Proteinsyntesen. Anders Liljas Biokemi och strukturbiologi Lunds universitet

Transkript

1 Proteinsyntesen Anders Liljas Biokemi och strukturbiologi Lunds universitet

2 Ett fundament i proteinsyntesen är strukturen av nukleinsyror. F. Crick, J. Watson & Wilkins Nobelpris i medicin 1962 Wikipedia

3 Det centrala dogmat: Omvänd transkription DNA > Transkription > proteiner Proteinsyntes Replikation

4 Proteinsyntesen är central i alla organismer och alla celler. Generna översätts till fungerande proteiner som är maskineriet i alla organismer. Ribosomerna är sätet för proteinsyntesen. Ribosomerna upptäcktes på 50-talet liksom mrna. Översättningsmaskiner!

5 1 955 Ribosomes ses som svarta prickar med EM Doutheil et al. 1997

6 mrna Kodon A G G T C T A C C G A T Val Tyr Arg Protein aa1 aa2 aa3 Val Tyr Arg aa7 aa8 aa9 aa10 aa11 aa12 aa13 aa14 Hur görs proteiner?

7 Cricks adaptorhypotes, 1955 Översättningen av mrna kräver adaptorer som dels bär aminosyrorna och dels passar mot mrna. I sin enklaste form behövs 20 adaptorer, en för varje aminosyra. Adaptorerna är troligen små RNA-molekyler. Adaptorhypotesen ledde till identifieringen av srna (nu trna) av Hoagland et al. (1957). Crick blev förvånad när han fick veta att srna molekylerna var så långa som nukleotider.

8 trna: substratet i översättningen Den klassiska klöverbladsstrukturen bekräftades av Levitt, D strukturen av trna har formen av ett L! 75Å mellan acceptorände och antikodon! Ribosomen måste vara byggd att passa!

9 Aminoacylering av trna med hjälp av syntetaser aa + ATP --> aa-amp + PP aa-amp + trna --> aa-trna + AMP Aktivering Aminoacylering 1) Aminosyran måste vara korrekt 2) trna måste också vara korrekt.

10 Aminosyror som är större än den rätta kan lätt förkastas. Aminosyror som är mindre än den rätta (t ex Val jämfört med Ile) måste tas bort genom editering.

11 Mekanism med två silar : E + aa + ATP Aktivering E aa-amp + PPi Editering före bindning E + aa + trna aa + AMP Aminoacylering E aa-trna aa + AMP Editering efter bindning

12 trna bindning till Asp+tRNA Antikodonen kollas

13 GlnRS+tRNA ATP Antikodon

14 1966 Den universella genetiska koden. 1sta basen U C A G 2ra basen U C A G Phe F Ser S Tyr Y Cys C U Phe F Ser S Tyr Y Cys C C Leu L Ser S STOP STOP A Leu L Ser S STOP Trp G Leu L Pro P His H Arg R U Leu L Pro P His H Arg R C Leu L Pro P Gln Q Arg R A Leu L Pro P Gln Q Arg R G Ile I Thr T Asn N Ser S U Ile I Thr T Asn N Ser S C Ile I Thr T Lys K Arg R A Met M Thr T Lys K Arg R G Val V Ala A Asp D Gly G U Val V Ala A Asp D Gly G C Val V Ala A Glu E Gly G A Val V Ala A Glu E Gly G G 3je basen Nirenberg et al., 1961, 1964

15 1970 2D gel av ribosomala proteiner från E. coli. 30S: S1-S21 50S: L1-L33 Kaltschmidt & Wittmann PNAS 67(1970)

16 Ribosomala komponenter Källa Ribosomer Lilla subenheten Stora subenheten RNA proteiner RNA proteiner Bakterier 70S 16S 21 23S, 5S 33 Kloroplaster 70S 16S 21 23S, 5S, 4.5S 33 Archaea 70S 16S 28 23S, 5S 40 Eukaryoter 80S 18S S, 25-28S, 5S 49 Mitokondrier (växter) 78S 18S 26S, 5S (jäst) 74S 15S 31 21S 46 (humant) 12S 29 16S 50 (trypanosomer) 50S 9S 77 12S 56 Ribosom RNA mer än hälften av ribosomproteinerna är desamma i alla organismer.

17 1978 E. coli rrna sekvens och sekundärstruktur (Brosius et al. 1978, 1980). Konserverade regioner är enkelsträngade. Funktionella säten? 16S RNA 4 domäner 23S RNA 6 domäner 5S RNA

18 Ribosomen syntetiserar proteiner färdigt protein växande protein en kedja av aminosyror trna mrna Copyright: Nobelstiftelsen

19 1964 Watson, angående översättningsmaskineriet Unfortunately, we cannot accurately describe at the chemical level how a molecule functions unless we know first its structure. FUNKTION ÄR STRUKTUR!

20 Ada Yonath & HG Wittmann Kristaller av ribosomer Ada E. Yonath Nobelprize in chemistry 2009

21 Röntgenkristallografi Röntgen Ribosomkristall Diffraktions mönster 3D ribosom struktur

22 Ada E. Yonath Nobel pris i kemi 2009 Stabila kristaller, som bör kunna ge atomära strukturer

23 Mot hög upplösning! 20Å EM 20Å Röntgen 9Å 1998 Thomas A. Steitz Nobel pris i kemi Å Å Å 2000

24 2000- Kristallstruktur av ribosomer och subenheter E P A 50S 30S Yusupov et al., 2001

25 30S 50S Ribosomala proteiner har ovanlig struktur med svansar elleror lopar. Ofta rika på basiska aminosyror. Ramakrishnan & Moore, 2001

26 mrna/trna kanalen Ribosomala säten mrna trna Peptidyl transferas Peptidtunneln Avläsningscentrum De funktionella sätena ligger mellan subenheterna.

27 trna säten E P A Ribosomala säten Bindningsställe för GTPaser Subenhetsbryggor Liljas 2006

28 Translationsfaktorer katalysatorer I bakterier Initiering IF1 Hjälper IF-2 i initieringen IF2 Binder initiator-trna till P-sätet. GTPas IF3 Dissocierar subenheterna Elongering EF-Tu Binder aa-trna till A-sätet. EF-Ts GEF för EF-Tu EF-G Translokering GTPas GTPas Terminering och recykling RF1, 2 Frisätter peptiden från P-sätets trna RF3 Frisätter RF-1,2 från ribosomen. GTPas RRF Dissocierar de terminerade ribosomerna

29 E P A Translokation EF-G:GTP Peptid frisättning RF1/RF2 RF3:GTP E P A Peptidtransfer Elongering Frisättning, recykling, initiering Ribosom recykling RRF EF-G:GTP E P A E P A aa-trna leverans EF-Tu:GTP Initiering IF-1 IF-2:GTP IF-3 E P A

30 EF-Tu Med GTP Med GDP Med trna

31 50S PTC E EF-Tu DC 30S mrna Bindning av aa-trna till A/T-sätet

32 50S PTC E DC 30S mrna EF-Tu hydrolyserar sitt GTP och dissocierar när trna passar till kodonen. aa-trna accomoderas till A-sätet

33 Bindning av rätt trna till 70S Venkatraman Ramakrishnan Nobelpris i kemi 2009

34 Centrum för peptidyltransfer är vid början av peptidtunneln!

35 Peptidyltransfer G G C C A C C A G G G C C A C C A G P A P Acceptorns 3 -ände (trna) har den universellt konserverade CCA-sekvensen. A

36 E P A Translokation EF-G:GTP Peptid frisättning RF1/RF2 RF3:GTP E P A Peptidtransfer Elongering Frisättning, recykling, initiering Ribosom recykling RRF EF-G:GTP E P A E P A aa-trna leverans EF-Tu:GTP Initiering IF-1 IF-2:GTP IF-3 E P A

37 EF-G translokerar pp-trna från A till P sätet Ævarsson et al Czworkowski et al 1994 EF-G härmar EF-Tu med trna

38 Schmeing et al EF-Tu EF-G Gao et al., 2009

39 50S PTC E EF-G DC 30S mrna Bindning peptidyl-trna av EF-G, translokering i A-sätet

40

41 Ribosomen är en central måltavla för antibiotika Translocation E P A E P A Peptidyl transfer Elongation Release, recycling, initiation E P A aa-trna delivery Initiation E P A E P A

42 Antibiotika i avläsningscentrum tetracyclin pactamycin hygromycin B Helix 44 (h44)

43 Makrolider utgör en propp förhindrar fortsatt växt av polypeptidkedjan.

44 A-site trna P-site trna Bindning av makrolider i peptidtunneln

45 Sammanfattning Strukturbiologi har lett till en revolution i förståelse av translationssystemet. Samma sak gäller för alla biologiska system där strukturen studerats. Samspelet med biokemi är nödvändigt.

46

47