TFKE32/TFKI09/9KEA21. Laboration i Genteknik

Relevanta dokument
Linköpings Universitet. Laboration i genteknik

Linköpings Universitet. Lägesspecifik Mutagenes av proteiner

Linköpings Universitet. Lägesspecifik mutagenes av proteiner

Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

/LGM. Amplifiering och analys av humant mitokondrie-dna med hjälp av PCR teknik och agarosgelelektrofores

Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen

DNA-labb / Plasmidlabb

Genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen. från pacyc184 till puc19

Genkloning och PCR av tetracyklinresistensgen från pacyc184

Expression, produktion och rening av Fatty acid binding protein (FABP) från ökenmyran Cataglyphis fortis

Laboration DNA. Datum:16/11 20/ Labgrupp: 11 Laboranter: Johanna Olsson & Kent Johansson

BIOLOGISK SYNTES AV PROTEIN

Laborationer i Cellbiologi med biokemi Lab 6-10

Cellodling Laborationskompendium

Mångfaldigande av mänskligt mitokondrie-dna

få se en naturvetenskaplig forskningsmiljö och träffa människorna i den miljön.

Laboratoriemetod för att manuellt rena DNA från ett prov på 0,5 ml

Laboration v.40 Detektion av Legionella pneumophilia med nestad PCR

Institutionen för laboratoriemedicin Bilaga 2 Biomedicinska analytikerprogrammet Analytisk Kemi och Biokemisk metodik Ht 2010, Termin 3

Expression of recombinant protein including an. His-tag to facilitate purification for diagnosis of. CCHF and Lassa viruses

Preparation av hemoglobin med hjälp av gelfiltrering

UMEÅ UNIVERSITET

CELLODLINGSHANDLEDNING

Preparation och spektroskopisk karakterisering av Myoglobin

Sverigefinal EUSO 2018: Biologi

Fråga 3 Varje korrekt besvarad delfråga ger 0,4 p. Det är inget avdrag för felaktigt svar. (2p) En organism som bara kan växa i närvaro kallas

Konstruktion av reporterplasmider innehållande möjliga promotorregioner för kloratreduktas respektive kloritdismutas från Ideonella dechloratans

Projektarbete 100p Carl Jaede

Kloning och rening av GFP

C V C. Bruksanvisning till Biofortuna SSPGo TM HLA Wipe Test BF Revision 3. Juli 2014

Tentamen i Molekylär Cellbiologi

ProbeTec ET Chlamydia trachomatis Amplified DNA Assay

Uttryck av kloratreduktas och kloritdismutas i Ideonella dechloratans odlade i aerob miljö med tillsatt klorat

ChromoQuant In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X och Y.

Rening av proteiner: hur och varför?

NO-kemi 2017 Utvinning av ett bakteriedödande protein från ägg - en enkel och billig laboration med jonbyteskromatografi

Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

Cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress

Försök till att lösa degraderingsproblem vid preparation av fotosystem I-subenheten PSI-N genom att använda proteasinhibitorer och olika sorters lysis

Kloning av möjlig promotorsekvens uppströms kloritdismutas i Ideonella dechloratans.

Introduktion till laboration Biokemi 1

Tissue_LC_200_V7_DSP och Tissue_HC_200_V7_DSP

Laborationshandledning, Njurfunktion Termin 3, läkarprogrammet

Laborationshandledning, Njurfunktion Termin 3, läkarprogrammet

STOCKHOLMS UNIVERSITET INSTITUTIONEN FÖR BIOLOGISK GRUNDUTBILDNING

TROMBOCYT-ORIENTERAD INHIBITION AV NY TIA OCH MINDRE ISCHEMISK STROKE TIA AND MINOR ISCHEMIC STROKE)

Laboration om cellskada och manipulering av cellers känslighet för stress

Kontaktperson Datum Beteckning Sida. Catrin Lindblad P01635SE 1 (6) SP Kemi, Material och Ytor catrin.lindblad@sp.

Snabb DNA extraktion för Point-of-Care sekvensering och analys

OBS! Under rubriken lärares namn på gröna omslaget ange istället skrivningsområde, ex Lösningsberedning. Totalt ska ni använda 9 gröna omslag.

Analys av nukleinsyra. Molekylärbiologisk metodik T3 ht 11 Märit Karls

STOCKHOLMS UNIVERSITET INSTITUTIONEN FÖR BIOLOGISK GRUNDUTBILDNING

Karin Berg, Malin Lundin och Jessica Petersson. Miljövetarprogrammet Linköpings universitet, Campus Norrköping

Separation av plasmaproteiner med elektrofores, HYDRAGEL PROTEIN(E) K20

OBS! Under rubriken lärares namn på gröna omslaget ange istället skrivningsområde.

Genetiskt modifierade mikroorganismer (GMM)

Förmågan hos Purified Protein Derivate, Phytohemagglutinin och Enterotoxin B att stimulera lymfocyter till prolifiering

GRÅÄRTERS BLOMNING - En studie i hur geografiskt ursprung påverkar den genetiska variationen

Introduktion till labkursen på Biokemi 1

RAPD-PCR för storskalig typning av Bacillus cereus

ProbeTec ET Chlamydia trachomatis Amplified DNA Assay JAA(03)

Leucosep-rör LTK.615 BIPACKSEDEL. För in vitro-diagnostik PI-LT.615-SE-V3

Erik Eriksson VMD Enheten för Bakteriologi

Delprov l, fredag 11/11,

Kopiera DNA med hjälp av PCR-metoden. Niklas Dahrén

DNA-LABORATION Southern blot / PCR

UMEÅ UNIVERSITET Målsättning Att använda metoder för direkt observation av mikroorganismer.

30. Undersökning av aminosyror i surkål

För användning vid preparering och isolering av renade lymfocyter direkt från helblod BIPACKSEDEL. För in vitro-diagnostik PI-TT.

Lymfocytstimulering. 7,5 hp Laboratoriemedicin 2 BMA 08 Vt 11. Biomedicinsk laboratorievetenskap

GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCC CTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACC TACGGCGGT TGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCCGACTTCTTCAAGT CCGCCATTT -35

Personnummer. DUGGA Molekylärbiologi T3 / HT p (G = 28 p)

cobas KRAS Mutation Test KRAS

Undersökning av förekomst av okända virus hos svenska fjällrävar med encefalit

ChromoQuant In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X och Y.

Riskbedömning Lysering RIPA

Utveckling och utvärdering av ett fidelitetssystem för DNA polymeraser

Filtrering av mjölk för analys av Bacillus cereussporer och Clostridium tyrobutyricum-sporer

BIMA12/13 ht 2012, Introduktionslab. 1. Teoretisk introduktion till laborativt arbete

Omentamen 3p mikrobiologi inom biologi 45p, Fråga 1 (2p) Fråga 2 (2p) Fråga 3 (2p)

Örebro universitet Institutionen för hälsovetenskap och medicin Enheten klinisk medicin. Datum Skrivtid 240 minuter. Charlotte Sahlberg Bang

Polymerase Chain Reaction

Molekylär bioteknik. Vad är en gen? Molekylärbiologiska verktygslådan. Eukaryot transkription/translation. Prokaryot transkription/translation

LTK.615 BIPACKSEDEL. För in vitro-diagnostik PI-LT.615-SE-V4

Kromatografi. Idag

Bestämning av koagulaspositiva stafylokocker. Koloniräkningsteknik.

Snabb Resistensbestämning med disk diffusion. Emma Jonasson

DNA-analyser: Introduktion till DNA-analys med PCR och gelelektrofores. Niklas Dahrén

ScanGel NEUTRAL Gelkort Gelkort

Biologi breddning (mikrobiologi och immunologi) Kurskod: BI 1203-A Poäng: 50 Program: Förkunskapskrav: Biologi A och Biologi B

Analys av antistreptolysin-o i patientserum

ProbeTec ET Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Amplified DNA Assays

Riskbedömning Western blot

Ladokkod: TK151C Tentamen ges för: Bt3. Namn: Person nummer: Tentamensdatum: 17/ Tid: 09:00-13:00. Hjälpmedel

Värt att veta om: Centrifugering

Laboration Enzymer. Labföreläsning. Introduktion, enzymer. Kinetik. Första ordningens kinetik. Michaelis-Menten-kinetik

Western blot. BMA-09, VT-11, Termin 4. Ylva Hedberg Fransson

Sammanställning över alternativ till etidiumbromid

Transkript:

TFKE32/TFKI09/9KEA21 Laboration i Genteknik

Denna laboration består av tre delar: A. Restriktionsklyvning av plasmiden pcantab samt konstruering av restriktionskarta. B. Preparation av plasmiden pcantab från E.Coli C. Transformering av lacz (β-galactosidas) och ampicillinresistens innehållande plasmiden puc18 till E. Coli

A. Restriktionskarta av pcantab Restriktionsklyvning samt separation av DNA-fragment Material: pcantab (minst 35 μl med konc. 100 ng/μl) Restriktionsenzymer: EcoRI BamHI HindIII Samtliga med konc. 2 U/μL. OBS! Förvara på is hela tiden! NEB buffert Laddningsbuffert Sterilt avjoniserat/destillerat vatten Molekylviktsstandard (10, 8, 6, 5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25 kilobaspar) Sterila eppendorfrör och pipettspetsar 70 % etanol Skyddshandskar Värmeblock Bordscentrifug Agaros 10x TBE (1 L: 108 g Tris, 7.2 g EDTA, 55 g Borsyra, ph 8.4) SyberSafe

1. Provberedning för restriktionsklyvning Varje labbgrupp gör en av klyvningarna nedan! Det är viktigt alla klyvningar görs,så att en restriktionskarta kan konstrueras. Totalvolym: 20 μl Prov nr 1 2 3 4 5 6 BamHI EcoRI HindIII BamHI+EcoRI BamHI+HindIII HindIII+EcoRI Vatten 12 μl 12 μl 12 μl 11 μl 11 μl 11 μl NEB buffert 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl pcantab 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl Enzym 1 μl 1 μl 1 μl 1 + 1 μl 1 + 1 μl 1 + 1 μl - Tillsätt lösningarna uppifrån och ner i tabellen samt blanda vid varje tillsatts. Märk rören väl! - Blanda och centrifugera i ca 15 sek. - Inkubera i 37ºC, 1 h. (använd värmeblocket) 2. Gjutning av agarosgel (görs endast av en labbgrupp) - Väg upp 1 g agaros och lös i 100 ml 1xTBE - Värm försiktigt i mikrovågsugn tills lösningen är helt flytande (1-1½ min). - Tillsätt 10 µl av SyberSafe lösningen och blanda om. - Låt lösningen svalna till ca 60ºC och gjut sedan agarosgelen (ca 5 mm tjock). - Låt gelen svalna i minst 30 min. Nu är det dags att börja med plasmidpreparationen! 3. Provberedning för elektroforetisk separation på agarosgel - Blanda 4 μl laddningsbuffert med 10 μl klyvd plasmid. - Blanda 4 μl laddningsbuffert, 10 μl oklyvd plasmid. Ett prov behövs, förbereds av en labgrupp!

- Blanda 4 μl laddningsbuffert med 10 μl av den preparerade plasmiden. 4. Elektroforetisk separation av DNA-fragmenten - Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1xTBE så att det täcker gelen. - Applicera 5 µl av molekylviktsstandarden i en av brunnarna. - Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett. - Separera DNA-fragmenten genom att lägga på en spänning på 75 Volt. (Kom ihåg att DNA är negativt laddat). - Avbryt separationen när färgmarkörerna är separerade på gelen. - Fotografera gelen och mät vandringen av DNA-fragmenten med linjal. Redogörelse Rita en graf där log baspar är avsatt mot vandringslängden för molekylviktsstandard-fragmenten. Bestäm storleken (antal baspar) på fragmenten från alla (6 st) klyvningar av pcantab samt bestäm storleken på den oklyvda plasmiden. Sammanställ en restriktionskarta för pcantab där klyvningsställen i relativa positioner för alla tre restriktionsenzymerna finns med.

B. Preparation av plasmid Material: Falconrör med bakteriepellet Qiaprep spinnkolonnkit Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar Sterilt vatten Utförande För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (Qiaprep spinnkit). Detta kit bygger på att plasmid DNAt renas på en minikolonn där DNAt binds upp på en silicagel. Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den önskade plasmiden i iordningställts.odlingsrören innehåller 5 ml LB-medium och ampicillin. Till detta har satts en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid från en LB-Amp-agarplatta från en tidigare transformation. Odlingarna har fått växa över natt i 37 ºC med skak. (Detta görs av labhandledaren) 1. Varje laborationsgrupp erhåller ett 50 ml rör med bakteriepellet. (odlat enligt ovan) 2. Resuspendera pelleten i totalt 250 μl Buffer P1. Lös upp cellerna helt och för över suspensionen till ett eppenforfrör. 3. Sätt till 250 μl Buffer P2. 4. Blanda genom att vända röret försiktigt ett par gånger, cellsuspensionen (blir blå och) ska klarna nästan omedelbart. 5. Tillsätt 350 μl Buffer N3 och blanda genast genom att vända röret försiktigt några gånger. Det ska bildas en vit fällning i röret och lösningen ska bli färglös. 6. Centrifugera 13 000 rpm 10 min för att samla fällningen på rörväggen. 7. Föröver supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med. Det går bra att använda en pipett med steril pipettspets. Se till att kolonnen sitter i ett plaströr. 8. Centrifugera 13 000 rpm i 1 min.

9. Häll bort vätskan från röret. Tillsätt 750 μl PE Buffer och centrifugera 13 000 rpm i 1 min. 10. Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till. 11. Flytta över kolonnen till ett sterilt eppendorfrör. 12. Tillsätt 50 μl sterilt vatten och låt stå 1 min. 13. Centrifugera 13 000 rpm 1 min. Se till att rören sitter bra i centrifugen, dvs viktat mot varandra med locket på eppendorfröret i korrekt position för att få en jämn viktbalans i centrifugen. Det är risk att locket går sönder och flyger av annars! Renhet och kvalitet på plasmiden analyseras på agarosgel tillsammans med klyvningsprodukterna. Återvänd till restriktionsklyvningen! Redogörelse Enkelt flödesschema som visar vad som händer i de olika stegen och var de olika komponenterna (celler, cellrester, kromosomalt DNA och plasmid) befinner sig och kort vad som händer vid tillsats av de olika buffertarna. Kommentera provets renhet och kvalitet utifrån resultatet av agarosgelen. Beskriv kort principen för agarosgelelektrofores.

C. Transformation av plasmid Material: LBA-agarplattor LBAX-agarplattor LBAI-agarplattor LBAXI-agarplattor (A - ampicillin, X Xgal, I - IPTG) LB-medium IPTG Plasmid puc18 (innehållande genen för β-galactosidas och ampicillinresistens) E. Coli XL1-Blue competent cells Utförande, värmechock Varje grupp sprider transformeringen på en typ av agarplatta! Se till att alla typer av agarplattor används inom labskiftet. 1. Tina de superkompetenta XL1-Blue cellerna (E.Coli). Cellerna ska tina på is! 2. Till en 50 μl portion av E.Coli tillsätts 1 μl plasmid (plasmiden puc18 fås av labhandledaren). 3. Blanda försiktigt med pipettspetsen och inkubera på is 30 min. 4. Värmechocka cellerna genom att placera rören i ett värmeblock 45 sek vid 42ºC, placera sedan rören på is i 2 min. 5. Tillsätt 200 μl av förvärmt (42ºC) LB odlingsmedium och inkubera transformationsreaktionen 1 timme i 37ºC. 6. Sprid ut 100 µl av transformationsreaktionen på en agarplatta. 7. Dagen efter transformationen (ca 16-20 h) kontrolleras plattorna. Uppskatta andelen blå och vita kolonier på agarplattorna. Redogörelse Redovisa bakterietillväxten på de fyra olika agarplattorna. Beskriv varför ni ser kolonier och även hur de blå kolonierna uppkommer. Beskriv även kortfattat principen för värmechockning och varför man gör en inkubering efter.

Appendix Restriktionsenzymer typ II Igenkänningssekvens (palindromsekvens) samt klyvningsställe ( ) HindIII (Haemophilus influenzae Rd, III) 5' A A G C T T 3' 3' T T C G A A 5' BamHI 5' G G A T C C 3' 3' C C T A G G 5' EcoRI 5' G A A T T C 3' 3' C T T A A G 5' Samtliga enzymer ger klyvning med sticky ends (single stranded overhang). Om klyvningen sker på samma ställe bildas blunt ends (utan single stranded overhang). Laborationsredogörelsen ska, förutom de punkter som anges under respektive laborationsavsnitt, innehålla: Inledning Metodbeskrivning Resultat Diskussion Eventuella felkällor Maila rapporten till tfke32@ifm.liu.se i doc-format. Behåll kommentarer från labhandledaren vid retur. Rapporterna återfås via mail. Redogörelsen ska vara inlämnad senast 7 dagar efter utförd laboration. Även returer ska vara inlämnade inom 7 dagar från återlämningsdatum. Rapporten rättas max 3 gånger, dvs maximalt 3 st inlämningar!