Institutionen för Biokemi och Mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 poäng Vt 2008 Effects of dehydration time and staining technique on microscopic diagnosis of colitis Annica Liljeroth Handledare: Leg. BMA Carina Hammarfjäll, Leg. BMA Christina Jonasson, Professor Roger Willén och Docent Sante Olling Division Diagnostik, Laboratoriemedicin Enheten för klinisk patologi och cytologi Gävle Sjukhus
ABSTRACT In the western world colitis is a common chronic disease and in Sweden the prevalence is around 1%. If a patient has bloody diarrhea it is probably ulcerative proctocolitis or Crohn s disease, whereas if the diarrhea is watery, it is microscopic colitis. For a diagnosis, the patient has to do a colonoscopy and a colonic biopsy sample has to be taken. The biopsy sample will be sent to a laboratory for sectioning, staining and microscopic analysis. In this study we compared the effects of short and long dehydration time of the sample before the sectioning. We also compared staining with Alcianblue/Van Gieson and Van Gieson alone. Our results showed that a short dehydration time was a milder treatment and made it easier to section the biopsy sample. The comparison of the two methods was unsuccessful because the staining with Alcianblue/Van Gieson failed. KEYWORDS: Alcianblue/Van Gieson, dehydering, colon biopsy, colonoscopy and diarrhea 2
INTRODUKTION I den industrialiserade västvärlden är kroniska inflammatoriska tarmsjukdomar ett allt vanligare problem. I Sverige, som är ett högriskområde, är prevalensen nära 1 %. Orsaken till de kroniska inflammatoriska tarmsjukdomarna kan inte idag med säkerhet fastställas. Studier visar dock att det är flera olika faktorer som har inverkan på sjukdomsutvecklingen [1]. En förändring i den immunologiska regleringen kan vara en av orsakerna, en annan kan vara bakterieinfektion. Även rökning kan ha betydelse; detta är dock inte vetenskapligt fastställt. Till de kroniska inflammatoriska tarmsjukdomarna räknas framför allt ulcerös proktokolit, som ger blodiga, slemmiga diarréer och som drabbar endast kolon. Sjukdomen debuterar ofta i 15-30 års ålder med en andra topp vid 50-80 års ålder [2]. Morbus (Mb) Crohns sjukdom, som främst ger peranala besvär och angriper hela magtarmkanalen, debuterar vanligast i 15-30 års ålder. Dessa två sjukdomar ingår i begreppet Inflammatory Bowel Disease (IBD). En undergrupp till IBD, som skiljer sig från de vanligaste tarmsjukdomarna, är de så kallade mikroskopiska koliterna. Mikroskopisk kolit är en vanlig orsak till kroniska, vattniga och oblodiga diarréer, som ibland förbinds med smärta [3]. En viss viktminskning kan också förekomma [4]. En endoskopiundersökning av en patient med denna sjukdom visar normalt tarmepitel eller minimal förändring och det finns inga tecken på radikalitet [5]. Mikroskopisk kolit kan förekomma i hela kolon, men kan också vara begränsad till ett område i höger kolon [4]. Mikroskopisk kolit kan delas upp i tre huvudtyper; kollagen, lymfocytisk och eosinofil kolit (allergi). Dessa olika typer kan endast skiljas åt med hjälp av histopatologisk analys. Tarmbiopsi tas då från kolon och bearbetas enligt standardtekniker, det vill säga proven snittas, färgas och diagnostiseras med hjälp av mikroskop. Begreppet kollagen kolit beskrevs 3
första gången på 1970-talet av patolog Clas Lindström som också gav den dess namn. Vid kollagen kolit kan man se en diffus förtjockning av det subepiteliala kollagena bandet (>10 µm). Dessutom kan ytepitelet vara något förändrat genom en ökning av antalet intraepiteliala lymfocyter och en mild eller moderat mononukleär infiltration av lamina propia. Ofta förekommer en ytepiteldegeneration, vilket innebär att ytepitelet lossnar. Kollagen kolit drabbar övervägande kvinnor i klimakteriet och är ofta förknippad med autoimmuna sjukdomar, som t.ex. lupus och reumatoid artrit, men kan även ha ett samband med diabetes. Det har också visat sig, att intag av vissa läkemedel, som t.ex. icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) och protonpumpshämmare, d.v.s. läkemedel som minskar utsöndringen av magsyra, kan kopplas till sjukdomsdebuten [1]. Lymfocytisk kolit kan identifieras genom ett markant ökat antal av intraepiteliala T-lymfocyter i kolons mukosa (>30/100 epitelceller). Ytepitelet har ofta ett tillplattat utseende. Denna kolit drabbar både män och kvinnor med debut i sextio års ålder [6]. Sjukdomen utvecklas ibland till grav enteroplasi i tunntarmen med ett celiakiliknande tillstånd, som i vissa fall övergår till lymfom, vilket gör diagnosen viktig. Eosinofil kolit skiljer sig från de två förgående koliterna genom ett ökat antal eosinofila celler. För att man ska kunna sätta diagnosen eosinofil kolit, skall det finnas eosinofila infiltreringar i tarmepitelets kryptor och fokala ansamlingar med mer än tio eosinofiler per krypta. Det skall inte finnas några andra identifierade diagnoser, som kollagen kolit, lymfocytisk kolit, IBD eller infektioner. Det är också viktigt att fastställa om det endast är infiltrering i lamina propia, vilket kan sättas i samband med allergiska reaktioner. Om det sker apoptoser i kryptornas baslinje, kan koliten vara en reaktion på läkemedel. 4
Med ett koloskop, som är ett optiskt böjbart instrument, kan man ta biopsier från den övre delen av kolon. Med hjälp av ett sigmoideoskop, som är ett annat optiskt böjbart instrument, kan biopsier tas från rektum och nedre delen av kolon, s.k. tarm px (prov excision). Dagen före undersökningen ges laxermedel och under själva undersökningen kan, om så behövs, lugnade medel ges. Båda instrumentet förs in via anus och vidare till rektum och till den del av kolon där proverna skall tas. Detta upplevs sällan som smärtsamt, men patienten kan känna obehag. Tarmbiopsierna skickas till ett patologlaboratorium för diagnostik. Ett syfte med denna studie var att undersöka om tarmbiopsierna kan dehydreras under en kortare tid än den som nu används vid Gävle sjukhus, vilket skulle ge en mildare behandling av proven. För närvarande körs alla biopsier i ett dehydreringsprogram på tolv timmar över natt. Detta program ger ofta tarm px som är spröda och som trasas upp vid snittningen. En kortare dehydreringstid skulle underlätta för den biomedicinska analytikern att snitta och färga preparatet och för patologen att ställa diagnos. Enheten för Klinisk patologi och cytologi på Gävle sjukhus är ett ackrediterat laboratorium enligt Europa Norm/ International Organization for standardization (EN ISO) 15189, vilket innebär att kvalitén på hela arbetsprocessen måste säkerställas. Att dehydrera i korttidsprogram skulle kunna vara ett sätt att öka kvalitén på resultatet. Det andra delmomentet i studien var att se över färgmetoden för tarmbiopsier. Hittills har tarmbiopsierna färgats i Hematoxylin/Eosin och Van Gieson på separata snitt om frågeställningen varit mikroskopisk kolit. Men idag fungerar inte Van Giesonfärgningen optimalt på Enheten för Klinisk Patologi och Cytologi. För att påvisa en förändring i slemsammansättningen, vilket kan vara ett tecken på cancerförekomst, krävs en annan färgmetod. I studien jämfördes färgning med Alcianblue/Van Gieson med den nu använda 5
färgmetoden Van Gieson. Femton patientfall med frågeställningen kolit var med i studien, som sammanlagt gav 36 paraffininbäddade klossar som snittades och färgades. Alcianblue/Van Gieson färgmetod användes med tre olika koncentrationer och ph-värden för att få fram den kombination som gav bäst resultat. Skulle studien ge ett bra resultat, skulle en stor besparing kunna göras för alla som är inblandade i processen. Det skulle bli bättre flöde för små biopsier genom hela processen. I dagsläget dehydreras dessa över natt med följd att det blir en provtopp på morgonen. Om biopsier istället kunde köras på ett kortare dehydreringsprogram under dagen, skulle arbetsbelastningen på laboratoriet bli jämnare. Behandlande läkare och patient skulle få ett snabbare provsvar, vilket skulle ge en snabbare insättning av behandling. Detta skulle minska antalet vårddygn för inlagda patienter och ge dem en ökad livskvalitet. MATERIAL OCH METOD Tarmbiopsierna I denna studie undersöktes tarmbiopsier från 15 patienter med frågeställningen kolit. Patienterna hade via remiss godkänt att tarmbiopsierna sparades i en biobank. Vilket innebär att biopsierna fick användas i kliniska prövningar och i utbildningssyfte. Vid provtagningen togs ett antal tarmbiopsier från samma ställe i tarmen för att få så identiskt lika vävnadsbiopsier som möjligt. Dessa biopsier kom från Endoskopienheterna på Bollnäs sjukhus och Gävle sjukhus. Dehydrering Dehydrering gjordes i en automatiserad vävnadsprocessor (Lecia ASP 300). Den ena biopsin gick i ett dehydreringsprogram på 65 minuter och den andra biopsin från samma patient och 6
samma ställe i tarmen gick i ett dehydreringsprogram på 12 timmar. Biopsin från det längre dehydreringsprogrammet användes som kontroll. Bäddning Efter dehydrering bäddades samtliga tarm px in i paraffin med vävnadsprocessorn och förvarades därefter vid 4 C. Snittning Av de tarmbiopsier som dehydrerades i långtidsprogrammet preparerades två snitt som lades på två olika objektsglas. Det ena snittet färgades för hand med Van Giesons färgmetod och det andra maskinfärgades i Hematoxilin/Eosin. Dessa användes som kontrollglas. Från tarmbiopsierna som dehydrerades i korttidsprogrammet gjordes tre snitt som lades på tre olika glas. Dessa glas färgades sedan med en Alcianblue/Van Giesonfärgning som var uppdelad tre olika varianter: en svensk, en dansk och en svensk/dansk version. Det som skiljde dessa åt var koncentrationer av ingående färgämnen och ph-värdet. Färgmetod Van Gieson Van Giesonmetoden användes för att differentiera muskelceller och kollagen bindväv. Denna metod färgade kärnorna blåsvarta, glatt muskulatur och cytoplasma gul och kollagen bindväv röd m.h.a. Weigert s hematoxylin och Van Giesonlösning. Detta är en färgmetod som görs för hand. 7
Färgmetod Mayers hematoxylin/eosin Mayers hematoxylin och Eosin är en rutinfärgning som görs i en färgmaskin. Färgningen framhäver kärnstruktur och inflammatoriska celler t.ex. eosinofiler. Den kan även utskilja mesenchymala celler och ger bindväv en rödaktig färg. Färgmetod Alcianblue/Van Gieson Detta är en färgmetod som inte fanns uppsatt på Enheten för Klinisk Patologi och Cytologi på Gävle sjukhus. Färgningen gjordes med 3 olika koncentrationer och varianter. Med denna färgmetod blev kärnorna bruna, erytrocyter gulaktiga, muskulaturen färgades gult, både kollagen och retikulära fibrer blev röda och sura muciner blev blåa. Den svenska varianten Avparaffinering gjordes i steg från xylen till 70 % etanol. Sedan fick glasen stå i 1,0 % Alcianblue. ph 2,5 i 10 min. Glasen sköljdes därefter i rinnande vatten i 5 min. Efter detta stod glasen i 0,1 % natriumkarbonat 5 min och åter i rinnande vatten i 5 min, i Weigert s hematoxylinlösning A (består av 10g hematoxylin och 1000 ml 99,5 % etanol) 125 ml och lösning B (25g järnklorid, 15g saltsyra 5 molar/l och avjonat vatten till 1000 ml) (Histolab) 125 ml blandas i 10 min, rinnande vatten i 5 min, i pikrinsyra/siriusrött (1,2 % pikrinsyra 200 ml och 1 % siriusrött 10 ml blandades) i 4 min. Därefter sköljdes de i rinnande vatten i 1 sek. Glasen dehydrerades snabbt genom alkoholerna (70 99,7 %) till xylen och monterades för hand med Pertex. 8
Den danska varianten Denna gjordes det på samma sett som den svenska med undantag för koncentrationen på Alcianblue som var 0,8 % Alcianblue. ph 2,8 (Solveco) och Weigert s Hemaoxylinlösning som hade förhållandet på lösning A 62,5 ml och lösning B 187,5 ml. Blandning av den svenska och den danska varianten Denna gjordes det på samma sätt, med 2 ändringar: 1,0 % Alcianblue. ph 2,5 och Weigert s hematoxylin hade följande blandning i koncentrationen, 62,5 ml lösning A och 187,5 ml lösning B. RESULTAT I studiens delmoment ett jämfördes kort- och långtidsdehydrering (Tabell 1). Överläkare Sante Olling gjorde jämförelsen och den patologiska överblicken, medan jag själv gjorde bedömningen av snittningen. Tabell 1 Jämförelse mellan kort- och långtidsdehydrering Moment Korttidsdehydrering Långtidsdehydrering Tidåtgång 65 minuter 12 timmar Snitt Ej spröda och frasas ej Spröda och frasas Infärgning rutin Bra färgåtergivning Stark bra färgåtergivning Infärgning special Dålig färgåtergivning Bra färgåtergivning Snittet i mikroskop Bra snitt Bra snitt I delmoment två jämfördes specialfärgmetoden Alcianblue/Van Gieson med rutinfärgmetoden Van Gieson. Alla biopsier som ingick i detta moment var dehydrerade i korttidsprogramet. 9
Resultatet visade en dålig infärgning av specialfärgningen Alcianblue/Van Gieson. Målet med färgningen var att få en mångfärgad och detaljerad bild. Färgningen visade dock bara en grönaktig bild med dålig detaljering av cellernas beståndsdelar (figur 1). De rutinfärgade glasen med Van Gieson visade en normal färgbild. Figur 1 Färgning med Alcianblue/Van Gieson. Resultatet visar en dålig infärgning med oklar celldetaljering. DISKUSSION Studien hade två delmoment: att jämföra snittningskvalitén efter kort- respektive långtidsdehydrering, samt att bestämma om Alcianblue/Van Gieson färgmetoden ger ett bättre diagnostiskt underlag än rutinfärgningsmetoden Van Gieson. Idag är nästan all diagnostisering av koliter baserad på histopatologiska metoder [7]. Eftersom flera av koliterna som beskrivits i rapporten kan leda till olika former av cancer i tarmen [8], är det viktigt att rätt diagnos ställs så tidigt som möjligt i sjukdomsförloppet. Kan man då i förarbetet ha ett 10
dehydreringsprogram och en färgmetod som är säker och tidssparande, så får man en snabbare diagnos och därmed en snabbare insättning av en flerstegsmedicinering för den drabbade patienten [9]. Eftersom det finns rapporter om att barn drabbas av olika koliter, t.ex. kollagen kolit, är det extra viktigt med tidsparande förarbeten [10]. I studiens första delmoment jämfördes resultatet för kort- och långtidsdehydrering (se tabell 1). Skillnaderna var stora när det gällde sprödhet och färgåtergivning. Sprödheten var stor när biopsin hade gått i långtidsdehydreringsprogramet: materialet föll mer isär och det var svårare att få fina snitt. Detta kan också bero på att min erfarenhet inte var så stor på området. En annan orsak kunde vara att materialet blir för torrt när det har gått i långtidsdehydreringsprogramet. Den sämre färgåtergivningen vid korttidsdehydreringen kan bero flera olika saker. En kan vara att 65 minuter var för kort tid för att alkoholen skulle kunna komma in i vävnaden och en annan kan vara att jag gjort fel vid själva färgningen. Vi jämförde tre olika varianter av Alcianblue/Van Giesonfärgningen med olika färgkoncentrationer och ph-värden. De 36 objektglasen som ingick i studien hade alla en skiftande grönaktig ton och en cellbild utan detaljer. Därför går det inte att framhålla någon av varianterna framför de andra. För att få ett så bra resultat som möjligt i studien färgade jag tio snitt innan själva studien påbörjades. Dessa snitt visade klara färger med stora skiftningar och en detaljerad cellbild (figur 2). Varför det i själva studien blev ett dåligt resultat är oklart. 11
Figur 2 Färgning med Alcianblue/Van Gieson. Resultatet visar en mångfärgad och detaljrik cellbild. Som en fortsättning på detta projekt föreslår jag att en ny studie görs med nya biopsier, med samma korttidsdehydrering och en med en längre dehydreringtid på korttidsdehydreringsprogrammet. Dessutom bör det göras en utvärdering av hur snitten svarar på immunohistopatologiska metoder, vilka idag används för bestämning av aktivitetsgraden av koliten hos patienten [11]. Sedan bör en ny Alcianblue/Van Gieson färgning med de svenska koncentrationerna och ph-värde göras. Slår färgningen väl ut, bör den jämföras med Van Giesonfärgningen med en ny utvärdering. Redan nu är intresset stort på Enheten för Klinisk Patologi och Cytologi på Gävle sjukhus för att använda Alcianblue/Van Gieson som en specialfärgningsmetod. 12
REFERENSER [1] Löfberg R, Mikroskopisk kolit drabbar allt fler, Läkartidningen 2005; 32-33 2200-2201 [2] Langan R, Gotsch P, Krafczyk M et al, Ulcerative colitis: Diagnosis and treatment, American Family Physician 2007; 76 (9) 1324-1330 [3] Limsui D, Pardi D, Camilleri M et al, Symptomatic overlap between irritable bowel syndrome and microscopic colitis, Inflamm Bowel Dis 2007; 13 175-181 [4] Thijs W.J, Van Baarlen J, Kleibeuker J.J et al, Microscopic colitis: prevalence and distribution throughout the colon in patients with chronic diarrhoea, Neth J Med 2005; 63 (4) 137-140 [5] Veress B, Löfgren R, Bergman L, Microscopic colitis syndrome, Gut 1995; 36 880-886 [6] Protic M, Jojic N, Bojic D et al, Mechanism of diarrhea in microscopic colitis, World J Gastroenterol 2005; 11 (35) 5535-5539 [7] Kiesslich R, Hoffman A, Goetz M et al, In vivo diagnosis of collagenous colitis by confocal endomicroscopy, Gut 2006; 55 591-592 [8] Willén R, Agnarsdóttir M and Hultén L, Prophylatic surgery for patients with longstanding ulcerative colitis. Which option? Histopathological and clinical implications, Upsala J Med Sci 2007; 112 (1) 49-60 [9] Ayman A and Beck P, Diagnosis and management of microscopic colitis, Can Fam Physician 2003; 49 1473-1478 [10] Freeman H.J, Complications of collagenous colitis, World J Gastroenterol 2008; 14 (11) 1643-1645 [11] Caballero T, Nogueras F, Medina M.T et al, Intraepithelial and lamina propria leucocyte subsets in inflammatory bowel disease: an immunohistochemical study of colon and rectal biopsy specimens, J Clin Pathol 1995; 48 743-748 ACKNOWLEDGEMENT Jag vill tacka alla medarbetare på Enheten för patologi och cytologi, Gävle sjukhus, ni är underbara! Speciellt vill jag tack mina handledare Christina Jonasson och Carina Hammarfjäll med ett stort VOV. Vi ses i sommar! Jag vill också tacka min sambo Jan-Erik för att han har stått ut med mig och mina studier under 3 år. Tack mamma och pappa för att ni alltid har trott på mig!!! 13