Toxikologisk screening av fältprover - Är det möjligt?

Transkript

1 Toxikologisk screening av fältprover - Är det möjligt? Per Leffler CBRN Skydd och Säkerhet FOI Vad krävs för Toxikologisk screening Testsystem hög through-put Geografisk utbredning Bioassay med relevant end-point Reproducerbarhet och Säkerhet 1

2 Test systems Persoone, 1983 Vägen till bioscreening och Säkerhet 2

3 Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i smältverksgradient (CF-anslag) och Säkerhet 3

4 Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork forts Urkalkning av benvävnad. och Säkerhet 4

5 Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork forts Urkalkning av benvävnad Markextrakt L929-celler - PLExtrakt Examensarbete Daniel Ragnvaldsson Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork forts Urkalkning av benvävnad Markextrakt 4 platser L929-celler - PLExtrakt. Examensarbete Daniel Ragnvaldsson 2002 L929-Celltest av spikad jord Cd, Fenol, Klorbensen, Tetraklorvinfos och Säkerhet 5

6 Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork Urkalkning av benvävnad Markextrakt 4 platser L929-celler - PLExtrakt. Examensarbete Daniel Ragnvaldsson 2002 L929-Celltest av spikad jord Cd, Fenol, Klorbensen, Tetraklorvinfos 2003 Case study - Hansson Pyrotekniska PLExtrakt + Toxtester + ICPMS-metallanalys Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork Urkalkning av benvävnad Markextrakt 4 platser L929-celler - PLExtrakt. Examensarbete Daniel Ragnvaldsson 2002 L929-Celltest av spikad jord Cd, Fenol, Klorbensen, Tetraklorvinfos 2003 Case study - Hansson Pyrotekniska - PLExtrakt + Toxtester + ICPMS-metallanalys 2004 Toxikogenomik - L929 + gene-chip - Cd, PCP, TNT och Säkerhet 6

7 Vägen till bioscreening 1996 Blodceller - metallexponering via cigarettrök 1997 Cellkultur jordextrakt - blandexponering i gradient från smältverk (CF-anslag) 1998 Jordextrakt batchlakning - L929-celler. Examensarbete Helena Hallgren 1999 Sork Urkalkning av benvävnad Markextrakt 4 platser L929-celler - PLExtrakt. Examensarbete Daniel Ragnvaldsson 2002 L929-Celltest av spikad jord Cd, Fenol, Klorbensen, Tetraklorvinfos 2003 Case study - Hansson Pyrotekniska - PLExtrakt + Toxtester + ICPMS-metallanalys 2004 Toxikogenomik - L929 + gene-chip - Cd, PCP, TNT 2006 CCA-jord - DRAG-test + Metallspeciering - As(III), As(V) Modell Sorktox Rönnskär Burön Vindeln och Säkerhet 7

8 Rönnskär Burön Modell Sorktox Vindeln BURÖN VINDELN Cd-R µg/g UProt µg/24h/g bw = 135, ,048 * Cd-R µg/g; R^2 =,223; p<0.023; N=23 Figure 4. Relation between proteinuria (Uprot) and kidney cadmium concentration (Cd-R) in bank voles sampled at BURÖN and VINDELN. Rönnskär Modell Sorktox Burön Vindeln Cd-Bone/all (µg/kg ww), p< *** BURÖN VINDELN Cd-R µg/g UProt µg/24h/g bw = 135, ,048 * Cd-R µg/g; R^2 =,223; p<0.023; N=23 Figure 4. Relation between proteinuria (Uprot) and kidney cadmium concentration (Cd-R) in bank voles sampled at BURÖN and VINDELN. Cd-Bone/female (µg/kg ww), p<0.05 Ca-Bone/all (mg/g ww), not significant * Polluted area Control area Osteoporosis Osteomalacia Ca-Bone/female (mg/g ww), p< ** och Säkerhet 8

9 System Batch-extrakt + L929 Rudtjärn Rönnskär Burön Holmsvattnet Tavelsjö 4 sites 16 samples 14 hrs batch leaching 72 hrs L929 assay Hallgren Examensuppsats. Rudtjärn Rönnskär Burön Holmsvattnet Tavelsjö System Batch-extrakt + L929 Table. Inhibition of cell growth (ICG); 50% extract Sampling Mean-% Stdev N km Rudtjärn * 95,4 1, Burön # 95,1 0, Holmsvattnet 92,7 6, Tavelsjö *# 88,3 13, * p = 0.02 # p = 0.03 (MWU-test) Hallgren, Inhiberad celltillväxt (ICG) vid 2x spädning. och Säkerhet 9

10 System PLE + L929 Figure 2. Variation in cytotoxicity with extraction temperature for extracts from the Polluted sediment C e llula r v ia bility norm a lize d to controls 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Extract concentration (vol%) 200oC 50oC 26oC Ragnvaldsson & Leffler Poster SETAC. PLE Trycksatt vätskeextraktion Spädningsserie 50-1% L929 toxicity test System Grid-sampling + 2 bioassays LUMITOX 96 well assay Bioluminescence 46 soil samples PLE Dilution 50-1% L929 toxicity assay Vibrio fischeri assay L929 och Säkerhet 10

11 System Grid-sampling + 2 bioassays LUMITOX 96 well assay Bioluminescence 46 soil samples PLE Dilution 50-1% L929 toxicity assay Vibrio fischeri assay ROTAS - field adapted L929 Vibrio fischerii (bioluminescent) A System Grid-sampling + 2 bioassays Figure. Correlation to ph (2A) for L-929 (R 2 = 0.92) and V.fischeri (R 2 =0.83). Ragnvaldsson et al, Fig. 1. Geographical overview of Toxic points according to the two bioassays V. fischeri (luminescent) and L-929 (cytotox). och Säkerhet 11

12 System DRAG - genotoxicity assay CCA-soil; Arsenikproblematik Extracts: Batch1/10 + PLE: o C Dilution 50-1% DRAG-test on CHOcells AA8 - vildtyp/normal UV4 - defekt DNA-reparation 1 UV5 - defekt DNA-reparation 2 EM9 - defekt DNA-reparation 3 System DRAG - genotoxicity assay d Batch leachate (L/S=10) Robertsfors Soil c PLE50 C leachate Robertsfors soil Cell growth (fraction of Control) Cell growth (fraction of Control) AA8 UV UV5 EM AA8 UV4 UV5 EM As 3+ ng/l As 3+ ng/l CHO UV5+EM9 deviate at 50% extract addition och Säkerhet 12

13 System DRAG - genotoxicity assay d Batch leachate (L/S=10) Robertsfors Soil c PLE50 C leachate Robertsfors soil Cell growth (fraction of Control) Cell growth (fraction of Control) AA8 UV UV5 EM AA8 UV4 UV5 EM As 3+ ng/l As 3+ ng/l CHO UV5+EM9 deviate at 50% extract addition CHO UV5 inhibited at 100 times lower level System Toxikogenomics Precultivation of L929 cells Controlled exposure i culture medium; parallell test and control cultures RNA extract RNA reverted cdna-cy3 RNA extract RNA reverted cdna-cy5 Mouse genome genprobes Hybridisation on mouse-genechip; RATIO = GENE EXPOSED /GENE CONTROL Laser-scanning of gene-chip Cl-Cd-Cl och Säkerhet 13

14 System Toxikogenomics MT1 and HSP gene expression ratios in L929 cell culture at different Cd doses 4,5 Mouse genome genprobes RATIO Exposed/Controls 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 µm Cd 3 µm Cd 9 µm Cd MT1 HSP Cl-Cd-Cl System PCP exposure System PCP exposure GenBankID KOGdescription UmUdescription KOGclassification Ratio AW nudix (nucleosid e diphosphat Leffler e linked and Nyholm, 1996 moiety X)- type motif 14 Uncharacteriz ed NUDIX family hydrolas e General function prediction only 11,1 BG procollagen, type III, alpha 1 Collagens (type IV and type XIII), and related proteins Extracellular structures 0,12 Cl-Cd-Cl och Säkerhet 14

15 System TNT exposure System TNT exposure GenBankID KOGdescription UmUdescription KOGclassification Ratio BG glutathione S transferase, alpha 4 glutathione S transferase, alpha 4 Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 4.0 BG anti-oxidant peroxiredoxin 6 protein 2 Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 2.8 AI Proteasome (prosome, macropain)26s subunit, non-atpase, 2 Proteasome (prosome, macropain)26s subunit, non-atpase, 2 Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 2.5 BG procollagen, type III,alpha 1 procollagen, type III, alpha 1 Extracellular structures 0,34 Cl-Cd-Cl Ny Arena för bioassays Persoone, 1983 och Säkerhet 15

16 Sensitivity Vassare bioassays Inhibition ATP Energy Oxidative deficiency deprevation Phosphoryl Stepwise process Sensitivity Vassare bioassays Inhibition ATP Energy Oxidative deficiency deprevation Phosphoryl Cell dysfunction Low Cell division Tissue atrophy Stepwise process och Säkerhet 16

17 Sensitivity Vassare bioassays Inhibition ATP Energy Oxidative deficiency deprevation Phosphoryl Cell dysfunction Low Cell division Tissue atrophy Geno toxicity Tumour cell Cancer Stepwise process Sensitivity Vassare bioassays Inhibition ATP Energy Oxidative deficiency deprevation Phosphoryl Cell dysfunction Low Cell division Tissue atrophy Geno toxicity Tumour cell Cancer Hormone disruption Gameto toxicity Infertility Stepwise process och Säkerhet 17

18 Sensitivity Inhibition Oxidative ATP Energy Phosphoryl deficiency deprevation Vassare bioassays Cell dysfunction Low Cell division Tissue atrophy Geno toxicity Tumour cell Cancer Hormone disruption Gameto toxicity Infertility Cytokine disorder Immune disorder Infection Allergy Stepwise process Sensitivity Vassare bioassays Inhibition ATP Energy Oxidative deficiency deprevation Phosphoryl Cell dysfunction Low Cell division Tissue atrophy Gene *expression *function Geno toxicity Hormone disruption Tumour cell Gameto toxicity Cancer Infertility Cytokine disorder Immune disorder Infection Allergy Stepwise process och Säkerhet 18

19 Toxikologisk screening av fältprover? Är möjligt med bakterien V. Fischeri i fält för kartläggning - ej bevisföring för ATP-toxiska föroreningar Kan utföras med L929- och CHO-däggdjurceller på laboratorium för celltoxiska föroreningar för genotoxiska föroreningar Group: Mona Koch Rune Berglind Daniel Ragnvaldsson Sara Andersson Helena Hallgren END Anders Lättström Solomon Tesfalidet Lars Lövgren Magnus Bergknut Mats Tysklind David Gunnarsson Gunnar Selstam och Säkerhet 19