 0,16 38,12 38,69 0,59 0,48 1,56 1,24 0,016 - - - - - - Kvantifiering av två DNA-sekvenser samtidigt Avsikten med att köra en duplexanalys av F. avenaceum och F. poae tillsammans, var att undersöka om det går att effektivisera arbetet genom att reducera antalet analyser. Vid första steget kördes en singelplex analys för varje art med båda mastermixen TaqMan och Quanta. TMAV-metoden med TaqMan fick en effektivitet på 91 % och med Quanta 104 %. För MGB-metoden var effektiviteten motsatt, då TaqMan gav en effektivitet på 104 % och Quanta 92 %. F. poae skiljde sig endast med 92 % med TaqMan och 93 % för Quanta (tabell 8). Lutningen på kurvorna, interceptet samt effektiviteten låg alla inom det godkända intervallet. För F. avenaceum-analyserna TMAV och MGB, skilde sig effektiviteten mellan TaqMan och Quanta upp till 13 % och för F. poae-analysen endast 1 %. Interceptet visade sig vara lägre med Quanta än med TaqMan för MGB-metoden (tabell 8). I andra steget jämfördes duplexanalyserna med singelplexanalyserna. Ingen stor variation mellan dessa analyser kunde konstateras (tabell 8). För F. avenaceum-analyserna skilde sig effektiviteten endast med 6 % för TMAV-metoden respektive 4 % för MGB-metoden och för F. poae-analysen skilde sig effektiviteten endast med 2 %. Således påverkar inte amplifieringen F. poae eller F. avenaceum. Tmpoae-metoder utförs med specifika primrar

och prober för F. poae-sekvens. Ingen större skillnad vid jämförelse av interceptet kunde konstateras för TMAV- och Tmpoae-metoderna. För MGB-metoden skilde interceptet dock nästan 3 enheter. Tabell 8. Resultat för singelplex- och duplexanalysering. Jämförelse mellan TaqMan och Quanta Perfecta mastermix för F. avenaceum och F. poae samt mellan singelplex- och duplexanalys. Steg 1 Analys - Singelplex Lutning Intercept Effektivitet % TMAV - TaqMan -3,56 25,25 91 TMAV - Quanta -3,23 25,44 104 MGB - TaqMan -3,23 26,91 104 MGB - Quanta -3,54 24,39 92 Tmpoae - TaqMan -3,52 18,28 92 Tmpoae - Quanta -3,49 18,01 93 Steg 2 Analys Lutning Intercept Effektivitet % TMAV singelplex -3,5 29,63 93 TMAV singelplex + 5µl (44,9*10-1 ng/µl) F. poae -3,35 28,53 99 MGB singelplex -3,33 28,32 100 MGB singelplex + 5µl (44,9*10-1 ng/µl) F. poae -3,42 27,5 96 Tmpoae singelplex -3,42 21,18 96 Tmpoae singelplex + 5µl (15,6*10-1 ng/µl) F. avenaceum -3,37 21,63 98 Detektion av Fusarium avenaceum i veteprover 31 vete prover från svensk skörd 2009 analyserades för eventuell detektion av F. avenaceum. Resultatet visade att i samtliga 31 prover kunde F. avenaceum-dna detekteras med TMAVmetoden och MGB-metoden (tabell 9). Resultaten av mängden F. avenaceum i proverna redovisas i pg DNA/mg spannmål. Mängden detekterad F. avenaceum varierade mellan metoderna. Generellt detekterades mer DNA med MGB-metoden än med TMAV-metoden.

En korrelationskurva mellan alla datapunkter visade på dålig korrelation mellan metoderna, då sex datapunkter togs bort; prov 3, 6, 8, 11, 29 och 31, blev korrelationen bättre, R 2 = 0,91 (figur 4). Beslutet att ta bort datapunkterna togs eftersom också MGB-metoden tidigare visat sig detektera även F. tricinctum. Tabell 9. DNA-koncentrationer från 31 okända veteprover med detektionsmetoderna TMAV och MGB. Prover med DNA under 100 pg/mg kan bero på hög spädning. Veteprov Medelvärde TMAV (pg DNA/mg spannmål) Medelvärde MGB (pg DNA/mg spannmål) 1 327,5 1450 2 276,5 492 3 1280 17200 4 404,5 1730 5 771 2625 6 551,5 4905 7 >100 1535 8 454,5 7675 9 >100 236,5 10 >100 306 11 207,5 2855 12 >100 >100 13 >100 527,5 14 >100 112 15 >100 174,5 16 >100 246,5 17 >100 209 18 3845 6670 19 1805 2895 20 946 1255 21 511,5 1735 22 453 680 23 356 424,5 24 873 1500 25 981 1445 26 3545 5625 27 930 1455 28 964,5 1690 29 198 3350 30 996 2785 31 1008 3240

MGB (pg/mg) 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 y = 1,5568x + 375,06 R 2 = 0,9069 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 TMAV (pg/mg) Figur 4. Korrelationskurva som illustrerar förhållandet mellan TMAV- och MGB-metoderna.

DISKUSSION Realtids-PCR används för bland annat detektion av mykotoxinbildande mögelsvampars DNA med goda resultat sedan 2004 där analysmetoden använts inom liknande projekt (Waalwijk C, et al. 2004; Halstensen A, et al. 2006; Yli-Mattila T, et al. 2006; Fredlund E, et al. 2008). Primrarna för TMAV- och MGB-metoderna utvärderades i studien då de i tidigare projekt i andra Nordeuropeiska länder påvisat Fusarium avenaceum. För att garantera att TMAV- och MGB-metodernas primrar är riktade specifikt för målsekvensen för F. avenaceum utfördes ett inklusions- och exklusionstest. Analys gjordes av 19 olika referensstammar av mögelsvampsarten Fusarium med realtids-pcr, där inkluderades även F. avenaceumstammar som skulle användas för metodvalidering. Som referensstam valdes J 19 då den visade positiv detektion för båda metoderna (tabell 5). Analysen visade att båda metoderna TMAV och MGB kunde inkludera arten F. avenaceum och exkludera övriga arter, med undantag från MGB-metoden som även kunde detektera arten F. tricinctum. Detta innebär att MGB-metoden inte ger en specifik detektion av arten F. avenaceum och därför endast kommer att användas vid analyser där detektion av både F. avenaceum och F. tricinctum är önskvärd (tabell 5). Då F. tricinctum är mer vanligt förekommande än F. avenaceum och liksom F. avenaceum bildar mykotoxinet enniatin, genomfördes validering även för denna metod samtidigt inom den generella kartläggningsstudien. Metodvalideringen visade en effektivitet för Fusarium avenaceum-metoderna TMAV och MGB på 94 % respektive 98 %. Effektiviteten för metoderna med realtids-pcr är då godkända eftersom de ligger mellan intervallen 80 och 110 %. Att effektiviteten är inom intervallen innebär att DNA-sekvenserna amplifieras effektivt och kan användas för

kvantifiering. Ett effektivitetsvärde närmare 100 % betyder att vid varje cykel sker en fördubbling av antalet PCR-produkter per cykel, vilket resultaten för båda metoderna visade. Robusthetsanalys av metoderna visade en skillnad mellan TMAV- och MGB-metoden. Metoden TMAV var mer robust vid hög annealingstemperatur, 62ºC, med låg reagenskoncentration. Det innebär att en realtids-pcr med TMAV-primrar i framtiden skulle kunna modifieras och användas i studier för specifik detektion av F. avenaceum när så önskas. För MGB-metoden visade resultaten att metoden var mest robust vid en låg annealingstemperatur, 58ºC. En högre reagenskoncentration resulterade också i mer rubusthet. Eftersom MGB-metoden även visade att den kunde detektera F. tricinctum-sekvenser kan metoden rekommenderas vid duplexanalysering, då detektion av F. tricinctum och F. avenaceum tillsammans önskas. Vid jämförelse av tidigare studier av andra fusariumarter har det visats att ingen stor variation av temperatur eller koncentration har påverkat resultaten enligt artikel av Fredlund E, et al. 2010. I artikeln redovisas att generellt ger högre temperatur ett högre C T -värde och lägre temperatur ett lägre C T -värde. Denna slutsats överensstämmer med de resultat som erhölls med MGB-metoden men inte med TMAV-metoden. Resultaten för precision visade att TMAV-metoden var linjär till koncentrationen 0,16 pg/µl och MGB-metoden till 1,6 pg/µl. Precisionen blev sämre vid lägre koncentrationer, vilket överensstämmer med tidigare studier som gjorts (Fredlund E, et al. 2010). Det innebär att metoden får en sämre och större precisionsvariation vid högre spädningskoncentrationer till skillnad från MGB-metoden som hade ett högre CV-värde redan vid låga spädningskoncentrationer. Slutsatsen som kan dras är att TMAV-metoden uppvisade bättre precision än MGB-metoden. Sammanfattningsvis visade metodvalideringsresultaten för inklusion och exklusion, robusthet, effektivitet och precision för TMAV-metoden att den inkluderar F. avenaceum och

exkluderar andra arter. Metoden var mest robust vid högre annealingstemperatur, 62ºC, och med lägre reagenskoncentration, amplifieringseffektiviteten för realtids-pcr var inom godkänt intervall och gav minst precisionsvariation vid spädning 10-1 till 10-4. MGB-metoden detekterade inte endast F. avenaceum utan även F. tricinctum. Metoden var som mest robust vid lägre annealingstemperaturer och högre reagenskoncentration men hade liksom TMAVmetoden en god amplifieringseffektivitet. MGB-metoden visade ett högre CV vid lägre koncentrationer, vilket innebär en stor precisionsvariation. Det som kan konstateras är att F. avenaceum bör analyseras med TMAV-metoden och anpassas till robustheten. MGB-metoden rekommenderas vid duplex analys då detektion av F. avenaceum och F. tricinctum önskas. För att i framtiden kunna effektivisera arbetet testades en duplexanalys där respektive detektionsmetod för F. avenaceum användes i kombination med en detektionsmetod för F. poae. Den specialgjorda mastermixen som kunde detektera två målsekvenser Quanta Perfecta, visade ett bättre och tidigare amplifieringsvärde för både F. avenaceum och F. poae i jämförelse med singelplex analysering med tillhörande originalmastermix TaqMan. En duplexanalys skulle kunna visa sig relevant att köra i framtiden. Vid detektion av okända veteprover användes båda detektionsmetoderna för F. avenaceum. TMAV-metoden kunde detektera målsekvensen i samtliga 31 prover, dock i en mycket låg mängd i vissa fall (tabell 7). MGB-metoden kunde likaså detektera en viss mängd av F. avenaceum i alla 31 prover. Skillnaden mellan metoderna var dock att MGB-metoden detekterade en högre mängd F. avenaceum-dna än vad TMAV-metoden kunde göra på samma prover. Eftersom MGB-metoden vid specificitetsanalysen visade att även F. tricinctum kunde detekteras, kan det vara en orsak till den stora spridningen på korrelationskurvan mellan de två metoderna och ett R 2 -värde på 0,22 (figur 4). När punkter med höga detekterade DNA-mängder togs bort från korrelationskurvan blev det ett bättre

R 2 - värde, 0,91 (figur 4). MGB-metodens höga DNA-resultat kan alltså ha orsakats av att spår från F. tricinctum amplifierats. Av metodvalideringen kan slutsatsen dras att båda metoderna kan användas för detektion av F. avenaceum i naturligt kontaminerade prover från vete. MGB-metoden kan även kombineras vid en önskad detektion av F. tricinctum och F. avenaceum i samma analys. TMAV-metoden ger en specifik detektion av F. avenaceum men kan optimeras ytterligare vad gäller annealingstemperatur och reagenskoncentration. Båda metoderna kan användas i duplex analysering med F. poae. I framtiden kommer metoderna att kunna inkluderas i kartläggningsprojekt där ett intresse finns att kvantifiera enniatinproducerande mögelsvampar. Från tidigare publicerade arbeten om enniatinproducerande svampar i andra länder har man lyckats detektera F. avenaceum med TMAV-primrar och prober i vete (Yli-Mattila T, et al. 2006; Halstensen A, et al. 2006). Det kan nu konstateras att tillväxt av enniatinproducerande svampar som Fusarium avenaceum finns i Sverige.

REFERENSER Fredlund E, Gidlund A, et al. Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods. 2008 73(1), s. 33-40 Fredlund E, Gidlund A, et al. Real time-pcr detection of Fusarium species in Sweden oats and correlation to T-2 and HT-2 toxin content. World Mycotoxin Journal. 2010 (3), s. 77-88 Fredricks D, Smith C, et al. Comparison of six DNA extraction methods for recovery of fungal DNA as assessed by quantitative PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2005 (43:10), s. 5122-5128 Halstensen A, Nordby K, et al. Real time-pcr-detection of toxigenic Fusarium in airborde and settled grain dust and associations with trichotecene mycotoxins. Journal of Environmental Monitoring. 2006 (8), s. 1235-1241 Kubista M, Andrade J. M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006 (27), s. 95-125 Nicolaisen M, Suproniene S, et al. Realtime-PCR for quantification of eleven individual Fusarium species in cereals. Journal of Microbiological Methods. 2009 (76:3), s. 234-240 Schaafsma A.W, Hooker D.C, et al. Climatic models to predict occurrence of Fusarium toxins in wheat and maize. International Journal of Food Microbiology. 2007 (119), s. 116-125

Uhlig S, Jeestoi M, et al. Fusarium avenaceum The North European situation. International Journal if food Microbiology. 2007 (119), s. 17-24 Waalwijk C, van der Heide R, et al. Quantitative detection of Fusarium species in wheat using TaqMan. European Journal of Plant Pathology. 2004 (110), s. 481-494 Yli-Mattila T, Paavanen-Huhtala S, et al. Genetic variation, real-time PCR, metabolites and mycotoxins of Fusarium avenaceum and related species. Mycotoxin Research. 2006 (22:2), s. 79-86