DNA-LABORATION Southern blot / PCR

Transkript

1 Författare: xxx, yyy, zzzz, nnn Grupp: NR, DFM1, termin??? Namn och OBS student för de medlemmar i gruppen som godkänt rapporten skall stå på framsidan. DNA-LABORATION Southern blot / PCR Stockholm 2008 ABSTRAKT PCR (Polymerase Chain Reaction) och Southern Blot är två vanliga DNA-tekniker. I denna labb används PCR för att detektera eventuella mutationer i det läkemeteboliserande enzymet CYP2D6 hos en försöksperson. Southern Blot användes för att urskilja två olika allela former ( 1 och 2 ) av det vanliga leverenzymet (klass 1 ADH), som är en alkoholdehydrogenas som spjälkar alkohol. Det visade sig att försökspersonen hade både av de möjliga mutationerna samtidigt som han hade friska alleler (vildtyper) och därför var det omöjligt att bestämma om han var snabb hydroxylerare eller inte. Southern Blot resultatet visade att det gröna provröret innehöll en 2 -allel medan det gula innehöll en 1 -allel. 1

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. SYFTE s.1 2. BAKGRUND s CYP2D6 s ADH s METOD OCH MATERIAL s PCR s Dag 1 s Dag 2 s Dag 3 s Southern Blot s Dag 1 s Dag 2 s Dag 3 s PCR / Southern Blot s RESULTAT OCH DISKUSSION s PCR s Southern Bloth s Felkällor s SLUTSATS s. 9 Innehållsförteckningen felaktigt gjord skall göras med funktionen I Word så att den uppdateras automatiskt 2

3 1. SYFTE Att teoretiskt och praktiskt utöka vårt kunnande inom två vanliga DNA-tekniker; PCR (polymerase chain reaction) och Southern Blot. Samt skapa en förståelse om varför dessa två tekniker är viktigt för en läkare 2. BAKGRUND I den här labben används PCR för att detektera eventuella mutationer (typ A och B) på det läkemedelsmetaboliserande enzymet CYP2D6. Southern Blot används för att detektera två olika humana allela varianter som kodar för att alkolholdehydrogenas (ADH). De här metoderna kan vara av betydelse för en läkare vid t.ex. dosordinering av olika mediciner. Southern Blot - resultatet i denna laboration skulle kunna underlätta förståelsen för varför en patient svarar på alkohol som denne gör vilket kan vara relevant vid t.ex. leverskador pga. alkohol. Den specifika mutation som PCR-metoden påvisade är viktig för att läkare ska veta hur mycket av ett läkemedel som bör ordineras, p.g.a. hur snabbt personen i fråga kan bryta ner läkemedlet, snabb respektive långsam hydroxylerare. Anna Stenqvist Borttagen: 2.1. CYP2D6 Varför det kan vara intressant att analysera CYP2D6-genen, (vars enzym har samma namn) är för att om båda allelerna är defekta kommer enzymet inte att ha någon funktion. Det är alltså ett recessivt arv d.v.s. defekten måste finnas på båda allelerna. Alleler är två olika variationer av en gen med samma lokus (samma plats på de två olika kromosomerna). Genotypen som uttrycks m.h.a. båda allelerna kommer ge upphov till en specifik fenotyp, karaktär, hos försökspersonen. För att återgå till enzymerna, deras uppgift är att metabolisera flera olika läkemedel. Genom att enzymaktiviteten t.ex. är nedsatt kan inte läkemedlet brytas ner och utsöndras med urinen, utan kommer istället att ansamlas i blodet. Det kan alltså vara av mycket stor betydelse för en läkare för att han/hon ska dosera lämpligt vid en längre tids behandlig beroende på om patienten har en defekt gen eller inte. Anna Stenqvist Borttagen: det att ge upphov till nedsatt funktion hos enzymerna Det finns två typer av genetiska defekter hos långsamma hydroxylerare: Typ A: De har sex procent av defekta alleler där en adenin i exon fem är borttagen, s.k. basdelation. Vid syntetisering av enzymet CYP2D6 kommer en förskjutning att ske, s.k. frameshift. Vilket i sin tur leder till att avläsningen inte blir exakt eftersom kvävebasen adenin är borttagen. Typ B: Där har det skett ett basutbyte av guanin till adenin vilket leder till att splitsningen av mrnat blir felaktig. Laborationen med PCR-teknik kan användas för att avgöra vilken CYP2D6-genotyp (genetisk uppsättningen hos en individ) som finns hos försökspersonen för att sedan kunna avgöra om denna är en snabb eller långsam hydroxylerare, d.v.s. fenotypen. Anna Stenqvist Borttagen: Anna Stenqvist Borttagen: 3

4 2.2. ADH ADH (Alkoholdehydrogenas) är en human enzymfamilj som består av olika enzym som oxiderar alkoholer (blir aldehyder). Enzymerna inom familjen liknar varandra, men deras primärstruktur och substratspecificitet (alkoholen som de oxiderar) skiljer sig något. I kroppen sker den största delen av alkoholmetabolismen i levern och därför finns det en hel del ADH där. Det vanligaste leverenzymet (klass 1 ADH) är en dimer som består av subenheterna, eller. Dessa subenheter kan kombineras på olika sätt och det finns en gen som kodar för var och en av dem. Dessutom finns det allela former (samma locus men något skiljd uppbyggnad) och det är just det som ska undersökas i denna labb. Närmare bestämt ska de allela formerna av ( 1 och 2 ) undersökas. Inom ett visst DNA-område klyver speciella restriktionsenzymer (både området och enzymerna är valda på förhand) i ett känt mönster. Då det är en 2 -allel klyver enzymet med ett 400 baspar mellanrum och då det är en 1 -allel klyver den två gånger med ett mellanrum på 275 respektive 125 baspar. Detta faktum kommer att användas i slutet av denna labb för att bestämma vilken allel det är i respektive provrör (se resultat nedan). Anna Stenqvist Borttagen: På 3. METOD OCH MATERIAL 3.1. PCR Dag 1 En person ur gruppen gurglade i 30 sekunder med saltlösning (0,9 procent) för att få ett prov av de epitelceller som finns i munnens slemhinnor. Saltlösningens koncentrationen var anpassad så att cellerna skulle överleva och inte förstöras, d.v.s. en fysiologisk lösning. Lösningen spottades i en steril bägare och därefter överfördes den till ett eppendorf-rör som centrifugerades för att skilja celler från natriumkloridlösningen. En pellet och en supernatan centrifugerades fram, där endast pelleten kom att användas och supernatanten hälldes bort. Till pelleten tillsattes (100μl) uppslammad InstaGene Matrix (denna innehöll Chelex-kulor som adsorberar produkter som frigörs då cellerna förstörs). Lösning inkuberades i 30 minuter vid 56 C i värmebad, för att Chelex-kulorna skulle bli aktiva. Hur denna process går till väga och annan intressant information har företaget som syntetiserar kulorna patent på och det fick vi inte ta del av. DNA-lösningen måste blandas väl med matrixen för annars kan det sedimentera och lägga sig på botten. Efter att lösningen vortexats (blandats) kokades provet för att cellerna skulle lysera och DNA extraheras ur provet. Men före extraktionen av DNAt centrifugerades provet ytterligare en gång för att kulorna som har absorberat produkter som frigjorts vid cellyseringen, som inte är intressanta för laborationen, ska trilla till botten. Supernatanten kommer alltså att innehålla det som är intressant, bland annat DNAt. En del av denna supernatant (30 μl) överfördes till ett eppendorf-rör. Genen som vi är intresserade av CYP2D6, är mycket lik två pseudogener (gener som p.g.a mutationer inte kan koda för proteiner). För att inte blanda ihop dem med den riktiga genen användes två primerpar (A, A och B, B ) som masskopierar just de två regioner i CYP2D6 som vi är intresserade av, d.v.s. regionerna med exonerna 3, 4 (samlades i ett endorfrör A) och regionen med exonerna 5,6 (samlades i endorfrör B). Eftersom ett polymeras inte kan syntetisera på ett naket DNA utan behöver en startplats, en primer, dv.s en kort sekvens 4

5 som redan basparar till DNAt. Med hjälp av primer kan man på detta sätt styra var syntetiseringen startar. Kopieringen skedde i 35 PCR-cykler. En cykel innebär tre steg: 1. Denaturering. Detta innebär att DNA strängarna smälts isär genom att temperaturen höjs till 95 C. 2. Hybridisering. Under denna process binder primrarna (m.h.a. vätebindningar) specifikt till DNAt. Detta sker optimalt vid 55 C. 3. Syntes. Vid 72 C syntetiserar polymeraset en komplementär sträng, vilket innebär att för varje ny cykel kommer antalet sekvenser att dubbleras. Nu har alltså att pseudogener sållats bort (ependorfrör A innehåller regionen av genen med exonerna 3 och 4 samt ependorfrör B innehåller regionen av genen med exonerna 5 och 6) och proverna innehåller endast det DNA som vi är intresserade av. Pseudogenernas DNA finns kvar men har inte duplicerats vilket betyder att de sekvenserna är obefintliga Dag 2 Efter PCR I innehöll våra prover masskopierade sekvenser av exonerna 3, 4 (endorfrör A) och 5, 6 (endorfrör B). Vi hade alltså förstärkt de sekvenser vi är intresserade av. Pseudogenerna masskopierades inte av primrarna A, A och B, B. Man kan sammanfattningsvis säga att PCR I var nödvändig för att utesluta masskopiering av pseudogenerna. Nu när vi har masskopierat sekvenserna är det utan vetskap om de är muterade eller inte. Som tidigare nämnts är de muterade då guanin blir till adenin på exon nr. 4 (Typ B) eller då adenin försvinner genom deletion i exon nr. 5 (Typ A). Än så länge kan inte någon mutation detekteras p.g.a att primerna A, A, B och B masskopierar både den vilda och muterade sekvenser. Därför pipetterade vi under dag 2 med primers för masskopiering av både vildtyp och muterade sekvenser, se figur 1. Kopieringen skedde i 15 PCR-cykler som ovan beskrivits under dag 1, med den lilla skillnad att under dag 2 användes en hybridisering temperatur på 52 C. Anna Stenqvist Borttagen: G Anna Stenqvist Borttagen: Adenin Anna Stenqvist Borttagen: Adenin Anna Stenqvist Borttagen: både Anna Stenqvist Borttagen: regioner 5

6 Figur 1: Pipettering från endorfrör A och B till rör med de olika primrarna som masskopierar för de olika regioner Mutation typ A på båda allelerna, leder till att vi få en masskopiering i det gula röret och inte i det rosa. Mutation typ A på en allel och ingen mutation på den andra, leder till att vi får en masskopiering i både det gula och det rosa rören. Mutation typ B på båda allelerna ger masskopiering i det gröna röret och inget i det blåa. Mutation på typ B på en allel och inte på den andra ger masskopiering i både det gröna och blåa röret Dag 3 Det första som förbereddes under dag tre var gelen som ska användas vid elektroforesen. Elektrofores innebär en separation av DNA-molekyler med avseende på storlek m.h.a. att en spänning läggs på en gel och fragmenten vandrar olika snabbt beroende på storlek mot anoden, stora långsamt och små snabbt. Anna Stenqvist Borttagen: é Därefter pipetterade vi 4 μl av en färglösning (som innehöll glycerol för att öka densiteten, så att lösningen kunde sjunka ner i gelens brunnar) till vardera PCR-produkt och 2 μl till storleksmarkören. När proverna blandats pipetterade vi ner dem i gelen. Sedan lades en spänning över gelen och de större molekyler vandrade långsammare än mindre. På så sätt får man en separation i storlek. Utifrån denna separation kan man sedan se vilken/a utav proverna 1 4 som har masskopierats. Fragmenten för alla kombinationerna för ependorf-rören i figur 1 (blå, grön, rosa och gul) bör vara 564 baspar långa SOUTHERN BLOT Dag 1 vad hände dag 0? Till att börja med gjöts en gel som skulle kunna användas senare i elektroforesapparaten. Tre stycker rör erhölls från amanuens där två innehöll DNA-prover av olika sammansättning ( 2 och 1) och det tredje en storleksmarkör. Till 1 och 2 tillsattes 2 l färglösning och till markören 3 l. Geltråget sänktes ned i elektroforesapparaten varvid polariteten kontrollerades så att DNAts negativt laddade fosfatgrupper skulle kunna vandra mot pluspolen. De tre proverna laddades i gelen med automatpipett varvid strömmen slogs på (100 V) och proverna fick möjlighet att vandra under en timme. Då tiden var ute behandlades gelen med etidiumbromid i ett bad under 5min. Efter det avfärgades gelen med vatten i 10 minuter varefter den fotograferades på ett UV-bord och efter det kapades kammen. En markering i övre högra hörnet, som skars bort, gjordes också för att under resterande tid av laborationen kunna hålla reda på rikting. Steget som följde var denatureringen där man gör DNA:t enkelsträngat för att det ska kunna komplettera??? den komplementära sekvensen på filtret????. Vi täckte gelen med 40 ml 0,5M NaOH+1,5M NaCl i 15 minuter. Innehållet skakades lätt på ibland för att vätskan skulle fördelas jämt över gelen innan vi senare sköljde denna tre gånger i vatten. För neutralisering användes 40 ml 0,5M Tris-Cl ph7,5+1,5m NaCl i 15 minuter. Vi byggde därefter upp en blottningspacke med 250 ml 20xSSC (20xSSC=3M NaCl+0,3M natriumcitrat) i en plastbytta. Packen bestod (nerifrån och upp) av wettexduk på plastbytta (i kontakt med bufferten), 3MM papper, gelen, nylonfilter (luftbubblor stryktes ut), remsor avc plastfilm (ram ovanför gelen), två 3MM-papper, 20 stycken vikta papperhandukar och Anna Stenqvist Borttagen: ett Anna Stenqvist Borttagen: tråg 6

7 slutligen en 1-literskolv fylld med vatten (stabiliserad med hjälp av ett stativ). Denna packe fick sedan stå över natten så att DNA:an med hjälp av kapillärkrafter (uppstår från tyngder på gelen) kan vandra upp till nylonfiltret Dag 2 Blottpacken från gårdagen monterades ner och nylonfiltret fick torka på en pappershandduk. Efter det belystes nylonfiltret med UV-ljus för att korslänka ( fixera ) DNA:t. Nästa steg var att prehybridisera nylonfiltret. En prehybrediseringsmix (10ml) tillsattes och detta fick sedan inkubera i rumstemperatur i en timme. Anledningen till prehybrediseringen är att komma ifrån störande bakgrund. Filtret är något positivt laddat medan DNA:at är något negativt laddat. Proben (definieras nedan) som ska tillsättas i nästa steg (hybridiseringen) är något negativt laddad och skulle binda ospecifikt till den positivt laddade filtret om den skulle tillsättas redan nu (detta skulle i slutändan leda till svårighet att i slutskedet av labben urskilja DNA:at från bakgrunden). I prehybrediseringsmixen fanns trna-molekyler (precis som proben negativt laddade) som kan binda till den positivt laddade gelen och på så sätt neutralisera den. Nästa steg är själva hybrediseringen. För att kunna göra det behövs en så kallad prob som är komplementär (bestämt??? och modifierat på förhand) till de DNA-strängar som är aktuella i denna labb, alltså DNA-området där restriktionsenzymet klyver antingen med 400bp (baspar), 275 bp eller 125 bp mellanrum. Proben som användes var kemiskt modifierad band molekylen dioxigenin (DIG) som kan katalysera fel!!! en färgreaktion i labbens slutskede och på så sätt bli synlig (se nedan). Den var 400bp och kan binda till både den 400bp, 275bp och 125bp-långa stängarna som restriktionsenzymet gett upphov till. Det första som gjordes var att proben denaturerades (från dubbelsträngad till enkelsträngad) så att den kan binda till den aktuella DNA-strängen. Detta gjordes genom att två rör som innehöll proben värmdes på ett värmeblock 95 C i 10 min. Efter det placerades den omedelbart på is för att snabbkylas. Sedan hälldes prehybrediseringsmixen av från nylonfiltret och proben tillsattes. Detta fick sedan inkubera över natten. Anna Stenqvist Borttagen: gelen Anna Stenqvist Borttagen: :a Anna Stenqvist Borttagen: :a Anna Stenqvist Borttagen: så att att skulle binda til Anna Stenqvist Borttagen: l Anna Stenqvist Borttagen: :a Dag 3 Idag ska proben (som nu kan binda specifikt till det vi söker) och dess DIG-molekyler detekteras med hjälpa av antikroppar och färgämnen. Första steget för att komma dit var att tvätta av filtret med hjälp av två tvättlösningar. Först med tvättlösning 1 i rumstemperatur och sedan med tvättlösning 2 i ett värmeskåp 68 C i 30 min. Detta gjordes för att få bort prob som ej bundit till DNA:a strängar. Denna prob skulle annars bli störande bakgrund senare. Proben och dess DIG-molekyler kan i slutändan detekteras tack vare att en sorts antikroppar binder till DIG-molekylerna (som fungerar som antigener till antikropparna). För att optimera detta genomförs ett moment som påminner om prehybrediseringen dag 2. Två olika buffertar (buffert 1 och 2) tillsattes (25 ml av varje i 5 respektive 25 min) som skulle få bort elektrostatiska krafter som skulle kunna få antikropparna att binda ospecifikt. Buffert 1 var maleinsyrabuffert (ph 7,5) och buffert 2 var blockningsreagens samt anti-dig fel!!! Vad vore meningen med detta? kunjugerad till alkaliskt fosfatas i maleinsyrabufferten. Efter det hälldes bufferten av och 10 ml av antikropparna (Fab) tillsattes och detta fick sedan inkuberas i rumtemperatur i 30 min. Sista steget innan färgreaktionen (som gör DNA:a längderna åskådliga) var att tillsätta 15 ml av en tredje buffert varför då?... och denna blandning fick inkuberas i rumstemperatur i 5 min. Sedan hälldes bufferten av och 10 ml grön färglösning (X-fosfat + NBT i tris buffert) tillsattes för reagera med antikropparna. Detta fick inkubera i 30 och då bufferten är Anna Stenqvist Borttagen: buffert Anna Stenqvist Borttagen: s 7

8 ljuskänslig fick det stå i ett ljusskyddat utrymme. Reaktionen stoppades genom att sänka filtret i avjonat vatten. Slutligen fick filtret torka och resultatet kunde åskådas PCR / Southern Blot Ett sätt att få en djupare förståelse för de här två DNA-teknikerna är att göra en kortare jämförelse mellan dem. Den stora och uppenbara likheten mellan dem är att de båda används för att detektera mindre fragment av DNA:t. Vad exakt vill vi detektera? I båda fallen denatureras DNA:t i fråga för att bli enkelsträngat. Dock skiljer sig denatureringsmetoderna i de två experimenten åt. I Southern Blot experimentet användes NaOH (högt ph) medan det i PCR experimentet användes hög temperatur för att denaturera DNA:t. Att denaturera är viktigt för att en komplementerande sekvens ska kunna binda till DNA:t. I Sothern Blot försöket var det en märkt probe som band, medan det i PCR försöket var ett primerpar som band till den enkelsträngade mallen. Vad proben och primerparet har gemensamt är att de båda gör det möjligt att detektera den sökta sekvensen. Till skillnad från proben (som komplementerar till hela den sökta sekvensen) märker primerparet bara ut var DNA-polymeraset ska börja och behöver därför en mängd fria nukleotidtrifosfater (som blir nukleotider då de binder till den växande strängen). En annan gemensam nämnare för de båda metodernas är att gelelektrofores användes för att detektera de sökta sekvenserna. Detta gjordes i båda fallen genom att tillsätta färglösning med glycerol (höjer densiteten) och etidiumbromid (som gör DNA:t synligt vid UV-belysning). 4. RESULTAT OCH DISKUSSION 4.1. PCR Som tidigare nämnts borde fragmenten för alla kombinationerna vara ca 564 baspar långa vilket de även visade sig vara, se figur 2. Resultatet visade att försökspersonen hade mutationer på alla fragmenten, alltså både A heterozygot och B heterozygot. I Figur 2 kan man alltså se att det skett en masskopiering i alla de fyra olika provrören med de olika primers (se figur 1 för ytterligare information om provrörsubstans). Försökspersonen har alltså segmenten med B wt, B mut, A wt och A mut. Denna metod klargör dock inte på vilka alleler respektive sitter vilket leder till att ingen slutsats kan dras gällande om försökspersonen är snabb eller långsam hydroxylerare. Alltså eftersom vi inte vet hur de olika fragmenten förhåller sig till varandra, vet vi inte heller om det är ett recessivt anlag. Fenotypen kan vara normal, men också tvärtom. Vi kan alltså inte säga om personen i fråga är en snabb eller långsam hydroxylerare, men statistik (från laborationsinstruktionshäftet) har visat att det är större sannolikhet att försökspersonen är långsam hydroxylerare. En metod för att klargöra om personen är långsam eller snabb hydroxylerare innebär att DNA-prover tas från mamman och pappan. Om det sedan visar sig att någon av föräldrarna är snabba kan slutsatsen dras att försökspersonen är snabb och har således ärvt en icke muterad allel. 8

9 Figur 2: Brunnarna som de olika lösningarna fylldes i befinner sig högst upp på bilden. Längst ner på bilden fanns den positiva anoden. Lösningarna vandrade alltså uppifrån och ner. Ju mindre segmenten var desto längre ner mot anoden kom de. Längst till vänster ser vi storleksmarkören. Den tjockare av markörerna på storleksmarkören har storleken 501/489 baspar och ovanför denna finns 692 baspar. Man ser att fragmenten från de masskopierade segmenten (från försökspersonen) har storleksordningen mellan dessa markörer och detta stämmer väl eftersom vi vet att dess storlek ska vara 564 baspar SOUTHERN BLOT De erhållna resultaten var både tydliga och önskade. Efter elektroforesen, tillsättningen av etidiumbromid och UV-belysning dag 1, uppstod tre tydliga bandmönster i var av de tre kolumnerna. Detta var alltså DNA med olika basparlängd från respektive provrör (rosa, grönt och gult) som hade vandrat i gelen. Dessa band fotograferades och det erhållna fotot kan ses nedan till vänster (fig. 3). Detta foto visar att det finns DNA i de olika provrören och att dessa har klyvts av restriktionsenzymet. Slutresultatet efter färgreaktionen dag 3 var även det tydligt och önskat. Det uppstod tre kolumner med band som kan ses på fotot nedan till höger (fig. 4). Den första kolumnen från vänster (rosa provrör) var som tidigare nämnt markören. Basparlängden (som restriktionsenzymet i ett visst DNA-område gett upphov till) för DNA:t i de två övriga kolumnerna (grönt- respektive gult provrör) var det som skulle bestämmas i denna labb. Med hjälp av markören kan man se att det gröna provröret innehöll en DNA-sträng och detta var ungefär 400 baspar långt medan det gula innehöll två DNA-stränger som ser ut att vara knappt 300 baspar respektive 100 baspar långt. Utifrån detta kan vi dra slutsatsen att det gröna provröret innehöll en 2 -allel, medan det gula innehöll en 1 -allel. 9

10 Figur 3. Brunnarna syns högst upp på bilden. De tre lösningarna har vandrat från brunnarna mot anoden (längst ner på bilden). Att det finns olika långa basparlängder visar att restriktionsenzymerna har verkar. Figur 4. Bilden visar att lösningen från det gröna provröret innehåller en DNA-sträng medan lösningen från det gula innehåller två. Lösningen i det rosa provröret fick fungera som markör. Utifrån detta kan man se att DNA-strängen från det gröna provröret är ungefär 400 baspar långt och att strängarna från det gula var ungefär 100 respektive 300 baspar långt FELKÄLLOR Slutligen kan något sägas om felkällorna. Exempel på felkällor som skulle kunna uppkomma under laborationen är att andra celler kommer in i provet och kontaminerar det. Eftersom även dessa celler i lösningen kan tänkas dupliceras senare under PCR, vilket skulle ge ett felaktigt resultat av laborationen. Båda laborationerna innehöll ett stort antal moment och således kan den mänskliga faktorn inte uteslutas. Pipettering, injicering i gelen vid elektroforesen och felaktigt uppbyggd blottningspacke är några exempel när detta kan ha haft betydelse. 5. SLUTSATS På det stora hela gick experimenten väldigt bra. Det visade sig att det inte gick att bestämma huruvida försökspersonen var snabb hydroxylerare eller inte och att det gröna provröret innehöll en 2 -allel, medan det gula innehöll en 1 -allel. 10