Immunteknologi, en introduktion Hur man använder antikroppar för att mäta eller detektera biologiska händelser.
Antikroppar genereras av b-lymphocyter, som är en del av de vita blodkropparna
Varje ursprunglig b-lymphocyt genererar en unik antikropp enligt ett intrikat genkombinatoriskt system http://nobelprize.org/medicine/laureates/1987/tonegawa-lecture.pdf
Antikroppens uppbyggnad
Antikroppen är en dynamisk enhet http://www.path.cam.ac.uk/~mr c7/mikeimages.html
Primärsvar: vissa b-celler genererar antikroppssvar, andra hypermuterar till nya minnesceller med starkare affinitet mot antigenet.
Antikropp ( g ml-1 serum) Ett antigen är en substans som ger upphov till ett immunsvar, då den uppfattas av kroppen som icke-egen.
Hur får vi tillgång till antikroppar? Skapa en antikroppsreaktion hos en vertebrat, t ex kanin Rena upp antikropparna (affikolonn för Fc) eller använd serum direkt Polyklonalt antikroppssvar fås! eller Generera monoklonala antikroppar via hybridomteknologi eller Köp kommersiellt tillgängliga antikroppar
Generering av polyklonala antikroppar antiserum För att ett protein skall vara antigent i en främmande species måste sekvensen vara olik Peptider och små molekyler < 2 kda ger inget eller mycket litet immunsvar Småmolekyler måste kopplas upp mot ett bärarprotein för att ge immunrespons haptener Ytterligare boosting av immunsvaret ges genom att lösa antigenet i en sk adjuvant
Generering av polyklonala antikroppar
Nackdel/fördel med polyklonalt antiserum: Olika antikroppar i polyklonalt serum känner igen varsina specifika epitoper hos antigenet alltså känns större delen av antigenet igen vilket ger stark respons men kan vara en analytisk nackdel och kan göra det svårt att korrelera med medicinska data då man inte kan selektera för antikroppar mot den epitop som genererar autoimmunsvar. Hur lösa detta???
Monoklonala antikroppar kan produceras i hybridom-celler
Monoklonala antikroppar kan produceras i hybridom-celler
Analytiska fördelar med antikroppar Hög specificitet Hög affinitet Hög biologisk kompatibilitet Kombination med cellbiologiska tekniker Analytiska nackdelar Antikroppen ofta känslig för ofysiologiska förhållanden Svårt att fysikaliskt kvantifiera analyserna
Immunoprecipitation Tekniker Märkning av antikroppar Direkt och indirekt detektion Immunometriska assays (konc och specificitet av Ab) Immunbindnings-assays (konc av antigen, bindningsanalys: ELISA etc) Immunoblotting Immunologisk infärgning
Immunoprecipitation Genom att hitta ekvivalenta koncentrationer av Ab och Ag kan man snabbt se specificitet och få ett hum om koncentration av Ag och/eller Ab.
Fällningsanalys i agarosgeler finns det en reaktion? (används t ex för allergitester)
Märkning av antikroppar Fluoroforer: fluorescein, Rhodamin, Physoerytrin m fl Radioisotoper: 125 I Elektrontäta atomer: guld, järn Enzymer: b-galaktosidas, glukosoxidas m fl. Omvandlar substrat till annan färg (UV) - Amplifiering av signal
Direkt och indirekt detektion
ELISA
ELISA för HIVanalys Positive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Above is ELISA data from three patients. Numbers are expressed as optical density at 450nm. The cutoff value indicating a positive result is 0.500. Optical densities of 0.300 to 0.499 are indeterminate and need to be retested. Values below 0.300 are considered to be negative. In most cases, a patient will be retested if the serum gives a positive result. If the ELISA retests are positive, the patient will then be retested by western blotting analysis.
Fördelar Experimentet enkelt att utföra Resultatet enkelt att avläsa Billigt Kan enkelt göras i stor analysskala Nackdelar Resultatet inte alltid enkelt att tolka Sidoreaktioner / korsreaktioner Epitopdefinition krävs för molekylär analys
Identifiering av proteiner från komplicerade geler Detektion av GroEl-proteiner i E. coli
Blot att överföra proteiner från en gel till membran för senare antikroppsanalys
Identifiering av virusprotein hos lax
Flera olika antikroppar kan användas vid analysen samtidigt eller sekventiellt (efter att föregående Ab tvättats bort)
Tillämpningsområden Identifiering, karakterisering och klassificering Patienttillstånd proteinidentitet Lokalisering i vävnader funktionsanalys Proteinrening/analys Gelshift (EMSA) Ändra molekylens vikt i en gelassay ger identifiering Antikroppen som handtag: cellulär analys (FACS), immunofluorescens/fret, drug delivery, målsökande targetting (Affibody) Immunoprecipitering Hitta / fånga protein eller ligand
Immunotyping av prostatacancer genom infärgning med specifika antikroppar A panel of commercially available, well-characterized antibodies to cell surface molecules can be used to identify cancers with distinct clinical behaviors. Liu et al., American Journal of Pathology. 2004;165:1543-1556