EGFR pharmdx. Kod K tester för användning på Dako Autostainer Upplaga 05/2015. Avsedd användning För in vitro-diagnostik.

EGFR pharmdx Kod K1494 50 tester för användning på Dako Autostainer Upplaga 05/2015 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Analysen EGFR pharmdx är ett kvalitativt immunhistokemiskt (IHC) kitsystem som används för att identifiera uttrycket av epidermal tillväxtfaktor-receptor (EGFR) i normala och neoplastiska vävnader som fixerats rutinmässigt för histologisk bedömning. EGFR pharmdx detekterar specifikt proteinet EGFR (HER1) i celler som uttrycker EGFR. EGFR pharmdx indikeras som ett hjälpmedel vid identifiering av patienter med kolorektal cancer som kan komma i fråga för behandling med ERBITUX (cetuximab) eller VECTIBIX (panitumumab). Sammanfattning och förklaring Inledning Epidermal tillväxtfaktor-receptor är en transmembran receptor på 170 kd, kodad av den humana HER1-genen. EGFR-proteinet innehåller en extracellulär ligandbindande domän, en transmembran region och en intracellulär domän med egen protein-tyrosinkinasaktivitet. EGFR är homolog med andra medlemmar av EGF-receptor-/erbB-familjen, inklusive HER2/erbB2 eller neu, HER3/erbB3 och HER4/erbB4. 1,2 EGFRproteinet uttrycks av en rad olika normala celler, inklusive många epitelcelltyper och tumörer härledda från dem. 3-9 Icke-epitelcelltyper som uttrycker EGFR omfattar glatt muskulatur, fibroblaster och nervceller. 10 Specificitet Monoklonal anti-human EGFR från mus, klon 2-18C9 levereras som en klar hybridomvävnadskultur producerad med hjälp av en mus immuniserad med EGFR immunoprecipiterad från cellinjen A431 (humant epidermoid carcinom). Epitopmappingstudier tyder på att antikroppen känner igen en epitop i den extracellulära cysteinrika regionen av molekylen som täcker subdomän S2 och proximalt till den transmembrana domänen. Ytterligare mapping av kritiska aminosyror tyder på att epitopen är konformationell och beroende av disulfidbindningar i den ursprungliga molekylen. 11 Denna monoklonala antikroppsklon har visat sig inte korsreagera med HER2, HER3 eller HER4 och vektormarkeringen myc. Cytoplasmisk färgning ses ganska ofta; testet skall dock upprepas om omfattande cytoplasmisk färgning gör det svårt att urskilja den diagnostiska membranfärgningen och tolka resultaten. Procedurprincip EGFR pharmdx IHC kitsystemet innehåller de reagenser som krävs för att utföra en IHC-färgningsprocedur av rutinmässigt fixerade, paraffininbäddade prover. Efter inkubering med den primära monoklonala antikroppen, klon 2-18C9, mot humant EGFR-protein, utnyttjar detta kit ett bruksfärdigt visualiseringsreagens baserat på dextranteknik. Detta reagens består av både sekundära antimusantikroppsmolekyler från get och pepparrotsperoxidasmolekyler bundna till en gemensam dextranpolymerstam vilket eliminerar behovet av sekventiell applicering av länkantikropp och peroxidaskonjugat. Den enzymatiska omvandlingen av därefter tillsatt kromogen resulterar i att en synlig reaktionsprodukt bildas på antigenplatsen. Provet kan sedan kontrastfärgas och förses med täckglas. Resultaten tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. Kontrollpreparat som innehåller två formalinfixerade, paraffininbäddade humana cellinjer med färgningsintensitetspoäng 2+ och 0 ingår för kvalitetskontroll av satsens reagensprestanda. Reagenser Kod K1494 är för automatiserad färgning med DAKO Autostainer. Det uppräknade materialet är tillräckligt för 50 tester (50 objektglas inkuberade med primärantikroppen till EGFR-protein och 50 objektglas inkuberade med motsvarande negativ kontrollreagens). Antalet tester grundar sig på användning av protokollet EGFR pharmdx Autostainer med alla bruksfärdiga reagenser. Kitet innehåller tillräckligt med material för maximalt 10 individuella färgningskörningar. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 1/13

Medföljande material Kvantitet Beskrivning 2x11 ml Proteinas K < 0,1 % Proteinas K proteolytiskt enzym spädd i en Tris-HCl-buffert innehållande 0,015 mol/l natriumazid. 2x11 ml Peroxidasblock 3 % väteperoxid. 1 x 12 ml EGFR pharmdx monoklonal IgG 1-antikropp från mus Monoklonal anti-human EGFR-IgG 1-antikropp (klon 2-18C9) från mus, klar vävnadskultur i Tris-HCl-buffert, innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 1x11 ml IgG 1 från mus, negativ kontroll-reagens Monoklonal IgG1-antikropp från mus, klar vävnadskultur i Tris-HCl-buffert, innehållande stabiliserande protein och 0,015 mol/l natriumazid. 2x11 ml Märkt polymer, HRP Dextranpolymer konjugerad med pepparrotsperoxidas och affinitetsisolerade anti-musimmunoglobuliner från get. Levereras i Tris-HCl-buffert innehållande stabiliserande protein och antimikrobiellt medel. 10x11 ml DAB+ substratbuffert Substratbuffertlösning, ph 7,5, innehållande <0,1 % väteperoxid, stabilisatorer, förstärkare och antimikrobiellt medel. 2x3 ml Flytande DAB+ kromogen 5 % 3,3'-diaminobensidin i kromogenlösning. 2x1 liter Tvättbuffert 10x Trisbuffrad saltlösning innehållande Tween 20, ph 7,6. 2 x 5 objektglas EGFR pharmdx kontrollpreparat Varje objektglas innehåller snitt av två pelleterade formalinfixerade paraffininbäddade humana cellinjer som representerar en måttlig nivå av EGFR-proteinuttryck och inget EGFR-uttryck. IHC-färgningspoäng för cellpelletarna är 2+ och 0. Cellinje: CAMA-1 Uttrycksnivå: 0 Cellinje: HT-29 Uttrycksnivå: 2+ (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 2/13

Material som behövs, men inte ingår Ammoniumhydroxid, 15 mol/l spädd till 0,037 mol/l Kontrastfärgning: Hematoxylin, alkohol- eller vattenbaserad, t.ex. Dakos Hematoxylin (kod S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kod S3301) Täckglas Destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) Torkugn som kan hålla 56 60 C Etanol, absolut och 95% Ljusmikroskop (4 40x objektivförstoring) Monteringsmedium, t.ex. Dakos Faramount (kod S3025) eller Dakos Glycergel (kod C0563) eller Dakos Ultramount (kod S1964) Positiva och negativa vävnader att använda som processkontroller (se avsnittet om Kvalitetskontroll) Objektglas, Fishers SuperFrost Plus, poly-l-lysinbelagda objektglas, laddade objektglas eller Dakos Silanized Slides (kod S3003) (se avsnittet Provberedning) Färgningskärl eller -bad Tidtagarur (som kan mäta 2 30 minuters intervall) Tvättflaska Xylen, toluen eller xylensubstitut 1 ml-pipett Dako Autostainer Universal Staining System (kod S3400) eller Autostainer Plus (kod S3800) med Dako Autostainer programvara, version 3.0.0 eller högre. (Se Dako Autostainer Bruksanvisning för nödvändiga komponenter.) OBS: Alla reagenser som medföljer eller finns att tillgå separat, t.ex. Dakos Wash Buffer (kod S3006), är särskilt utformade för att användas med detta test. Inga utbyten kan göras om testet skall bete sig enligt specifikationen. Provberedning Biopsiprover måste hanteras så att vävnaden bevaras för IHC-färgning. Standardmetoder för vävnadsbearbetning skall användas för alla prover. 13 Prover konserverade i följande fixativ lämpar sig för testning med EGFR pharmdx: 10 % (v/v) neutralbuffrat formalin, 10 % (v/v) obuffrat formalin, 25 % (v/v) obuffrat formalin, AFA (acetic formalin alcohol), Richard-Allen Scientifics Pen-fix och Bouins fixativ. Vävnader fixerade i Anatechs PreFer lämpar sig inte för testning med EGFR pharmdx. Om EGFR pharmdx används på PreFer-fixerade vävnader bevaras inte morfologin på ett tillfredsställande sätt och resultaten kan bli felaktiga. 14 Paraffininbäddade snitt Rutinbehandlade och paraffininbäddade vävnader är lämpliga att använda. Biopsiprover skall blockas till en tjocklek på 3 eller 4 mm och fixeras under så lång tid som är lämpligt för fixativet. Vävnaderna dehydreras sedan och klargörs i en serie alkoholer och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin. Paraffintemperaturen får inte överstiga 60 C. Korrekt fixerade och i nbäddade vävnadsblock som uttrycker EGFR-protein håller i evighet före snittning och montering på objektglas om de lagras svalt (15 25 C). 13,15 Vävnadsprover skall snittas i 3 5 µm tjocka snitt. Efter snittning skall vävnaderna monteras på objektglas och placeras i torkställ. Följande objektglas rekommenderas: Fishers SuperFrost Plus, Dakos Silanized (kod S3003), laddade eller poly-l-lysinbelagda objektglas. Objektglasställen skall slås mot en absorberande handduk för att avlägsna vatten som fastnat under paraffinet och på glaset och sedan torkas i rumstemperatur i en timme. Glasstället skall sedan placeras i en inkubator som håller 56 60 C i en timme. Allt överskottsvatten som finns kvar på objektglasen efter att de tagits ut från inkubatorn skall avlägsnas genom att objektglasen slås mot handdukar och får torka i ytterligare en timme i inkubatorn. När objektglasen tagits ut från inkubatorn skall de hållas vid rumstemperatur tills de har svalnat och paraffinet har hårdnat. För att bevara antigeniciteten skall vävnadssnitten, monterade på objektglas (Fishers SuperFrost Plus, poly-l-lysin, laddade eller Dakos Silanized slides (kod S3003), färgas inom 2 månader efter snittningen när de förvaras i rumstemperatur (20 25 C). 14 Se Dakos handbok: Immunochemical Staining Methods 16 eller referenserna 13 och 15 för ytterligare information om provberedning. Användning av detta test på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. De preparat som behövs för EGFRutvärdering och för att bekräfta närvaro av tumör skall framställas samtidigt. Minst 5 objektglas rekommenderas, 1 objektglas för tumörnärvaro, 2 objektglas för EGFR-proteinutvärdering (ett objektglas för primärantikroppen och ett objektglas för det negativa kontrollreagenset) och 2 objektglas för backup. Försiktighetsåtgärder 1. För yrkesmässigt bruk. 2. Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN 3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när du kasserar det, så att inte metallazider ackumuleras i avloppet. 17 3. I likhet med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta hanteringsprocedurer användas för såväl prover som reagenser. 4. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenserna för att undvika icke-specifik färgning. 5. Andra inkuberingstider, temperaturer eller metoder än de som specificeras kan ge felaktiga resultat. 6. Reagenserna har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan resultera i minskad antigenfärgning. 7. Byt inte ut primärantikroppar eller negativa kontrollreagenser mot primärantikroppar och negativa kontrollreagenser från andra tillverkningssatser (satsnummer finns på flaskornas etikett) eller mot reagenser från andra tillverkare. 8. Märkt polymer, flytande DAB+ kromogen och beredd DAB+ substrate-kromogenlösning kan påverkas negativt om de utsätts för alltför höga ljusnivåer. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgningen i starkt ljus, såsom direkt solljus. 9. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 18 Oanvänd lösning skall kasseras enligt lokala och statliga föreskrifter. 10. Datablad för materialsäkerhet finns tillgängliga för professionella användare på begäran. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 3/13

11. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämpliga arbetsprocedurer, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). Fara DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P281 Använd föreskriven personlig skyddsutrustning. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Varning Wash Buffer (10X): 5-10% Sodium chloride, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj försiktigt med vatten i flera minuter. Ta ur eventuella kontaktlinser om det går lätt. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Vid bestående ögonirritation: Sök läkarhjälp. Förvaring Förvara EGFR pharmdx kitsystem vid 2 8 C. Kontrollpreparaten måste också förvaras vid 2 8 C. Beredd Substrate-Chromogen Solution (DAB) är stabil i cirka 5 dagar när den förvaras vid 2 8 C. Använd inte satsen efter det utgångsdatum som finns tryckt på kartongens utsida. Det finns inga tydliga tecken på instabilitet för denna produkt. På grund av detta bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt som patientprover. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som anges i produktbladet. 12 Bruksanvisning Reagensberedning Följande reagenser måste beredas före färgningen: Tvättbuffertlösning Bered en tillräcklig mängd tvättbuffert genom att späda Tvättbuffert 10x, 1:10 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) för tvättstegen. Kassera bufferten om den ser grumlig ut. Substrat-kromogenlösning (DAB+) Denna lösning skall blandas ordentligt före användning. Eventuella fällningar som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningskvaliteten. Bered DAB+ substrate-kromogenlösning genom att tillsätta 11 droppar flytande DAB+ kromogen till en flaska DAB+ substratbuffert och blanda. Kassera all oanvänd lösning. Viktigt: Färgen på Liquid DAB+ Chromogen i flaskan kan variera från klar till ljust lavendel-brun. Detta påverkar inte produktens prestanda. Späd enligt beskrivningen ovan. Om du tillsätter för mycket Liquid DAB+ Chromogen till DAB+ Substrate Buffer kommer den positiva signalen att försämras. Kontrastfärg Bered ammoniakvatten för kontrastfärgsbluing vid behov. Ammoniakvatten (0,037 mol/l) bereds genom att blanda 2,5 (±0,5) ml 15 mol/l (koncentrerad) ammoniumhydroxid med 1 liter vatten av reagenskvalitet. Oanvänt 0,037 mol/l ammoniakvatten kan förvaras vid rumstemperatur (20 25 C) i en tä tt försluten flaska i upp till 12 månader. Monteringsmedel Monteringsmedel som bruksfärdigt Dakos Faramount Aqueous Mounting Medium (kod S3025) eller Dakos Glycergel Mounting Medium (kod C0563) rekommenderas för vattenbaserad montering. Gör Glycergel flytande genom att värma det till cirka 40(±5) C före användning. Ickevattenbaserade permanenta monteringsmedel är också lämpliga, t.ex. Dakos Ultramount (kod S1964). (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 4/13

Färgningsprocedur på Dako Autostainer Anm. om proceduren Användaren bör läsa dessa anvisningar noggrant och bekanta sig med alla komponenter innan de används (se Försiktighetsåtgärder). Se DAKO Autostainer, Universal Staining System, User Guide. Alla reagenser skall anta jämvikt vid rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. Likaså skall alla inkuberingar utföras vid rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa ökad icke-specifik färgning. Avparaffinering och rehydrering Innan färgningen utförs måste objektglas med vävnadspreparat avparaffineras för att avlägsna inbäddningsmedlet och rehydreras. Se till att allt paraffin avlägsnas. Rester av inbäddningsmedlet orsakar ökad icke-specifik färgning. STEG 1. Placera objektglasen i ett xylenbad och inkubera i 5 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 2. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i absolut etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 3. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i 95% etanol i 3 (±1) minuter. Byt bad och upprepa en gång. STEG 4. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i vatten av reagenskvalitet i 5 (±1) minuter. STEG 5. Slå bort överskottsvätska och placera objektglasen i tvättbuffert. Börja färgningsproceduren enligt beskrivningen i färgningsprotokollet. Xylen- och alkohollösningar skall bytas efter 40 objektglas. Toluen eller xylenersättningar, t.ex. Histoclear, kan användas i stället för xylen. EGFR pharmdx inkluderar förbehandling med ett proteolytiskt enzymnedbrytningssteg. Vävnadssnitt kan ibland bli nedbrutna för mycket, vilket orsakar söndertrasning av cellmembran och den allmänna vävnadsstrukturen. Kör analysen och var särskilt uppmärksam på hur länge det proteolytiska nedbrytningssteget pågår. OBS: Om överdriven nedbrytning är ett återkommande problem kan 10 % neutralbuffrade formalinfixerade vävnader efterfixeras i 10 % neutralbuffrat formalin i 10 minuter efter deparaffineringen. Se nedanstående procedur: Efterfixeringsprocedur 1. Deparaffinera snitten och sänk ner dem i vatten av reagenskvalitet. 2. Sänk ner objektglasen i 10 % neutralbuffrat formalin i 10 minuter. 3. Skölj objektglasen två gånger i avjoniserat eller destillerat vatten. 4. Fortsätt med EGFR pharmdx-färgningsproceduren. Automatfärgningsprotokoll Se DAKO Autostainer, Universal Staining System, User Guide. STEG 1. Välj protokoll och programmera färgningskörningen. STEG 2. Använd Autoprogram för att ställa in program och starta EGFR pharmdx-programmet. STEG 3. Placera reagensflaskorna i DAKO Autostainer-reagensstället enligt den datorgenererade reagenskartan. STEG 4. Ladda objektglasen på DAKO Austostainer enligt den datorgenererade objektglaskartan. STEG 5. Starta körningen. STEG 6. Ta bort objektglasen från DAKO Autostainer. Fortsätt till kontrastfärgning och montering. OBS: Skölj objektglasen i vatten av reagenskvalitet efter steget med DAB+ Substrate-Chromogen Solution. (DAKO Autostainer maskinvara, versioner 02 och 03, sköljer objektglasen i vatten av reagenskvalitet efter substrat-kromogensteget. Version 01 av maskinvaran till DAKO Autostainer sköljer objektglasen i buffert. Därför måste objektglas som färgats med maskinvaruversion 01 sköljas med vatten av reagenskvalitet efter att de tagits bort från Autostainer). (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 5/13

Figur 1. Autostainer programnät Presentation av det program som körs på DAKO Autostainer. Programnätet (ovan) är en Master Protocol Template (masterprotokollmall) som innehåller protokollelement för att köra alla detektionssystem tillsammans med EGFR pharmdx kit. Endast EGFR-reagenser visas i detta nätexempel. Kontrastfärgning (anvisningar för hematoxylin) Färgningsreaktionens färgade slutprodukt är olöslig i alkohol och vatten. Hematoxylin, antingen alkohol- eller vattenbaserad, t.ex. Dakos Hematoxylin (kod S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kod S3301), kan användas. Använd inte regressiva kontrastfärger. STEG 1. Ta bort objektglasen från Dako Autostainer och kontrastfärga i hematoxylin enligt beskrivningen nedan. STEG 2. Sänk ner objektglasen i ett hematoxylinbad. Inkubera i 2-5 minuter beroende på styrkan hos det hematoxylin som används. STEG 3. Skölj försiktigt i ett vattenbad av reagenskvalitet. Kontrollera att alla rester av hematoxylin har sköljts bort.valfritt: Doppa objektglasen 10 gånger i ett bad med 0,037 mol/l ammoniakvatten. (se avsnittet om reagensberedning). Ammoniakvattensteget behövs inte om du använder Dakos Hematoxylin (kod S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kod S3301). OBS: Användning av Dakos Automation Hematoxylin (kod S3301) rekommenderas starkt. Med en 5-minuters inkubering producerar denna kontrastfärgning en milt lila/blå slutprodukt som inte skymmer specifik immunfärgning. Stark kontrastfärgning kan maskera svagt EGFRuttryck. STEG 4. Skölj varsamt i vattenbad av reagenskvalitet i 2-5 minuter. Montering Monteringsmedel som bruksfärdigt Dakos Faramount Aqueous Mounting Medium (kod S3025) eller Dakos Glycergel Mounting Medium (kod C0563) rekommenderas för vattenbaserad montering. Gör Glycergel flytande genom att värma det till cirka 40(±5) C före användning. Icke-vattenbaserade permanenta monteringsmedel är också lämpliga, t.ex. Dakos Ultramount (kod S1964). OBS: Objektglasen kan avläsas vid lämpligt tillfälle. Viss blekning kan dock ske om objektglasen täcks med ett vattenbaserat monteringsmedium och utsätts för starkt ljus. Förvara objektglasen mörkt i rumstemperatur (20 25 C) f ör att minimera blekningen. Kvalitetskontroll Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för vävnadsfixering, behandling och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till väsentliga variationer i resultaten, vilket gör det nödvändigt med regelbundna egna kontroller utöver användningen av kontrollpreparaten från Dako. I USA gäller kvalitetskontrollriktlinjerna från College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Se också CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline 19, och referenserna 20 23 för ytterligare information. EGFR pharmdx kontrollpreparat (ingår) Vart och ett av de ingående kontrollpreparaten innehåller två pelleterade, formalinfixerade, paraffininbäddade humana cellinjer med färgningsintensitetspoäng 2+ och 0. Ett objektglas skall färgas i varje färgningsprocedur. Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. De bör inte användas som hjälp vid tolkning av patientresultat. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 6/13

Positiv kontrollvävnad Kontrollerna skall vara färska obduktions-/biopsi-/kirurgiprover fixerade, behandlade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Positiva vävnadskontroller indikerar korrekt beredd vävnad och korrekt färgningsteknik. En positiv vävnadskontroll för varje uppsättning testvillkor bör ingå i varje färgningskörning. Vävnaderna som används för positiva vävnadskontroller skall ge svag positiv färgning så att de kan detektera små förändringar i primärantikroppens sensitivitet. Kontrollpreparaten som levereras med detta system eller prover som behandlats annorlunda än patientprover validerar bara reagensresultatet och verifierar inte vävnadsberedning. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för att övervaka korrekt prestanda av bearbetade vävnader och testreagenser, INTE som hjälpmedel för att utforma en specifik diagnos av patientprover. Om positiva vävnadskomponenter inte uppvisar riktig positiv färgning bör resultat med testproverna anses som ogiltiga. Normala celltyper som kan användas som en svag EGFR-positiv omfattar glandulära epitelceller från prostata och normalt bronkialt epitel. Eftersom EGFR-färgningsmönstret är heterogent kan svagt färgade normala vävnadselement också vara negativa. En stark positiv intern vävnadskontroll är perineurium. Normala celler som uppvisar måttlig EGFR-positiv färgning inkluderar epitelceller i cervix och hud. Negativ kontrollvävnad Använd en negativ kontrollvävnad (som är känt EGFR-proteinnegativ), fixerad, behandlad och inbäddad på ett sätt som är identiskt med patientproverna, med varje färgningskörning för att verifiera specificiteten hos primärantikroppen och för att ge en indikation på specifik bakgrundsfärgning. Mångfalden av olika celltyper, som förekommer i de flesta vävnadssnitt, erbjuder interna, negativa kontrollställen (detta bör verifieras av användaren). Om specifik färgning inträffar i de negativa kontrollvävnaderna skall resultaten med patientprover betraktas som ogiltiga. Vävnadselement som kan användas som negativa kontroller inkluderar kardiomyocyter från hjärtat. Pankreatiska acinarceller är också EGFR-negativa, medan pankreatiskt gallgångsepitel färgar positivt. Lymfocyter, när de förekommer, färgas inte med EGFR pharmdx och kan användas som negativ intern kontroll. Icke-specifikt negativt kontrollreagens Använd det medföljande negativa kontrollreagenset istället för primärantikroppen med ett snitt av varje patientprov för att utvärdera ickespecifik färgning och åstadkomma en bättre tolkning av specifik färgning på antigenplatsen. Inkuberingsperioden för det negativa kontrollreagenset skall motsvara den för den primära antikroppen. Analysverifiering Före den första användningen av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur skall användaren verifiera analysens resultat genom att testa den på en serie egna vävnader med kända IHC-prestandaegenskaper som representerar kända positiva och negativa vävnader. Dessa verifikationsprocedurer skall upprepas för varje nytt test. Se kvalitetskontrollprocedurerna som tidigare beskrivits i detta avsnitt av produktbladet och kvalitetskontrollkraven i CAP Certification Program for Immunohistochemistry och/eller CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 19 Carcinom med kända EGFR-proteinfärgningsintensiteter och negativa vävnader är lämpliga för verifikation av analysen. Tabell 1: Syftet med daglig kvalitetskontroll Vävnad: fixerade och behandlade som patientprov Kontrollpreparat från Dako. Positiv kontroll: vävnader eller celler som innehåller målantigen som skall detekteras (kan finnas i patientvävnad). Den ideala kontrollen är svagt positivt färgad vävnad som är mest känslig för antikroppseller antigennedbrytning. Negativ kontroll: vävnader eller celler som förväntas vara negativa (kan finnas i patientvävnad eller positiv kontrollvävnad). Specifika antikropps- & detekteringssystem Färgningsprocedur endast för kontroller Utvärderingen av cellinjerna hos kontrollpreparaten från Dako indikerar färgningskörningens giltighet. Kontrollerar alla stegen i analysen. Validerar reagenser och procedurer som används för EGFR-färgningen. Detektion av oavsiktlig korsreaktivitet mellan antikropp och celler/cellulära komponenter. Bakgrund: Icke-specifik antikropp (IgG1 från mus, negativt kontrollreagens) medföljer Detektering av icke-specifik bakgrundsfärgning. Detektering av icke-specifik bakgrundsfärgning. Patientvävnad. Detektion av specifik färgning. Detektering av icke-specifik bakgrundsfärgning. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 7/13

Tolkning av färgningsproceduren Utvärdering av objektglasen skall göras av en patolog med ljusmikroskop. Alla bedömningar skall göras i provets tumörregion. För utvärdering av immunocytokemisk färgning och poängsättning är ett objektiv med 10x eller 20x förstoring lämpligt. Använd intakta celler för tolkning av färgningsresultatet; nekrotiska eller degenererade celler färgas ofta icke-specifikt. 19 Positiva och negativa cellinjer ingår i alla EGFR pharmdx-kit för att validera färgningskörningar varje gång som analysen utförs. Korrekt färgning av kontrollcellinjerna bevisar att EGFR pharmdx-analysen fungerar som den skall. Ingen membranfärgning av kontrollcellinjen CAMA-1 (0) och medelbrun fullständig eller ofullständig membranfärgning i kontrollcellinjen HT-29 (2+) indikerar att färgningskörningen är giltig. Om färgningsintensiteten hos den positiva kontrollcellinjen är alltför svag eller alltför stark kan ett falskt negativt eller falskt positivt resultat erhållas och testet skall då upprepas. Referensbilder finns i tolkningsguiden till EGFR pharmdx. EGFR pharmdx färgar i första hand cellmembran, och uppvisar både fullständig och ofullständig perifer färgning. Immunfärgningsmönstret är ofta heterogent och uppvisar olika färgningsintensitet inom en och samma tumör. Färgning har också observerats i cytoplasman och i extracellulära utrymmen. Färgning av cytoplasman ses ganska ofta; testet skall dock upprepas om betydande färgning av cytoplasman gör det svårt att urskilja membranfärgningen och tolka resultaten. Tumörer skall rapporteras som EGFR-positiva eller EGFR-negativa med användning av membranfärgningen som den bedömningsbara strukturen. En tumörcell är EGFR-positiv om en uppvisar någon membranfärgning över bakgrundsnivån, vare sig den är helt perifer eller ej. En tumör utan membranfärgning över bakgrundsnivån i vilken som helst tumörcell skall rapporteras som EGFR-negativ. Beroende på inkuberingstiden och styrkan hos det använda hematoxylinet kommer kontrastfärgningen att ge en blek till mörk blåfärgning av cellkärnorna. Extrem eller ofullständig kontrastfärgning kan äventyra tolkningen av resultaten. Tabell 2: EGFR pharmdx-färgningsresultat Rapport till behandlande läkare EGFR-negativ tumör EGFR-positiv tumör Definition Frånvaro av membranfärgning över bakgrundsnivån i alla tumörceller EGFR-positiv färgning definieras som all IHC-färgning av tumörcells membran över bakgrundsnivån; vare sig den perifera färgningen är fullständig eller ofullständig. Färgningsintensitet Procent av tumörcellerna färgade 1+, 2+ eller 3+ > 0% Dessa definitioner av positiva och negativa resultat är i enlighet med publicerad litteratur 24, men kan kräva modifiering i ett specifikt sammanhang. (Se avsnittet Produktspecifika begränsningar) Begränsningar Allmänna begränsningar Immunhistokemi (IHC) är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialutbildning vid val av lämpliga reagenser, vävnadsval, fixering, bearbetning, beredning av IHC-preparaten och tolkning av färgningsresultaten. Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Inkorrekt fixering, frysning, upptining, tvättning, torkning, värmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan ge artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder eller på konstitutiva oregelbundenheter inom vävnaden. Överdriven eller ofullständig kontrastfärgning kan kompromettera korrekt tolkning av resultaten. Den kliniska tolkningen av positiv färgning, eller frånvaron av densamma, måste göras inom ramen för den kliniska anamnesen, morfologin och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av all färgning, eller frånvaro av färgning, måste kompletteras med morfologiska undersökningar och korrekta kontroller, såväl som andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog som är förtrogen med antikropparna, reagenserna och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under övervakning av en patolog som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och tillförsäkra att positiva och negativa kontroller är korrekta. Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas. 25 Reagenser kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnader. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadsgrupper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenuttryck i tumörer eller andra patologiska vävnader. 22 Rapportera dokumenterade oväntade reaktioner till Dakos lokala avdelning för teknisk support. Falskt positiva resultat kan observeras på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan också orsakas av pseudoperoxidasaktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C). 21 OBS: Reagenserna och anvisningarna som medföljer detta system har utvecklats för att ge optimala resultat. Ytterligare spädning av reagenser eller ändring av inkuberingstiderna eller temperaturerna kan ge felaktiga eller motsägelsefulla resultat. Produktspecifika begränsningar Cetuximab-responsfrekvensen för EGFR-negativa patienter och patienter med EGFR-positiv färgning i mindre än en procent av tumörceller är okänd eftersom inga sådana patienter var närvarande i de kliniska läkemedelsprövningarna. Tumörer med EGFR-positiv färgning i >1 % av deras celler anses EGFR-uttryckande angående de nuvarande användningsindikationerna för cetuximab. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 8/13

Patienter med EGFR-membranfärgning i mindre än en procent av tumörceller inkluderades inte i den randomiserade prövningen med panitumumab varför aktiviteten av panitumumab är okänd i denna patientpopulation. Tumörer med EGFR-positiv färgning i >1 % av deras celler anses EGFR-uttryckande angående de nuvarande användningsindikationerna för panitumumab. Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover skall färgas inom 2 månader efter montering av vävnaden på objektglas, om de förvaras i rumstemperatur (20 25 C). 14,26 För optimala och reproducerbara resultat kräver EGFR-proteinet proteolytisk nedbrytning när vävnaderna är rutinfixerade och paraffininbäddade. Prestandaegenskaper Specificitet EGFR-antikroppen, klon 2-18C9 (2-18C9), har testats med avseende på reaktivitet mot cellinjer som uttrycker EGFR, HER2, HER3 och HER4. I Western blot av SKBR3- och A431-cellysater, kände 2-18C9 igen ett band på 170 kd, vilket stämmer överens med den kända molekylvikten för EGFR. Klon 2-18C9 har visat sig känna igen EGFRvIII-formen (145 kd) av receptorn med immunhistokemi, flödescytometri och Western blotting av EGFRvIII-transfekterade cellinjer. I Western blotting-experiment var 2-18C9 icke reaktiv med HER2-positiva CAMA- 1-cellysater, HER3-transformerade E. coli BL-21-proteinextrakt och CHO-HER4-transfekterade cellysater. CHO-transfektanter (Chinese Hamster Ovary) som uttryckte myc (vektormärkning), antingen ensamt eller tillsammans med en av HER-familjens medlemmar, odlades i kammarglas som formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med anti-myc och 2-18C9. myc-antikroppen färgade alla fem CHO-transfektanterna, medan 2-18C9 bara färgade de CHO-celler som transfekterats med HER1. Kliniska prövningar Kliniska prövningar med cetuximab Tre läkemedelsstudier med cetuximab på kolorektala carcinom (CRC) (EMD 62202-007, IMCL CP02-9923 och IMCL CP02-0141) utfördes, i vilka Dako EGFR-uttryckande immunhistokemiska (IHC) färgningstestresultat användes som ett av kriterierna för kvalificering till undersökningen. I 2 av 3 studier, inklusive den huvudsakliga studien (EMD 62202-007), sattes tröskeln för EGFR-uttryckande tumörer till 1+ av möjlig 0 till 3+ för EGFR-positiv färgningsintensitet i >1 % färgning av det totala antalet tumörceller. Denna gräns valdes därför att en undergruppsanalys av hela intervallet av olika gränser för membranfärgningskriterier och andra åtskiljande kriterier inte kunde påvisa någon signifikant skillnad i kliniska resultat. Huvudstudien med cetuximab Huvudstudien (EMD 62202-007) tillät deltagande för patienter med tumörer för vilka EGFR-positiva celler påvisades med Dako EGFR pharmdx-testet. Alla dylika tumörer som påträffades i studien hade minst 1 % EGFR-positiva celler och dessa tumörer ansågs uttrycka EGFR. Patienter med EGFR-uttryckande tumörer behandlades med cetuximab i kombination med irinotecan eller enbart med cetuximab. 577 tumörprover testades. 474/577 (82 %, 95 % CI = 78,1 %, 86,1 %) av de testade CRC-proven var EGFR-uttryckande. 329 EGFR pharmdx-patienter var tillgängliga för 2:1-randomisering till de två grenarna av den huvudsakliga läkemedelsstudien. I denna studie uppnådde patienter som fick irinotecan och cetuximab en responsfrekvens på 50/218 (22,9 %, 95 % CI = 17,5 %, 29,1 %). Patienter som fick enbart cetuximab uppnådde en responsfrekvens på 12/111 (10,8 %, 95 % CI = 5,7 %, 18,1 %). Endast patienter med Dako EGFRuttryckande tumörer, enligt ovan, mottog cetuximab-behandling. Responsfrekvensen för tumörer som inte är EGFR-uttryckande är okänd och kan därför inte jämföras. Det fanns ingen korrelation mellan graden av tumörrespons och den procentuella andelen EGFR-positiva celler eller EGFR-färgningsintensiteten. (Se Tabell 3) Tabell 3: Responsfrekvenser i den huvudsakliga Cetuximab-studien (EMD 62202-007) Totalt antal testade patienter Responsfrekvens # för fall behandlade med cetuximab och irinotecan Responsfrekvens # för fall behandlade med enbart cetuximab 12/111 (10,8 %, 95 % CI = 5,7 %, 18,1 %) EGFR pharmdx + (=1 %) 474* 50/218 (22,9%, 95 % CI = 17,5%, 29,1%) EGFR pharmdx - 103 Ingen behandlad Ingen behandlad *329 patienter var tillgängliga för 2:1-randomisering till de två grenarna i läkemedelsstudien. # Responsfrekvensen var den andel patienter i hela studiepopulationen med en minskning med =50 % av summan av de vinkelräta diametrarna för all mätbar tumör (dvs. en 50 % eller större minskning av tumörens yta) som fanns kvar i minst 28 dagar. Stödstudier med cetuximab EGFR pharmdx-analys användes för att rekrytera patienter till den huvudsakliga studien (EMD 62202-007) och en stödjande studie (IMCL CP02-0141) under utvecklingen av cetuximab. I studien IMCL CP02-0141 testades 140 prover. Av dessa prover hade 105 /140 (75 %, 95 % CI = 66,9 %, 83,1 %) tumörer som identifierades som EGFR-uttryckande. Totalt 61 patienter medverkade i denna studie; 57 patienter behandlades med cetuximab. I en ytterligare stödjande studie (IMCL CP02-9923) användes en prototyp till EGFR pharmdx-kit (sammansatt av samma primärantikropp och detektionssystem som ovan) för att rekrytera patienter. Totalt 412 prover från 401 patienter testades. 292/401 (72,8 %, 95 % CI = 68,0 %, 77,6 %) patienter hade ett positivt testresultat. 139 patienter rekryterades; 138 erhöll cetuximab och irinotecan. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 9/13

Tabell 4: Sammanfattning av procentuell andel EGFR-positivitet hos patienter med koloncancer Studie-ID Huvudstudien EMD 62202-007 Stödjande studie IMCL CP02-0141 Prototyp EGFR-studie IMCL CP 02-9923 EGFR-uttryckande förhållande (antal uttryckande/antal testade) % EGFRuttryckande 95 % konfidensintervall 474/577 82,1% 78,1 86,1% 105/140 75,0% 66,9 83,1% 292/401 72,8% 68,0 77,6% Kliniska prövningar med panitumumab Effektivitetsdata, som stöder användning av panitumumab vid behandlingen av patienter med refraktär, metastatisk kolorektal cancer (mcrc), tillhandahölls genom studier av patienter vars tumörer var EGFR-uttryckande, vilket fastställts genom Dako EGFR pharmdx analys. Randomiserad kontrollerad prövning med panitumumab Denna multicenter-, randomiserade, öppna jämförande studie av panitumumab (20020408, utvidgad följestudie 20030194) plus bästa stödvård (BSC) kontra enbart BSC, värvade mcrc-patienter som misslyckats med oxaliplatin- och irinotekaninnehållande kemoterapiregimer och vars tumörer uttryckte EGFR-membranfärgning i = 1 % av utvärderade tumörceller. I båda behandlingsgrupperna var medianprocenten av tumörceller med positiv EGFR-membranfärning 20 % (intervall: 1 % till 100 %). I studie 20020408 observerades en statistiskt signifikant förbättring av den primära slutpunkten av progressionsfri överlevnad (PFS) för panitumumab plus BSC-gruppen, jämfört med gruppen med enbart BSC (p < 0,0001, stratifierat loggranordningstest). I denna randomiserade kontrollerade prövning var responsfrekvensen 8,3 % (19/229, 95 % CI: 5,1 %, 12,6 %) och definierades som antingen en fullbordad eller partiell respons (modifierad RECIST), med en bekräftad duration på minst 4 veckor. Den motsvarande responsfrekvensen hos de 174 patienter som gick över från BSC till panitumumab i den utvidgade följestudien var 9,8 % (17/174, 95 % CI: 5.8%,15.2%). Det fanns ingen korrelation mellan behandlingseffekten på PFS och procentandelen av EGFR-tumörmembranfärgning eller EGFRfärgningsintensitet. (Se Tabell 5 nedan) Tabell 5: Behandlingseffekt på progressionsfri överlevnad genom EGFR-färgning a Studie 20020408 N-patienter/ händelser Riskförhållande a 95 % konfidensintervall för riskförhållande Alla randomiserade 463 / 401 0,54 (0,44, 0,66) <0,0001 % EGFR membranfärgning b 1-<10 % 114 / 91 0,46 (0,30, 0,71) 0,0004 10-35 % 182 / 157 0,55 (0,40, 0,76) 0,0004 >35 % 164 / 150 0,56 (0,40, 0,78) 0,0007 Maximal intensitet av EGFR-membranfärgning 1+ 138 / 113 0,61 (0,41, 0,90) 0,0140 2+ 235 / 206 0,49 (0,37, 0,65) <0,0001 3+ 88 / 80 0,61 (0,39, 0,97) 0,0379 p-värde Riskförhållanden för panitumumab plus BSC jämfört med enbart BSC uppskattas från en Cox-proportionell riskmodell som justerats för ECOG-prestandapoäng och geografiskt område. Ett värde på < 1,0 anger ett lägre genomsnittligt händelsevärde och längre tid till händelse för panitumumab plus BSC jämfört med enbart BSC. b uteslöt 3 patienter vars tumörer uttryckte < 1 % EGFR-membranfärgning (protokollöverträdelser) c uteslöt 2 patienter vars tumörer uttryckte < 1 % EGFR-membranfärgning och EGFR-membranfärgning med < 1+ maximal intensitet (protokollöverträdelser) Tabell 6: Sammanfattning av procentuell andel EGFR-uttryck hos patienter med koloncancer Huvudstudie 20020408 Studie-ID EGFR-uttryckande förhållande (antal uttryckande/antal testade) % EGFRuttryckande 95 % konfidensintervaller 735/1004 73,2 % 70,4 75,9 % Reproducerbarhet Reproducerbarhet mellan körningar Reproducerbarheten mellan körningar testades med manuella metoder vid två laboratorier av två tekniker i varje laboratorium under 3 dagar med 5 olika randomiserade och maskerade prover (4 positiva, 1 negativt i varje lab) med olika färgningsintensitetspoäng. Utmärkt reproducerbarhet (100 %) noterades för EGFR-positiva kontra EGFR-negativa resultat (0 kontra 1+, 2+ och 3+). Färgningsintensiteten (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 10/13

varierade med 1+ i två av de positiva proverna och med 2+ i ett prov (i ett av testerna tvättades det positiva vävnadselementet nästan helt bort från objektglaset). De två negativa proverna förblev negativa. Reproducerbarhet för färgning mellan laboratorier Reproducerbarheten mellan laboratorier testades vid tre geografiskt åtskilda laboratorier med 30 randomiserade och maskerade prover med olika IHC-färgningsintensitetspoäng. Färsksnittade preparat skickades till alla testlaboratorier för manuell och automatiserad färgning och bedömning av en patolog. Den procentuella överensstämmelsen mellan laboratorierna var 100 % vid en tvådelad positiv/negativ bestämning där 0 var negativt och 1+, 2+ och 3+ var positiva med avseende på EGFR-proteinuttryck för både manuella och automatiska testprocedurer. Immunreaktivitet En sammanfattning av immunoreaktiviteten hos EGFR pharmdx på den rekommenderade panelen av normala vävnader presenteras i tabell 7. Alla vävnader var formalinfixerade och paraffininbäddade. Tabell 7: Utvärdering av normal vävnadsfärgning med EGFR pharmdx* Vävnadstyp (antal testade) Binjure (2) Benmärg (3) Bröst (2) Hjärna/cerebellum (3) Hjärna/cerebrum (3) Livmoderhals (3) Tjocktarm (3) Matstrupe (2) Hjärta (3) Njure (3) Lever (3) EGFR-positiv färgning av vävnadselement och färgningsmönster Kortikala celler (2+): cytoplasma Lobulära epitelceller (2+): Membran och cytoplasma Molekylärt lager (1+) Extracellulär Basala skivepitelceller (2+): Membran Inga** Basala skivepitelceller (2+): Membran Tubuli (1+): Cytoplasmisk färgning (granulär) Hepatocyter (sinusoider) (3+); gallgångar (3+): Membran och cytoplasma Lunga (3) Alveolära yttäckande celler/ basala bronkialceller (myoepitelceller) (2+): Membran och cytoplasma Mesotelceller (3) Äggstock (3) Bukspottkörtel (3) Bisköldkörtel (1) Perifer nerv (3) Hypofys (3) Prostata (3) Spottkörtel (3) Skelettmuskel (3) Hud (3) Tunntarm (3) Mjälte (3) Mage (3) Testikel (3) Tymus (3) Sköldkörtel (3) Tonsill (3) Livmoder (3) Mesotelceller (2+): Membran och cytoplasma Gångar (2+): Membran Nervcellsutskott (1+): Fibröst Glandulära epitelceller (2+): Membran Element från gångar (1+): cytoplasma Skvamösa celler, bihangsstrukturer (2+): Membran och cytoplasma Skivepitel (3+): Membran och cytoplasma Endometriets körtelepitel (2+): Membran och cytoplasma Endometriets stromaceller (2+): Membran och cytoplasma Myometrium: *Majoriteten av de testade vävnaderna hade färgning av fibroblaster i stromavävnad (1+, fibröst) liksom också perineurium och myoepitelceller. Endogen peroxidas-inducerad färgning av eosinofiler har observerats undantagsvis. **Variabel immunfärgning av normalt kolonepitel har observerats. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 11/13

Felsökning Tabell 8: Felsökning Problem Trolig orsak Föreslagen åtgärd 1. Ingen färgning av objektglasen. 2. Svag färgning av objektglas. 3. Alltför kraftig bakgrundsfärgning av objektglas. 4. Vävnad lossnar från objektglasen. 5. Alltför stark specifik färgning 6. Svag färgning av cellinjen på kontrollpreparat 2+. 7. Övernedbrytning av vävnad. 1a. Programmeringsfel. Reagenserna har inte använts i korrekt ordning. 1b. Reagensflaskorna är inte laddade på rätt plats i reagenskarusellen. 1a. Kontrollera programnätet för att verifiera att färgningskörningen programmerades korrekt. 1b. Kontrollera reagenskartan för att verifiera lämpligt läge för reagensflaskorna. 1c. Otillräckligt reagens i reagensflaskan. 1c. Tillförsäkra att tillräckligt med reagens är laddat i reagensflaskorna före körningen. Se reagenskartan för erfordrade volymer. 1d. Natriumazid i tvättbuffertbadet. 1d. Använd färsk azidfri tvättbuffert som medföljer kitet. 2a. Otillräckliga reagensinkubationstider 2a. Gå igenom anvisningarna för färgningsproceduren. 2b. Olämplig fixeringsmetod har använts. 2b. Kontrollera att patientvävnad inte överfixerats och att ett godkänt fixativ använts. (Se avsnittet om provberedning). 2c. Överinkubering med proteinas K. 2c. Kontrollera att proteinas K-lösningen inte inkuberas längre än 5 minuter. 3a. Paraffinet har inte avlägsnats fullständigt. 3b. Stärkelsetillsatser använda vid montering av objektglasen. 3c. Objektglasen har inte sköljts ordentligt. 3d. Snitten torkade under färgningsproceduren. 3e. Objektglasen torkade under laddning av Autostainer. 3f. Icke-specifik bindning av reagenser till vävnadssnitt. 3a. Använd färsk rengöringslösning och följ den procedur som beskrivs i avsnittet om deparaffinering och rehydrering. 3b. Undvik att använda några tillsatser för att få snitten att fastna på objektglasen. Många av dessa är immunreaktiva. 3c. Kontrollera att Autostainer är ordentligt flödad före körningen. Kontrollera och tillförsäkra att det finns tillräckligt med buffert för hela körningen. Ytterligare sköljning kan göras efter visualiseringssteget om så önskas. 3d. Verifiera att lämplig reagensvolym appliceras på objektglasen. Se till att Autostainer körs med huven i stängt läge och att den inte utsätts för alltför hög värme eller drag. 3e. Se till att objektglasen hålls våta med buffert under laddningen och innan körningen börjar. 3f. Kontrollera att proverna är riktigt fixerade och/eller att ingen nekros förekommer. 4a. Fel slags objektglas används. 4a. Använd laddade (Fishers SuperFrost Plus) eller silaniserade objektglas, t.ex. Dakos Silanized Slides (kod S3003). 5a. Olämplig fixeringsmetod har använts. 5a. Se till att bara godkända fixativ och fixeringsmetoder används. (Se avsnittet om provberedning). 5b. Reagensinkuberingstiderna alltför långa. 5b. Gå igenom anvisningarna för färgningsprotokollet. 5c. Olämplig tvättlösning har använts. 5c. Använd bara den spädda tvättbuffert som ingår i kitet. 6a. Otillräcklig proteolytisk nedbrytning med proteinas K. 6a. Kontrollera att Proteinase K lösningen är programmerad för en 5-minuters inkuberingstid. 6b. Otillräckliga reagensinkubationstider 6b. Kontrollera att inkuberingstiderna är riktiga i programmeringskörningen. 6c. Försämring av kontrollpreparat. 6c. Kontrollera satsens utgångsdatum och förvaringsförhållanden som finns angivna på förpackningens etikett. 7a. Överinkubering med proteinas K. 7a. Kontrollera att proteinas K-lösningen inte inkuberas längre än 5 minuter. 7b. Otillräcklig fixering. 7b. Använd efterfixeringsproceduren i färgningsprotokollet på nya objektglas och färga med normal procedur. OBS: Se också felsökningsavsnittet i Dako-handboken: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition, 16 the Atlas of Immunohistology 23 eller Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 20 Rapportera ovanlig färgning till Dakos avdelning för teknisk support. (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 12/13

Referenser 1. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990; 265:7709 2. Riese DJ, Stern DF. Specificity within the EGF family/erbb receptor family signaling network. Bioessays 1998; 20:41 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230:1132 4. Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, Saito T, Toyoshima K. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319:230 5. Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, Ullrich A, Coussens L. The neu gene: An erbbhomologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229:976 6. Gusterson B, Cowley G, Smith JA, Ozanne B. Cellular localization of human epidermal growth factor receptor. Cell Biol Intl Rpts 1984; 8(8):649 7. Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancers. Br Med Bull 1991; 47(1):87 8. Sainsbury JRC, Farndon JR, Sherbet GV, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptors and oestrogen receptors in human breast cancer. Lancet 1985; 1(8425):364 9. Ozanne B, Richards CS, Hendler F, Burns D, Gusterson B. Over-expression of the EGF receptor is a hallmark of squamous cell carcinomas. J Pathol 1986; 149:9 10. Werner MH, Nanney LB, Stoscheck CM, King LE. Localization of immunoreactive epidermal growth factor receptors in human nervous system. J Histochem Cytochem 1988; 36:81 11.Pii K, Andersen FG, Jensen S, Spaulding B. Characterization of a new monoclonal antibody, clone 2-18C9, for the measurement of Epidermal Growth Factor Receptor expression in solid tumors. Am Assoc Canc Res 95 th annual meeting, Abst #5029 Orlando, Fl Mar 27 31 2004 12. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 13. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 14. Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS and Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffinembedded tumor tissues: Variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52:893. 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001 17. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 18. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved guideline. Villanova, PA 2001. Order code M29-A2 19. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A. 20. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 21. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 22. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 23. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immuno-histology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16 24. Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on Cancer Stage IV colon adenocarcinoma: implications for a standardized scoring system. Cancer 2001; 92:1331 25. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 26. Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: Potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 (127455-001) P04036SE_01/K1494/2015.05 s. 13/13