Föreläsningens innehåll Eukaryot proteinexpression 9:e november 2009 Patrik Samuelson översikt eukaryota värdar och expressionsvektorer (='budbärare') Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Baculovirus/insektsceller däggdjursceller = mammalieceller Prokaryot vs Eukaryot Prokaryot vs Eukaryot Prokaryot plasmidexpression vanligast inducerbara promotorsystem billigt sekretionssystem - underlättar rening höga expressionsnivåer (upp till 5g/l) Eukaryot inga bakteriella cellkomponenter posttranslationella förändringar AcMNPV Vad avgör val av värd-vektorsystem? struktur hos proteinet - posttranslationella modifieringar användningsområde - in vivo - in vitro - struktur/funktionsstudie mängdbehov tidsperspektiv kostnad Posttranslationella modifieringar disulfidbindningar proteolytisk processning glykosyleringar fosforyleringar, sulfatering, acetylering, acylering, γ-karboxylering fettsyraaddering (C14, C16) 1
Glycosylation Linkage of carbohydrate side chains to glycoproteins Glycosylation adds carbohydrate chains to proteins to form glycoproteins. The carbohydrate moieties play important roles in protein folding in the ER, in targeting proteins for transport, and as recognition sites in cell-cell interactions. N-linked glycoproteins: the carbohydrate is attached to the N atom in the side chain of asparagine. O-linked glycoproteins: the carbohydrate is attached to the O atom in the side chain of serine or threonine. Synthesis of N-linked glycoproteins Processing of N-linked oligosaccharides N-länkad glykosylering Examples of O-linked oligosaccharides 2
O-länkad glykosylering Structure of a GPI anchor Eukaryota värdar för proteinproduktion jäst insektsceller däggdjursceller växtceller Transformationsmetoder - protoplaster - litiumacetat - elektroporering Transfektionsmetoder - DNA fällt med Ca-fosfat eller DEAE-dextran - elektroporering - lipofektion - gene gun Generell eukaryot expressionsvektor eukaryot promotor, polyadenyleringssignal och termineringssekvens (transkription) selekterbar markör funktionell i eukaryot cell selekterbar markör funktionell i prokaryot ori funktionellt i eukaryot cell ori funktionellt i prokaryot Expressionsvektor för mammalieceller Jästarter Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Hansenula polymorpha Schizosaccharomyces pombe Candida utilis Invitrogen 3
Advantages of yeast expression systems Saccharomyces cerevisiae High yield High productivity Chemically defined media Product processing similar to mammalian cells Stable production strains Durability Low protein production cost Enkel och billig att odla i stor skala Väl karaktäriserad genetiskt och fysiologiskt Sekreterar få proteiner naturligt Naturligt förkommande plasmid Fungerande sekretionsmaskineri Etablerade selektionssystem finns GRAS-organism (generally recognized as safe) Jästvektorer Episomal jästvektor (2µm) Plasmidvektorer = episomal vektor - ofta instabil vid större odling Integrerande vektorer - endast en genkopia - tandem arrays tenderar till att vara instabila Yeast artificial chromosome (YAC) - kan härbärgera stora fragment - bevaras som separat kromosom - analys och sekvenerig av stora genfragment - ej primärt för proteinproduktion Integrerande vektor (jäst) YAC system 4
Ökning av gendosen Promotorer och signalsekvenser Multipla kopior efter varandra Genamplifiering - His4/Tn903KanR (G418) 50-100 kopior - Sh ble/zeocin Promotorer: Starka - AOX1 (inducerbar) - GAPD (konst.) - FLD1 (ind.) Medel - PEX8 (ind.) Svag - YPT1 (konst.) Signalsekvenser: S. cerevisiae α-mf P. pastoris acid phosphatase (PHO1) C. rugosa Lip1 Phaseolus vulgaris agglutinin (PHA-E) Sekretion Nackdelar med S. cerevisiae Glykosylering vid sekretion Pre-pro-α-faktor = signalpeptid Lys-Arg-linker signalpeptid klyvs av endoproteas Sekretionsmaskineriets proteiner kan modifieras Plasmider förloras ofta vid odling i stor skala Hyperglykosylerar proteiner Vanligt med periplasmatiska proteiner istället för sekreterade Fermenterar socker till etanol (Crabtreeeffekt) Pichia pastoris Pichia pastoris Ungefär samma karaktäristika som S. cerevisiae, i övrigt gäller dessutom: Stark och strikt reglerad promotor (AOX1) Ingen etanolproduktion Sekreterar färre proteiner än S. cerevisiae Ofta hög produktion Förhöjd proteolys 5
Aspergillus Baculovirus Stor sekretionskapacitet (naturligt) Snabbväxande Hög celltäthet Rel. hög proteasaktivitet en av de största virusfamiljerna infekterar ryggradslösa djur - insekter (ca. 600) - skaldjur cirkulärt ds-dna, 80-220 kb Stavformig, membranomsluten viruspartikel tre subgrupper - Nuclear polyhedrosis viruses - Granulosis viruses - n-occluded viruses Baculovirus infekterar insektsceller AcMNPV polyhedrin-kapsel ut i omgivningen äts av ny insekt polyhedrin-kapseln löses upp i mag-tarmkanalen och virioner kan infektera nya celler Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus infekterar ett 30-tal insekter (främst nattfjärilar). proteinösa nukleära ocklusionskroppar genexpression tidigt och sent (polyhedrin, p10) i replikationscykeln starka promotorer AcMNPV Advantages of baculovirus-assisted insect cell expression Budding virus particles Polyhedron embedded viruses Eukaryotic post-translational modification Proper protein folding and function High expression levels Easy scale up with high-density suspension culture Safety 6
Insektscell-linjer Spodoptera frugiperda (Cabbage looper) Sf21 (from ovarian cells) Sf9 (from ovarian cells) Sf9 Trichoplusia ni High-Five (BTI-TN-5B1-4) (from egg cells) doubling time: 18-24 h Baculovirus transfer vector Bacmid: E. coli -insektscells-skyttelvektor Proteinproduktion i däggdjursceller Introduction of DNA into animal cells Fördelar: autentiska posttranslationella modifieringar väl stabila är cellinjer pålitliga Nackdelar dyrt 7
Retroviral vectors Expression approaches Mammalie-cellinjer African green monkey Transient=övergående expression - African green monkey kidney cells (COS) - Baby hamster kidney cells (BHK) - Human embryonic kidney cells (HEK-293) Stabil expression - Chinese hamster ovary cells (CHO) - Myeloma cells (Sp2/0, J558L) - Murine erythroleukemia cells (MEL) COS-1 (kidney fibroblast) Amplifiering av genomregioner Hydroxy urea Aphidicolin UV- eller gammastrålning Carcinogener DHFR (Dihydrofolat reduktas)-mtx (methotrexate) GS (Glutamin syntas)-msx (methionine sulfoximine) Viral based vectors for gene expression in mammalian cells Adenovirus Adeno-associated virus Baculovirus Coronavirus Epstein-Barr virus Herpes simplex virus Lentiviruses Poliovirus Retroviruses Semliki Forest virus Simian virus 40 Sindbis virus Vaccinia virus 8
Transgene sequence optimization Coexpression Codon optimization and G/C content adaptation Inhibition of internal splicing and premature polyadenylation Prevention of creation of stable RNA secondary Introduction/avoidance of immunomodulatory CpG motifs Avoidance of direct DNA repeats and thereby recombination events Domain shuffling, epitope scrambling and protein chimarization Obstruction of formation of stable dsrnas with host transcriptom Avoidance of possible RNAi viable genes Optimization of tissue specific promoter/enhancer sequences Addition of RNA stabilizing and nuclear translocation supporting sequence elements Development of the most efficient cell line/vector combination Quantification of gene expression by state-of-the-art analysis Comparison of expression systems Characteristics Cell growth Growth medium complexity Growth medium cost E. coli 30 min Minimum Low Yeast 90 min Minimum Low Insect cells 18-24 h Complex High Mammalian cells 24 h Complex High Expression level High Low-High Low-High Low-moderate Yield (mg/l cult.) Extracell. expr. Protein folding N-linked glycosyl. O-linked glycosyl. 50-500 Periplasm Refold. usually required ne 10-200 Medium Refold. may be required High mannose 10-200 Medium Proper folding Simple, no sialic acid 0.1-100 Medium Proper folding Complex Phosforylation Acetylation g-carboxylation Success rate 40-60 50-70 50-70 80-95 9