GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCC CTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACC TACGGCGGT TGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCCGACTTCTTCAAGT CCGCCATTT -35

Transkript

1 TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG GGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCG TTACAACTTACGGTAAATGGCCGCC TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACGTCA ATATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGAC TTGACA TTGACGTCAATGGGTGGAG TATAAT ACGGTAAACAGCCCACTTGGCAGTACAT CAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCC -10 CTATTGACGTCAATGACGGTAAATG GCCGCCTGGCATTATGCCCAGTCATGAC TTATGGGAC TACTTGGCAGTACATCTACGTATTA GTCATCGCTATTACCATGGTGATGCTT GGAGG TCAGT C ATG INVITROMUTAGENESLABKU RSMOLEKYLÄRBIOTEKNIKKTH2008 TAA TAGGATA START GCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCA AGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTG GCACTGTTC AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATG TCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAA ATGGGCGGT AGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATA TAAGCAGAGCTGGTGATACGGGCGTGCA GTGCTTCAG CCGCTACCCCGACCACATGAAGCAT TTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCT ACCGGACTC AGATCTGCCACCATGGGCAGCAGCC ATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCT GCGGTGCCC ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACG TAAACGGCCACAAGTTCATGGTGCCGCC GGCAGCCAT ATGGGTACCCTCGAGCTCAAGCTTC GAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGC CCGGGATCC ACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGC CCATCCTGG TCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGG CCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGC GAGGGCGAT GCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGA GTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCC GTGCCCTGG CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCT ACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCC CGACCACAT GAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCC GCCATGCCC GAATTC TACGTCCAGGAGCGCACCATCT TCTTCAAGGACGACGGCACTACAAG ACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCG ACACCCTGG TGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCCA TCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCT GGGGCACAA GCTGGAGTACAACTACAACAGCCTC AATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTA TTGCAACTT GACAAGCAGAGAACGGCATCAAGGT GAACTTCAAGATCCGCCACAACATTACC GAAAGAAGT CGAGGACAGCGTGCAGCTCGCCGAC CACTACCAGCAGAACACCCCCAGCAGAG CTGGGTACA CGCGATCACATGGTC CTGCAG GAGTTCGTGACCGCCGCCGGCTT CGAATTCTGCAGTCGATA Pst I GGATCACTCTCGGCATGGACGAGCT GTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTGAT CATAATTTC CAGCCATACCGAGGTTTTACTTGCT TTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTCT AGTAGTACA GAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAG CTTATAAGT CTATATAATTTAGTGAACCGTCAGA TCCGCTAGCGCTATCGAGCTCAAGCTTC GAATTCTGC AGTCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGC ACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACT ACCGATATA CCGGACTCAGATCTGCCACCATGGG CGCCATCATCACATCATCACAGCAGCGG CCCCGATTA TGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGG TACCCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTG CAGTCGAGC CGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACC GGTCGCCACCATGGTGAGC AAGCTT GAGGAGCTGTCC TCGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAA ACAGCCAGC GCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGA Assistenter 2008: TGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTAC v.46 v. 47 v. 48 v Eco RI George Kostallas Carl Hamsten Patrik Ståhl Patrik Ståhl GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCC CTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACC TACGGCGGT Carl Hamsten Mattias Oskarsson George Kostallas Mattias Oskarsson TGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCCGACTTCTTCAAGT CCGCCATTT -35 Hin diii S.D. STOP

2 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 2 IN VITRO-MUTAGENES Laboration i Molekylär Bioteknik vid Skolan för Bioteknologi, KTH, Stockholm LABORATIONSHANDLEDNING Vers Utarbetad av: OLOF NORD VALTTERI WIRTA HENRIK ASPEBORG MAX KÄLLER ANDERS ANDERSSON CECILIA LAURELL ERIK FORSÉN CARL HAMSTEN ANNA GUSTAFSSON JOHAN ROCKBERG NINA BANDMANN GEORGE KOSTALLAS MARIA SIEVERTZON JOHN LÖFBLOM PER-ÅKE NYGREN Omslag: DNA-sekvensen döljer en dold gen med ett relevant budskap.

3 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 3 Innehåll Introduktion 4 In vitro-mutagenes enl. Kunkel 5 Översiktlig beskrivning av laborationen 9 Dagsplanering 14 Labmanual Dag 1 15 Dag 2 18 Dag 3 20 Dag 4 24 Riktlinjer för rapportskrivning 25 Bilagor 1-10 Bilaga 1: Plasmidkarta för målplasmiden pz-stop-egfp 26 Bilaga 2: DNA-sekvens innehållande målsekvensen för mutagenesen (2 ex) 27 Bilaga 3: Oligonukleotider som används i laborationen 29 Bilaga 4: Genetiska koden 30 Bilaga 5: Aminosyrasammansättning för fusionsproteinet Z-EGFP 31 Bilaga 6: Formel för beräkning av ett proteins extinktionskoefficient 32 Bilaga 7: Molekylvikter hos proteiner i markörmixen (SDS-PAGE) 33 Bilaga 8: Längder hos DNA-fragment i markörmixen "GeneRuler" 34 Bilaga 9: Beskrivn. av konc.-bestämningsmarkören "Low DNA Mass Ladder" 35 Bilaga 10: Beskrivning av plasmidpreparering från E. coli-celler enligt kit från Qiagen 36-41

4 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 4 OBS! Läs igenom laborationshandledningen ordentligt före laborationsstarten eftersom det kan förekomma förhör. Introduktion M olekylär bioteknik är ett vitt begrepp som innefattar en mängd verksamhetsområden som har gemensamt att de behandlar biologiska och biotekniska frågeställningar från ett molekylärt perspektiv. En rad av tekniska landvinningar har gjort att det idag är möjligt att på molekylnivå studera, analysera och påverka de beståndsdelar som utgör livets kemi. Dessa innefattar metoder för att isolera, sekvensbestämma och producera nukleinsyror (RNA och DNA) och proteiner. Utveckling av metoder för in vitro-mutagenes har haft en stor betydelse, i och med att man därigenom fått möjlighet att göra riktade (dirigerade till speciella positioner) och önskade ändringar i DNA-molekyler. Att redan på gennivå (DNA) kunna göra skräddarsydda ändringar i ett senare translaterat proteins aminosyrasekvens för jämförande studier av närbesläktade proteiner har haft en enorm betydelse för vår förståelse av proteiners egenskaper såsom sambandet mellan struktur och funktion. Denna laboration syftar till att ge en praktisk inblick till hur man kan gå tillväga för att utföra sådana avsedda förändringar i DNA, och vidare hur utfallet av dessa kan bestämmas (konfirmeras) med DNA-sekvenering. Den position som i laborationen är aktuell för mutagenes är belägen i en DNA-sekvens som är kodande för ett visst protein. Detta ger en möjlighet till analys av resultatet även på proteinnivå. Huvudsakliga tekniker som ingår i laborationen: Plasmidrening från bakterier In vitro mutagenes enligt Kunkelmetoden Transformering av plasmid-dna till bakterier Polymerase chain reaction (PCR) DNA-sekvensbestämning med Pyrosekvenering Rekombinant proteinproduktion Rening av protein med affinitetskromatografi Gelelektrofores av DNA och protein

5 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 5 In vitro-mutagenes enligt Kunkel Metodik för oligonukleotidmedierad mutagenes beskrevs första gången av Michael Smith i mitten av 1970-talet, något som han 1993 belönades med Nobelpriset i kemi för. Hans metodik vidareutvecklades senare av flera, däribland Thomas Kunkel (Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, ) vars metod används i denna laboration. Idag används ett flertal olika alternativa principer parallellt på olika laboratorier för att Michael Smith utföra in vitro-mutagenes, förutom ovan nämnda också kassettmutagenes eller polymerase chain reaction (PCR)-medierad mutagenes (för översiktsartikel, se Ling and Robinson (1997) Anal. Biochem. 254, ). Valet av metod påverkas av flera förutsättningar, som t.ex. förekomst av lägen för klyvning med restriktionsenzym i templatet, målmolekylens längd och antalet positioner som man vill förändra. Generellt sett baseras både Smiths och Kunkels metoder på att man låter en enkelsträngad mutagenesoligonukleotid hybridisera (baspara) till en enkelsträngad och ringsluten version av den DNA-molekyl (templat) man önskar mutera (Fig. 1A). A 5 3 DNA-polymeras Nukleotider DNA-ligas 5 3 B Dubbelsträngat plasmid-templat Enkelsträngat plasmid-templat + Mutagenesoligonukleotid Dubbelsträngat heteroduplex Transformering Mutant Vildtyp Mix Figur 1. Principen för oligonukleotidbaserad mutagenes.

6 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 6 Enkelsträngad plasmid kan erhållas enligt flera principer, t.ex genom upphettning eller alkalibehandling av dubbelsträngade plasmider eller genom inkloning av målsekvensen i genomet hos vissa fager (bakterievirus av typen M13) som i ett stadium av sin livscykel naturligt bär på ett genom i form av en enkelsträngad sluten DNA-molekyl. Mutagenesoligonukleotiden designas så att den basparar perfekt (dvs. är komplementär) med alla sina nukleotider mot templatet, förutom mot de positioner som man önskar mutera. Denna eller dessa positioner (kallas mismatch-positioner) brukar förläggas till mittenregionen av oligonukleotiden så att en stabil hybridisering kan ske via flankerande basparningar. Detta steg följs av en s.k. extension, där man låter ett DNA-polymeras syntetisera nytt DNA från 3 -änden av oligonukleotiden hela vägen runt det cirkulära DNAt, användandes tillsatta vanliga nukleotider. Man får då åter en dubbelsträngad plasmid. Genom att tillsätta enzymet DNA-ligas slutes 5 änden av oligonukleotiden och 3 -änden av den nysyntetiserade strängen kovalent. Resultatet blir följdaktligen ett ringslutet dubbelsträngat DNA som innehåller en region med ickeperfekt basparning (heteroduplex). Vid transformering av bakterier med sådant DNA kommer bägge strängarna ("gamla" och "nya") vara kapabla att tjäna som templat för plasmid-dna-replikation, vilket skulle ge en blandning av plasmider (muterad och vildtyp) (Fig. 1B). I praktiken brukar den ena formen anrikas mer än den andra, beroende att de replikeras olika effektivt, trots den ofta mycket lilla skillnaden. Detta ger att efter ett stort antal delningar återfinns ofta endast en av formerna i varje enskild koloni. Dock, den gamla strängen är en gång syntetiserad i en bakterie, vilket gör att den innehåller nukleotider som metylerats (av cellens egna enzymer), vilket inte är fallet för strängen som syntetiserats in vitro (nya strängen). Detta är av betydelse för bakteriens försvarssystem mot mutationer som känner igen mismatch-regionen (som liknar strukturer som kan uppstå vid felaktigheter under replikationen av bakteriens eget kromosomala DNA), och som vill korrigera den felaktiga basparningen. Vid denna korrigering känns den gamla metylerade strängen igen som ursprunglig (och "sann") och användes därför preferentiellt som templat för korrigeringen. Detta får till följd att det stora flertalet av kolonier innehåller bakterier som innehåller den ickemuterade varianten. För att undertrycka denna motselektion in vivo brukar bakteriestammar med ett defekt mutationskorrigeringssystem (t.ex. muts-stammar) användas som mottagarceller.

7 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 7 I metoden som utvecklades av Kunkel användes i stället en annan, och mycket elegant, princip för att höja mutationsfrekvensen (Fig. 2). Här användes en speciell typ av muterade bakteriestammar som värdar för produktion av templatplasmiden (i steget före själva mutagenesen). I dessa är de två enzymerna dutpas (dut) (reglerar dutp-nivån i cellen) och uracil n-glykosylas (ung) (eliminerar du som felaktigt inkorporerats i DNA) utslagna (dut, - ung - ), vilket får till följd att nivåerna av dutp blir höga och att DNA som replikerats i en sådan stam kommer att innehålla dunukleotider. När du-innehållande DNA däremot förs in i en normal (ung + ) bakteriestam degraderas detta effektivt. A Replikation i speciell bakteriestam (dut - ung - ) 5 3 DNA-polymeras Nukleotider DNA-ligas 5 3 U U U U U U B U Dubbelsträngat plasmid-templat U Transformering till normal bakteriestam (ung + ) Enkelsträngat plasmid-templat (du) + Mutagenesoligonukleotid U X X X U Dubbelsträngat heteroduplex U X U X Nedbrytning av du-innehållande sträng Mutant (med hög frekvens) Figur 2. Principen för oligonukleotidbaserad mutagenes enligt Kunkel. Kunkelmetoden går ut på att använda du-innehållande DNA som templat för en "vanlig" oligonukleotidbaserad mutagenes, under användning av DNA-polymeras, vanliga nukleotider och DNA-ligas. Det dubbelsträngade heteroduplex-dna som då skapas innehåller en du-innehållande sträng (vildtyp) och en normal (dtinnehållande) sträng (muterad sträng) (Fig. 2A). Vid införsel (transformering) i en normal (ung + ) bakteriestam degraderas vildtypssträngen effektivt vilket ger att den muterade strängen företrädelsevis användes för replikationen, med en mycket högre frekvens mutantinnehållande kolonier som resultat (Fig. 2B).

8 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 8 Gemensamt för alla mutagenesmetoder är frågan hur man särskiljer de kolonier som innehåller muterad plasmid från de som innehåller vildtypen (den urspungliga). Flera, principiellt olika, metoder finns att tillgå för att lösa detta. Till exempel kan man genom att samtidigt mutera på ytterligare ett ställe i templat-dnat (med en extra mutagenesoligonukleotid) laga genen för en tidigare utslagen selektionsmarkör. Om denna är en gen som kodar för ett protein som medför resistens mot en viss antibiotika är det möjligt att hitta rätt kolonier via odling på plattor innehållande denna antibiotika, där endast kolonier innehållande muterat (förhoppningsvis muterat på bägge ställena) plasmid-dna bör överleva. Med PCR kan man också hitta rätt koloni, genom att en av de två primers som används är designad för att bara kunna baspara tillräckligt väl med den muterade sekvensen. Beroende på läget av den mutation som skall skapas i denna laboration kommer en annan princip kunna användas, baserad på mutagenesberoende uttryck av ett protein vars aktivitet enkelt kan observeras.

9 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 9 Översiktlig beskrivning av laborationen. 1. In vitro-mutagenes. Den DNA-sekvens som skall muteras i laborationen är belägen i en s.k. expressionskassett, d.v.s. ett område (i detta fall i en plasmid) som styr produktionen av ett visst protein (Fig. 3). Expressionskassetten består av en promotor följd av en en strukturgen som kodar för själva proteinet. Promotorn i detta fall är en lac-promotor som normalt är avstängd via därtill inbundet Lac-repressorprotein, men som enkelt kan induceras med tillsättande av laktosanalogen isopropyltiogalaktosid (IPTG). Strukturgenen i detta fall kodar för proteinet Z-EGFP, som är ett fusionsprotein mellan två olika proteiner. Proteinet Z är en 6 kda stor proteindomän som kommer från ett stafylokockprotein som heter protein A, och har en förmåga att binda starkt till den konstanta delen av den tunga kedjan (Fc-fragmentet) hos immunoglobulin G. Detta har gjort att Z-proteinet ofta har använts som s.k. affinitetssvans för att underlätta upprening av rekombinanta proteiner. Detta faktum kommer också att utnyttjas i en senare del av laborationen (proteinrening). P lac Z TAA EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) In vitro-mutagenes P lac Z EGFP Figur 3: Schematisk bild över expressionskassetten som är föremål för in vitro-mutagenesen i denna laboration. Ett stoppkodon beläget mellan generna för protein Z och protein EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) skall muteras så att en öppen läsram bildas. Detta möjliggör ett uttryck av fusionsproteinet Z-EGFP, vars förekomst i cellen kan detekteras med UV-ljus. Den andra delen av fusionsproteinet är en variant av ett protein som heter Green Fluorescent Protein (GFP) och har sitt ursprung hos en viss självlysande manetart som heter Aequorea victoria (Fig. 4). Detta protein har den unika förmågan att avge ett synligt grönt ljus om det bestrålas med ultraviolett strålning (fluorescerar). Det

10 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 10 alstrade ljuset emitteras från en exciterad s.k. kromofor som är belägen i proteinets struktur. Denna kromofor utbildas i det veckade proteinet som en följd av spontana Figur 4. Bild av maneten Aequorea victoria (vänster) och strukturen hos Green Fluorescent Protein (GFP) (höger). De aminosyror som ingår kromoforen har markerats. omlagringar hos tre aminosyror (Ser 65 -Tyr 66 -Gly 67 ) som ingår i proteinets egen primärstruktur (Fig. 5A). Intensiteten och excitation/emissionsvåglängder är beroende av kromoforens omgivning, och flera varianter av GFP har konstruerats. För vildtypsproteinet användes våglängder kring 400 nm för excitation och fluorescensemissionen kan ses vid 509 nm (Fig. 5B). Den variant som användes i laborationen heter Enhanced GFP (EGFP) och fluorescerar i förhållande till vildtypen med ett mer intensivt ljus och exciteras lämpligast vid 488 nm (ofta med argonlaser som har en stark linje vid denna våglängd). A B Figur 5. (A): Strukturen hos kromoforen i GFP, som bildas genom spontana omlagringar hos tre av proteinets aminosyror. (B): Excitation (vänster kurva) och emissionsspektra (höger kurva) för GFP (vildtyp).

11 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 11 I den plasmid som användes på laborationen (pz-stop-egfp) förhåller det sig emellertid så i den DNA-sekvens som förbinder generna som kodar för Z-proteinet och EGFP så finns det en TAA-triplett i samma läsram som för Z och EGFP-generna (Fig. 3). Denna triplett motsvarar som bekant ett av de tre stoppkodonen (se genetiska koden), som ger signal till cellens translationsmaskineri att proteinet är färdigsyntetiserat. I laborationen skall detta stoppkodon muteras så att det istället bildas en s.k. öppen läsram (oavbruten kodande sekvens) mellan generna för Z och EGFP. Delmål 1: Att med in vitro-mutagenes enligt Kunkel förändra detta TAA-kodon till ett icke-stopp-kodon så att även delen av fusionsproteinet som utgörs av EGFPproteinet uttrycks. Plasmiden pz-stop-egfp skall upprenas med en standardmetod (se bilaga 9) från en övernattskultur av Escherichia coli-celler i vilka plasmiden har tillåtits replikera. I och med att den använda bakteriestammen är av dut - ung - -typ blir plasmiden förberedd för in vitro-mutagenes enligt Kunkelmetoden. Efter genomförd mutagenes skall kolonier innehållande muterad plasmid identifieras genom visuell inspektion av odlingsplattor som belyses med UV-lampa. 2. Konfirmatorisk DNA-sekvenering. För att försäkra sig om att en utförd mutagenes har ägt rum på det önskade sättet måste den resulterande plasmidens DNA-sekvens i det relevanta området bestämmas (s.k. konfirmatorisk sekvenering). Delmål 2: Att med DNA-sekvenering konfirmera att mutagenesen resulterat i önskad förändring. I denna laboration kommer en teknik som kalllas pyrosekvenering att användas. Pyrosekvenering är i likhet med Sangermetoden (Sanger, F. et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, ) en "sequencing-by-synthesis"-metod som utnyttjar ett DNA-polymeras, en primer och fria nukleotider för syntes av nytt DNA som är komplementärt till den DNA-molekyl vars sekvens man vill bestämma. Men till skillnad från Sangermetoden, där sekvensen utläses från detektion av DNA-fragment av olika längd (terminerade med dideoxynukleotider) som separeras elektroforetiskt i en gel, utläses med pyrosekvenering DNA-sekvensen från en realtidsdetektion av korta ljusblixtar i lösning. Dessa ljusblixtar genereras av enzymet luciferas (från

12 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 12 eldflugor) under spjälkning av adenosintrifosfat (ATP), som via ett kopplat enzymsystem genereras från det pyrofosfat (PP i ) som frigörs vid enzymatisk (polymeras) inkorporering av en dntp-nukleotid i en växande DNA-kedja (Fig. 6). Genom att sekventiellt (i tur och ordning) separat tillsätta en enskild sort av de fyra dntp (A, G, C eller T) till systemet och för varje tillsats detektera om det alstras en ljusblixt eller inte (samt intensiteten) kan sekvensen hos templat-dnat utläsas. För vissa tillämpningar kan dispenseringsordningen skräddarsys för att ge maximalt med information, t.ex. vid bestämning av s.k. single nucleotide polymorphisms (SNPs). A (DNA) n + dntp DNApolymeras (DNA) n+1 + PP i APS + PP i Sulfurylas ATP ATP Luciferas + luciferin Ljus Ej inkorporerade dntp och överskott av ATP degraderas av enzymet Apyras (kontinuerligt) PP i = pyrofosfat APS = adenosin 5 -fosfosulfat ATP = adenosin-trifosfat B Lj i t it t 2 1 Templat-sekvens C G - TT G C T A Adderad nukleotid Figur 6. Principen för DNA-sekvensbestämning med pyrosekvenering. (A): Enzymatisk inkorporering av en nukleotid i en växande DNA-kedja generarar pyrofosfat (PP i ) som via ett kopplat enzymatiskt system (innefattande det ljusalstrande enzymet luciferas) omvandlas till ljus. Närvaro av enzymet apyras gör att flera sekeventiella positioner kan läsas, då detta effektivt degraderar överskott av dntp och ATP inför nästa cykel. (B): Resultatet presenteras i form av s.k. pyrogram, där ljusintensiteten ses som funktion av tillsatt dntp-sort. Observera att ljussignalen är proportionerlig mot antalet inkorporerade nukleotider; två stycken T n i rad i målmolekylen ger vid tillsats av datp en ljussignal av styrkan "2".

13 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning Produktion, rening och analys av proteinet Z-EGFP. Resultatet av den utförda mutagenesen blir som beskrivits ovan att den aktuella expressionskassetten i plasmiden blir kodande för ett fusionsprotein mellan en IgG-bindande Z-domän och EGFP. I laborationen ingår att producera detta protein i Escherichia coli samt att rena upp det från cellens övriga biomolekyler med s.k. affinitetskromatografi. Genom att ympa en grön koloni (indikerande att mutagenesen lyckats) i en näringslösning startas en övernattsodling. Transkriptionen av genen (produktion av mrna) styrs i detta fall av en lac-promotor, hämtad från E. coli s eget system för laktosintag och nedbrytning. Under normala betingelser (glukos som kolkälla, ingen laktos närvarande) är denna promotor avstängd via lac-repressorprotein som sitter bundet till en s.k. operatorsekvens belägen i promotoregionen. För att starta transkriptionen och därmed den följande proteinproduktionen tillsätts laktosanalogen IPTG (isopropyltiogalaktosid), som binder till lac-repressorn och gör den därmed inkapabel att blockera transkriptionen. Delmål 3: Produktion, rening och analys av fusionsproteinet Z-EGFP. Produkten innehåller ingen signal för export utan blir belägen i cellens cytoplasma (intracellulär lokalisation). Efter avslutad odling skördas cellerna som lyseras med ett reagens (BugBuster Protein Extraction Reagent) som består av en blandning av ickejoniska detergenter. Detta kan användas för att enkelt, snabbt och skonsamt slå sönder E. coli s cellvägg så att lösliga proteiner i cellen frigörs. Metoden är ett alternativ till mer mekaniska metoder för att lysera bakterier som French Press (tryck/tryckfall) och sonikering (ultraljud). Proteinet Z-EGFP kan sedan renas med affinitetskromatografi tack vare Z-domänens förmåga att binda specifikt och starkt till IgG som uppbundits till Sepharose (en kromatografimatris) och packats till en kolonn. Mängden renat protein bestämmes spektrofotometriskt och analyseras avslutningsvis m.a.p. renhet och storlek med gelelektrofores (SDS-PAGE).

14 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 14 Dag 1 Laboration i Molekylär Bioteknik "In vitro-mutagenes" Översikt dagsschema Dag 3 Genomgång Inkl. förhör på laborationens innehåll och mål Genomgång Minipreppning av plasmiden pz-stop-egfp (dut -, ung - ) från frusen cellpellet Agarosgel-elektrofores av PCR-produkter Skörd av odling Agarosgel-elektrofores av plasmid DNA Preparation av templat för Pyrosekvenering (robot) IgG-affinitetskromatografi (lys med UV-lampa före eluering) Mutagenes-reaktion Pyrosekvenering Frystorkning av proteiner (över natt) Transformering av E. coli Genomgång Sammanfattning av dagen Genomgång Sammanfattning av dagen Dag 2 Genomgång Dag 4 Genomgång Inspektion av uppvuxna kolonier Tolka resultat från Pyrosekvenering Analys av renat protein med SDS-PAGE En grön koloni En vit koloni En grön koloni (del av samma koloni som används till PCR) Tolka resultat PCR för Pyrosekvenering Ympning för proteinproduktion Skrivning av laborationsrapport Genomgång Sammanfattning av dagen

15 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 15 Dag 1 A. Rening av plasmiden pz-stop-egfp från dut -, ung - -celler. 0. Hämta is och tillred ett isbad. 1. Assistenterna delar ut ett rör innehållande en frusen cellpellet från en 2.5 ml övernattsodling av E. coli (dut -, ung - )-celler innehållande plasmiden pz-stop-egfp. 2. Låt pelleten tina i rumstemperatur. 3. Följ protokollet för plasmidrening som finns i bilaga Den erhållna plasmidpreparationen skall analyseras m.a.p. renhet och koncentration med gelektrofores i en 1%-ig agarosgel innehållande etidiumbromid (fluorescent ämne som binder till nukleinsyror). ANVÄND HANDSKAR (OBLIGATORISKT). (a) Till ett 1.5 ml Eppendorfrör, tag ut ett 1 l-prov av plasmidlösningen. Tillsätt 2 l dh 2 0. Märk detta prov "A". (b) I ett 1.5 ml Eppendorfrör, gör en 1:10-spädning av den ursprungliga plasmidlösningen (1 l + 9 l dh 2 0). Från detta spädda prov, tag ut ett 1 l-prov till ett nytt 1.5 ml Eppendorfrör. Tillsätt 2 l dh 2 0. Märk detta prov "B". (c) Tillsätt 2 l Bromfenolblå (BFB) gelladdningslösning till de båda proven (innehåller färgämne och glycerol som gör så att provet syns och också sjunker till botten av laddningsbrunnen). 5. För båda proven, ladda hela provvolymen (5 l) i brunnar på gelen och kör gelektroforesen (assistent visar). I separata brunnar laddas 2 l-prov av en koncentrationsbestämningsmarkör (Low DNA Mass Ladder, bilaga 10) (utförs av assistent). 6. Fotografera gelen under UV-ljus (assistent visar). 7. Jämför intensiteten hos dina prov med den hos banden i Low DNA Mass Ladderstandarden för att uppskatta koncentrationen (ng/ l) av plasmiden i ursprungspreparationen. Beakta alla spädningsfaktorer. ETIDIUMBROMID ÄR KLASSAT SOM CANCEROGENT ÄMNE. INGET SLABBANDE! FÖLJ NOGA ASSISTENTERS INSTRUKTIONER.

16 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 16 B. Denaturering av plasmid-dna och hybridisering av mutagenesoligonukleotiden till DNA-templatet. 1. Blanda ihop en hybridiseringsreaktion i ett 1.5 ml Eppendorfrör enligt följande: Plasmid-DNA (pz-stop-egfp, dut - ung - -preparerad). Tillsätt ca 600 ng. x μl (baserat på konc. bestämning) dh 2 O 14 - x μl Mutagenes-oligonukleotid Mut-1 (5 -fosforylerad) 6 μl (koncentration ca 200 ng/μl i stamlösning) 20 x buffert (SSC-buffert) 1.3 μl Totalvolym i röret 21.3 l 2. Blanda väl och snabbcentrifugera sedan ner provet. 3. Inkubera 3 minuter vid 100 C. 4. För omedelbart över provet till is och inkubera provet där i 5 minuter. 5. Samla ihop provet genom att snabbcentrifugera ner det. C. Syntes av mutant-dna-strängen. 1. Till hybridiseringsreaktionen, tillsätt ytterligare: dh 2 O 56 μl T4 DNA ligas buffer (10x) 10 μl dntp-lösning (konc. 200 M av vardera nukleotidsort) 10 μl T4 DNA-ligas (5 U/μl) 1 μl T4 DNA-polymeras (3 U/μl) 2 μl * Innehåller: 100 mm Tris-HCl, ph 7.8; 10 mm dithiothreitol; 50 mm MgCl 2 ; 2.5 mm av vardera datp, dttp, dgtp, dctp och 5mM ATP. 2. Blanda väl och snabbcentrifugera sedan ner provet. 3. Inkubera 2 timmar vid 37 C. 4. Stoppa reaktionen genom att inkubera provet vid 70 C i 5 minuter. 5. Låt röret svalna till rumstemperatur. D. Transformering av E. coli-celler 1. Tina ett rör transformationskompetenta E. coli-celler (ca. 200 l) på is (cellerna är preparerade för s.k. fryskompetens enl. CaCl 2 -metoden som ger en uppluckring av cellväggen/ membranen).

17 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning Tillsätt 30 μl av mutagenesblandningen till de kompetenta cellerna och blanda. 3. Inkubera på is i 30 minuter. 4. Värmechocka cellerna vid 37 C (värmeblock) i 5 minuter. 5. Inkubera på is i 5 minuter. 6. Tillverka en s.k. rackla av en pasteurpipett för spridning av celler. Pipetten värmes i gaslåga och böjs (gravitationellt) till lämplig form (assistent visar). 7. Sprid 10 % (ca. 23 l) av transformationsmixen på en agarplatta innehållande ampicillin och IPTG. Sprid resten (90 %) av transformationsmixen på en annan platta av samma sort. Lägg bägge plattorna i 37 C över natt. OBS: märk med namn/gruppnummer (märkpenna).

18 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 18 Dag 2 A. Inspektion och urval av kolonier för vidare analys med konfirmatorisk pyrosekvenering samt till ympning för proteinproduktion och rening. 1. Undersök plattorna från gårdagen med UV-lampa. Uppskatta kvoten: Antalet gröna kolonier Totala antalet kolonier 2. Välj ut (ringa in med märkpenna på undersidan av plattan) en vit respektive en grön koloni bland sådana som växer solitärt. Dessa kolonier skall användas för vidare analyser enligt nedan. B. Ympning för proteinproduktion och rening. 1. Ympa en delmängd av cellerna från den utvalda gröna kolonin (resten av kolonin skall användas senare) till en 1-liters skakkolv med bafflar innehållande 100 ml TSB odlingsmedium med tillsats av ampicillin [100 μg/ml]. 2. Ställ kolven i 37 C-rummet på skakbord för odling över natt. Ställ in 100 rpm i omrörningshastighet. Inducering av proteinproduktionen med IPTG [1 mm slutkoncentration] utförs efter 5 h av era assistenter. C. PCR för pyrosekvenering. 1. Till två separata 1.5 ml Eppendorfrör (märkta "1" resp. "2", inkuberas på isbad), tillsätt följande PCR-reaktionskomponenter: "1" "2" 10 x PCR-buffert (inkl. Mg 2+ ) 5 μl dntp-lösning (konc. 200 M av vardera nukleotidsort) 5 μl Dynazyme DNA-polymeras (konc. 0.5 units/ l) 1 μl F-primer (konc. 5 pmol/ l) 1 μl R-primer (konc. 5 pmol/ l) 1 μl dh 2 O 37 μl Totalt 50 μl 2. Tag med en spetsförsedd pipett (minsta spetsstorleken) upp resten av cellerna från den utvalda gröna kolonin (se punkt A och B ovan) från agarplattan och överför dessa till röret märkt "1". Pipettera några gånger upp och ned för att blanda och lösgöra cellerna från spetsen. 3. Tag med en spetsförsedd pipett (minsta spetsstorleken) upp celler från den utvalda vita kolonin (se punkt A ovan) från agarplattan och överför dessa till röret märkt "2". Pipettera några gånger upp och ned för att blanda och lösgöra cellerna från spetsen.

19 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning För över innehållen i rören till av assistent angivna positioner (brunnar) i en 96- brunnars PCR-platta som användes gemensamt av alla grupper. 5. Applicera plattan i PCR-apparaten (utförs av assistent). Denna skall vara programmerad för PCR-amplifiering enligt följande 30-cyklers temperatur/tidprofil (min., C) som totalt tar ca. 3 timmar: 94 C 94 C 5:0 0 0: x 65 C 0: C 72 C 1:0 0 5:0 0 4 C Resultatet av PCR-amplifieringen analyseras under dag 3.

20 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 20 Dag 3 A. Konfirmatorisk pyrosekvenering (fortsättning). Analys av PCR-produkter 1. För att kontrollera att man har fått en bra PCR-produkt (många kopior av rätt fragment) brukar man analysera produkten med agarosgelelektrofores. För detta finns en färdiggjuten 1%-ig agarosgel innehållande etidiumbromid (fluorescent ämne som binder till nukleinsyror). ETIDIUMBROMID ÄR KLASSAT SOM CANCEROGENT ÄMNE. INGET SLABBANDE! FÖLJ NOGA ASSISTENTERS INSTRUKTIONER. 3 μl från varje PCR-brunn överföres till separata 1.5 ml Eppendorfrör till vilka 3 μl BFB-lösning tillsätts. BFB-lösningen innehåller glycerol och färgämne och gör det lättare att se och applicera provet i de små brunnarna som gjutits i agarosgelen. Varje grupp laddar sedan sina respektive två prover på den gemensamma gelen som ligger i ett elektroforesbad. I varje rad laddas också en storleksmarkör (GeneRuler, se bilaga 8). Proverna får vandra i 10 min. med 140 V spänning varefter gelen plockas upp och lägges på ett UV-bord och fotograferas. Templatpreparering för pyrosekvensering För att omvandla PCR-produkterna till enkelsträngade templat med hybridiserad sekveneringsprimer använder vi en pipetteringsrobot. Denna flyttar vätskor mellan olika plattor och har en magnet med vilken den kan hålla kvar paramagnetiska och streptavidintäckta kulor inne i pipettspetsen. I roboten placeras PCR-plattan (som innehåller resten av PCR-produkterna), samt en mottagarplatta för själva pyrosekveneringssteget (också 96-hålsplatta) samt behållare med olika lösningar. Roboten kommer att utföra följande moment (se Figur 7): 1. Löser upp och tvättar paramagnetiska streptavidinkulor. 2. Tillsätter kulor i varje brunn i PCR-plattan. 3. Inkuberar plattan i 15 min. i rumstemperatur (PCR produkterna binder in till kulorna via biotin-streptavidinkemi). 4. Tillsätter 0.1 M NaOH (DNA-strängarna smälter isär). 5. Fixerar kulorna i kanten på pipettspetsen och avlägsnar vätskan med den lösa DNA-strängen. Sköljer kulorna 1 x TE-buffert och löser upp kulorna i regenereringsbuffert samt flyttar dem till en pyrosekvenseringsplatta.

21 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning Hettar upp plattan till 80 C. Nu lösgörs den resterande strängen (biotinylerad) från kulan. Kulorna samlas upp för återanvändning (de är dyra). 7. Tillsätter hybridiseringsbuffert innehållande sekvenseringsprimer (Pyro-1). Hybridiserar primern genom att först denaturera DNAt vid 80 C, hybridisering av primer vid 56 C för att sedan gå ner till rumstemperatur. 8. Tillsätter buffert så att slutvolymen blir 40 l. 9. Tvättar kulorna som skall återanvändas. 10. Nu är plattan redo för pyrosekvensering. Forward biotinylerad primer Reverse primer Templat DNA PCR Uppbindning på streptavidinklädda magnetiska kulor Smält isär strängarna med NaoH Lösgör strängen från kulan Hybridisera sekvenserings primer Figur 7. Templatpreparering inför pyrosekvenering. Pyrosekvenering Till pyrosekveneringen används ett PSQ 96 MA-instrument från Biotage AB, Uppsala (f.d. Pyrosequencing AB). Apparaten är försedd med en kassett som har åtta brunnar och sex dispenseringsnålar (se figur 8). Brunn 1 innehåller enzymerna (E) som erfordras för reaktionen: DNA-polymeras, sulfurylas, luciferas och apyras. Brunn 2 innehåller substrat (S) för de enzymatiska reaktionerna: APS och luciferin. Brunnar 3 till 6 innehåller de olika nukleotiderna.

22 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 22 5 G 4 C 3 S 2 A 6 T 1 E Figur 8. Kassetten i pyrosekveneringsinstrumentet. När sekvenseringen påbörjas dispenseras m.h.a. tryckluft först enzym och substrat i varje brunn. Sedan dispenseras en bas i taget cykliskt, med ca 1 min mellan varje tillsats. När körningen är färdig måste kassetten tömmas och tvättas med vatten för att inte dispenseringsnålarna skall sätta igen. Nukleotiddispenseringsordningen kan väljas fritt och designas utgående från det specifika fallet. Beroende på om applikationen är de novo-sekvenering av okänd sekvens eller konfirmativ sekvenering av känd/förväntad sekvens kan olika dispenseringsordningar vara att föredra. För denna laboration används emellertid en cyklisk dispenseringsordning (C, G, T, A) n som har förprogrammerats av assistenterna. Resultatet från körningen erhålles i form av ett s.k. pyrogram som kan behandlas manuellt eller med hjälp av utvärderingsmjukvara. I denna laboration tolkas pyrogrammen manuellt. B. Proteinproduktion och rening (fortsättning). 1. Häll över odlingen i ett vägt s.k. GSA-rör för centrifugering (vikt =... g). Jämvikta röret med ett annat GSA-rör från en annan grupp; använd vatten vid jämviktning. Centrifugera rören vid rpm i 10 min. Jämviktade rörpar skall vara diametralt motsatt placerade. Er assistent hjälper till att sätta igång centrifugen. 2. Häll av supernatanten noga så att så mycket vätska som möjligt avlägsnas. Väg röret innehållande cellpellet (vikt =... g). Bestäm cellpelletens våtvikt. 3. Resuspendera (lös upp) pelleten genom vortex i kvarvarande vätska (fortfarande i GSA-röret). Tillsätt sedan 1 x BugBuster-lösning (använd 5 ml av 1 x BugBuster-lösning per gram våt cellpellet). 4. Inkubera i rumstemperatur i 20 min. Skaka röret då och då.

23 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning Centrifugera (efter jämviktning mot annat rör; använd 1 x TST-buffert) vid rpm i 20 min. 6. Filtrera supernatanten genom ett 1.2 m-filter monterat på en 50 ml-spruta ned i en 100 ml E-kolv. Tag ut en alikvot (10 l) av den filtrerade supernatanten till ett märkt 1.5 ml Eppendorfrör och spara i frys för analys med SDS-PAGE (dag 4). 7. Montera en IgG-kolonn och låt i tur och ordning följande lösningar fullständigt rinna igenom (OBS! ladda inte nästa lösning förrän föregående passerat helt): 0. Låt lagringsbufferten rinna igenom M HAc (ph 3.4) 3 ml 2. 1 TST 3 ml M HAc (ph 3.4) 3 ml 4. 1 TST 3 ml 8. (a) Späd supernatanten till en slutvolym av 20 ml med 1 TST-buffert. Ladda halva volymen (dvs. 10 ml) av den filtrerade och spädda supernatanten på kolonnen och låt rinna igenom helt. (b) Tvätta kolonnen med 10 ml av 1 TST-buffert. 9. Tillsätt 3 ml av 5 mm NH 4 Ac (ph 5.5)-lösning till kolonnen (sänker buffertstyrkan och ger därmed en effektivare eluering). 10. Lys på kolonnen med UV-lampa innan eluering för detektion av det inbundna proteinet. 11. Eluera inbundet protein portionsvis med 0.5 M HAc (ph 3.4) ned i en serie märkta 1.5 ml Eppendorfrör. Börja med en portion om 0.5 ml följt av fyra stycken portioner om 1.0 ml (dvs. 0.5, 1.0, 1.0, 1.0, 1.0 ml; totalt 5 portioner). Tejpa fast kolonnen på Eppendorfrören vid varje eluering för säkerhets skull. 12. Kolonnen skall nu tvättas i två steg och sedan konserveras. (a) Tvätta kolonnen med 5 ml 0.5 M HAc (ph 3.4). (b) Tvätta kolonnen med 10 ml 1 TST (c) Konservera kolonnen med 10 ml 1 TST innehållande 20% EtOH (hindrar mikrobiell växt). Ge kolonnen till assistent efter konservering. 13. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 280 nm för varje fraktion. Använd 0.5 M HAc (ph 3.4) som referens. Beräkna mängden protein i varje fraktion. För att kunna beräkna detta måste sambandet mellan A 280 nm och proteinkoncentration bestämmas. Därtill behövs (extinktionskoefficienten) för fusionsproteinet Z- EGFP. Denna faktor baseras på antalet aromatiska aminosyror i proteinet (se bilaga 6 för beräkningsformel). 14. Tag ut ett prov motsvarande 20 μg protein från fraktionen med det högsta absorbansvärdet till ett nytt och märkt 1.5 ml Eppendorfrör. Frystorka detta prov över natt (assistent visar), för senare analys med SDS-PAGE (se dag 4).

24 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 24 Dag 4 A. Proteinproduktion och rening (fortsättning). 1. Lös upp det frystorkade proteinprovet i 10 μl 1 x Red-buffert ("Red" betyder att bufferten innehåller ett reducerande ämne som bryter eventuella disulfidbryggor inuti eller mellan proteiner). 2. Tillsätt 2.5 μl av 5 Red-buffert (mer koncentrerad än 1 x Red) till det 10 μl-prov som ni tog ut från supernatanten efter lyseringen av cellerna (dag 3). 3. Koka rören 5 min. (värmeblock eller vattenbad) med locket på. Centrifugera sedan i några sekunder för att få ner lösningen i botten av röret. 4. Förbered en 20 % homogen polyakrylamidgel (av typen Phastgel) och ladda 1.2 μl av de två proven till gjorda reliefbrunnar på en bit Parafilm (assistent visar). Gå ihop gruppvis för att maximalt utnyttja Phastgelen. Applicera kammen på brunnarna för att suga upp provlösning. Sätt sedan kammen på hållaren i elektroforesenheten. Kör igång ett förprogrammerat elektroforesprogram (med beteckningen "20 % homogen"). 5. Efter avslutat elektrofores, överför gelen till infärgningsbadet och sätt igång ett förprogrammerat program (med beteckningen "Coomassie-infärgning"). Låt gelen torka efter avslutad infärgning varefter inplastning utförs (hjälp av assistent). 6. Assistenter scannar de inplastade gelerna digitalt och lägger upp dem på labkurshemsidan där ni själva får hämta dem.

25 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 25 Riktlinjer för rapportskrivning Rapporten skall innehålla: 1. Innehållsförteckning 1. En beskrivning över vad som gjorts innehållande teori, resultat och primärdata (i bilagor): - mutagenesen - plasmidpreparering - gelelektrofores - transformering, redogörelse för vilka tillsatser som finns i plattorna och varför - PCR-amplifiering (inkl. längd hos PCR-produkten) - konfirmatorisk sekvenering (med Pyrosekvenering) - proteinproduktion (inkl. induktion av transkription) och analys av renat protein 2. En sekvensfigur (extrablad finns med som bilaga till denna handledning) med hybridiseringslägena markerade för de olika oligonukleotiderna som användes (mutagenes och PCR). 3. Tolkning av pyrogrammet och svar på vilket kodon (vilken aminosyra) som stoppkodonet byttes ut mot. 4. Utseendet hos ett hypotetiskt pyrogram för sekvenering av en 50/50-blandning av vildtyp- och mutantsekvens (förutsatt samma dispenseringsordning). 5. Transformationsfrekvens (antal kolonier/ g DNA) samt mutationsfrekvens (% gröna kolonier). Redovisa uträkningarna. 6. Beräknad extinktionskoefficient och svar på hur mycket protein som kunde renas totalt (uttryckt i mg) samt utbytet (mg/liter odling). Tänk på att endast hälften av materialet laddades på kolonnen. 7. Tolkning av SDS-PAGE-gelen. 8. Diskussion - Misslyckades något? Teori om varför? 9. Utvärdering av laborationen (anonymt om så önskas): - var den intressant/lärorik? - var manualen lätt att följa? - var genomgångarna bra? - förslag på ändringar (innehåll, utförande) OBS! Rapporten skall inlämnas elektroniskt (via ) till assistenterna senast inom en vecka efter laborationens slut. Assistenterna anger relevant adress.

26 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 26 Plasmidkarta för målplasmiden pz-stop-egfp Bilaga 1. TAA P lac Z pz-stop-egfp 3.6 kbp

27 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 27 Bilaga 2. DNA-sekvens innehållande målsekvensen för mutagenesen... ACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGAT TCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTC ACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC "-35" "-10" Start Lac Z leader Start Z ACACAGGAAACAGCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA Met Val CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC TTC ATC CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC TTG CTA GCA GAA GCT Slut Z AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA CAG ATC TAA TCG GAT CCC CGG GTA CCG GTC Lys Start EGFP GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC...

28 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 28 Bilaga 2. Extra kopia till rapport DNA-sekvens innehållande målsekvensen för mutagenesen... ACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGAT TCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTC ACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC "-35" "-10" Start Lac Z leader Start Z ACACAGGAAACAGCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA Met Val CAA CAA AAC GCG TTC TAT GAG ATC TTA CAT TTA CCT AAC TTA AAC GAA GAA CAA CGA AAC GCC TTC ATC CAA AGT TTA AAA GAT GAC CCA AGC CAA AGC GCT AAC TTG CTA GCA GAA GCT Slut Z AAA AAG CTA AAT GAT GCT CAG GCG CCG AAA CAG ATC TAA TCG GAT CCC CGG GTA CCG GTC Lys Start EGFP GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC ACC GGG GTG GTG CCC ATC CTG GTC GAG CTG GAC GGC GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC AGC GTG TCC GGC GAG GGC GAG GGC GAT GCC ACC TAC GGC AAG CTG ACC CTG AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC AAG CTG CCC GTG CCC TGG CCC ACC CTC GTG ACC ACC CTG ACC TAC GGC GTG CAG TGC TTC AGC CGC TAC CCC GAC CAC...

29 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 29 Bilaga 3. Oligonukleotider som används i laborationen (mutagenes, PCR och pyrosekvenering) Pyro-1: 5 - GTACCCGGGGATCCGATT -3 R-primer: 5 - CCAGGATGGGCACCACCCCGGTG -3 F-primer: 5 - Bio-GTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG -3 Mut-1: 5 - GCGCCGAAACAGATCCAATCGGATCCCCGGGTA -3

30 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 30 Bilaga 4. Genetiska koden

31 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 31 Bilaga 5. Aminosyrasammansättning för fusionsproteinet Z-EGFP Z-EGFP Antal aminosyror: 317 Molekylvikt: Aminosyrakomposition: Ala (A) % Arg (R) 8 2.5% Asn (N) % Asp (D) % Cys (C) 2 0.6% Gln (Q) % Glu (E) % Gly (G) % His (H) % Ile (I) % Leu (L) % Lys (K) % Met (M) 8 2.5% Phe (F) % Pro (P) % Ser (S) % Thr (T) % Trp (W) 1 0.3% Tyr (Y) % Val (V) %

32 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 32 Bilaga 6. Formel för beräkning av ett proteins extinktionskoefficient Proteinkoncentrationen uppskattas i den här laborationen genom absorbansmätning vid 280 nm. Absorbansen och proteinlösningens koncentration har följande samband: Abs = * b * c 1 Abs = absorbans 280 nm [dimensionslöst] = molär extinktionskoefficient [L mol -1 cm -1 ] b = kyvettlängd [cm] c 1 = proteinkoncentration [mol L -1 ] Ofta vill man veta proteinets koncentration i enheten g/l (= mg/ml). För sådana beräkningar finns följande samband: Abs = a * b * c 2 där: a = / M w a = extinktionskoefficient [L g -1 cm -1 ] = molär extinktion [L mol -1 cm -1 ] M w = molvikt [g/mol] c 2 = proteinkoncentration [g L -1 ] Den molära extinktionen beror av proteinets aminosyrasammansättning. Följande formel används för beräkning av den: = Trp* Tyr* Cys*120 Trp = antal tryptofaner i proteinet Tyr = antal tyrosiner i proteinet Cys = antal cysteiner i proteinet

33 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 33 Bilaga 7. Molekylvikter (kda) hos proteiner i markörmixen (SDS-PAGE)

34 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 34 Bilaga 8. Längder (bp) hos fragmenten i markörmixen "GeneRuler"

35 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 35 Bilaga 9. Beskrivning av koncentrationsbestämningsmarkören "Low DNA Mass Ladder"

36 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 36 Bilaga 10. Beskrivning av plasmidpreparering från E. coli-celler enligt kit från Qiagen BACTERIAL CELL CELL LYSIS Cellular debris Cellular debris HIGH ph DENATURATION NEUTRALIZATION Chromosomal dsdna (double stranded) Plasmid dsdna (double stranded) Chromosomal ssdna (single stranded) Plasmid ssdna (single stranded) Collapsed large chromosomal DNA (original basepairings only partially restored) Renatured plasmid dsdna (original basepairings completely restored) Water molecules CENTRIFUGATION/ FILTRATION SELECTIVE ADSORPTION OF DNA TO SILICA Negatively charged SiO2 Chaotropic salt (attracts water) Plasmid dsdna (negatively charged) Released water molecules (higher entropy) ELUTION WITH LOW SALT BUFFER Pure plasmid DNA Hydrogen bonds

37 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 37 Bilaga 10 (forts.) Översiktlig beskrivning av plasmidpreparering enl. kit från Qiagen. 1. Centrifugerade celler resuspenderas i en kontrollerad buffert (P1, som också innehåller enzymet RNAse A som bryter ned RNA). Cellerna som innehåller kromosomalt DNA, plasmid DNA (ca. 500 kopior/cell av den typ som används i labben) och andra biomolekyler lyseras (sönderdelas) sedan med en alkalisk (högt ph) lösning (P2) som också innehåller en detergent. 2. Det höga ph-värdet gör att de två DNA-kedjorna i dubbelsträngat DNA separareras från varandra och att flertalet proteiner denatureras. 3. Provet ph-neutraliseras sedan med lösning N3 som också innehåller ett kaotrofiskt salt (guanidiniumhydroklorid; strukturerar vatten kring sig). Neutraliseringen gör att vid detta steg kan det relativt korta plasmid DNA t återfå sin dubbelsträngade form emedan det mycket större (längre) kromosomala DNA t "kollapsar" till en olöslig form pga att de två strängarna inte förmår hitta varandra perfekt och därför aggregerar tillsammans med denaturerade proteiner. 4. Efter ett centrifugerings- eller filtreringssteg där olösligt material avlägsnas får provet möta en kiselbaserad matris för uppbinding av lösligt DNA. Då både kiselytan och DNA (via fosforgrupperna) är negativt laddade kan man undra hur DNA kan fås att fastna. Svaret ligger i användandet av det kaotrofiska saltet. Dels har det en viss dämpande effekt på den elektrostatiska repulsionen, och dels främjar det frisläppandet av ytbundna vattenmolekyler hos DNA och kiselytan till lösningen. Det senare gör att DNA adsorberar till kiselytan via en entropidriven reaktion (vattenmolekylerna får ökad entropi) där vätebindningar sedan utbildas mellan kiselytan och DNA. Vid detta kritiska steg är betingelserna (buffertkomposition) utprovade så att preferentiellt DNA, och inte kvarvarande RNA-rester skall binda till kiselytan. 5. Efter tvätt med lösning PE (innehåller etanol) kan provet elueras från kiselytan med lösning EB av låg saltkoncentration (som alternativ kan vatten användas).

38 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 38 Protokoll från leverantör (Qiagen) Bilaga 10 (forts.)

39 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 39

40 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 40

41 Molekylär Bioteknik, KTH In vitro-mutagenes Laborationshandledning 41