Metodjämförelse mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec för U-albumin, U-IgG, U-kappa och U- lambda

Institutionen för naturvetenskap Examensarbete Metodjämförelse mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec för U-albumin, U-IgG, U-kappa och U- lambda Mohamed Al-Hadad Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2010:BL5

Metodjämförelse mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec för U-albumin, U-IgG, U- kappa och U-lambda Mohamed Al-Hadad Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Handledare: Med dr, leg läkare Ingvar Rydén Universitetslektor, Anki Koch-Schmidt Avd för klinisk kemi Länssjukhuset Kalmar 391 85 Kalmar Institutionen för naturvetenskap Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar Examinator: Universitetslektor, Maria Mattsson Institutionen för naturvetenskap Linnéuniversitetet 391 82 Kalmar Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng Sammanfattning Njurarna är ett organsystem med viktiga funktioner som exempelvis utsöndring av flertalet vattenlösliga substanser. För att sjukdomssymtom ska uppträda krävs mer än tre fjärdedelars bortfall av njurfunktionen, eftersom njurarna har en enorm reservkapacitet. Genom att analysera bland annat proteinerna albumin, immunoglobulin G, kappa och lambda i urin utreds om njurfunktionen fungerar som den ska. Analys av dessa proteiner kan ske med analysinstrumenten IMMAGE 800 från Beckman Coulter och BN ProSpec från DADE BEHRING. Båda dessa analysinstrument använder sig av metoden nefelometri, som är en metod där ljusspridning i en vätska eller gas kan mätas. Syftet med föreliggande studie var att analysera urinprover på både IMMAGE 800 och BN ProSpec och sedan jämföra resultaten. Under denna studie kalibrerades standardkurvor, genomfördes kvalitetskontroller och 37 prov analyserades. Samma prov analyserades flera gånger, både under samma dag och vid ett antal kommande dagar för att erhålla precisionen. Korrelationskoefficienten blev 0,999 för U-albumin; 0,998 för U-IgG; 0,947 för U-kappa och 0,883 för U-lambda. ProSpec kan således användas vid analys av U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda då den uppfyller EQUALIS kvalitetsmål.

Abstract The kidneys are an important organ system, which has several vital functions such as excretion of water-soluble substances. The kidneys have a tremendous reserve capacity, which leads to that more than ¾ loss of kidney functions can disappear before any symptoms of kidney disease arise. The kidneys function can be determined by analysing the proteins albumin, immunoglobulin G, kappa and lambda. These proteins can be analysed with the instruments IMMAGE 800 from Beckman Coulter and BN ProSpec from Dade Behring. Both instruments are based on nephelometry, which analyse the scattered (reflected) light into a detector from suspended particles in a liquid or a gas. The aim of this study was to analyse 37 urine samples on IMMAGE 800 and BN ProSpec and thereafter compare the obtained results from the different instruments. In this study standard curves were calibrated, quality controls performed and 37 urine samples analysed. The precision of different methods were obtained by analysing the same samples several times, both within the same day and during several days. The correlation coefficient was 0,999 for U-albumin; 0,998 for U-IgG; 0,947 for U-kappa, and 0,883 for U-lambda. Thus, BN ProSpec is an instrument that can be used for analysis of U- albumin, U-IgG, U-kappa and U-lambda as it fulfils the goals of EQUALIS (External quality assurance in laboratory medicine in Sweden).

Innehållsförteckning INTRODUKTION...1 Blodproteiner som analyseras i urin...2 Albumin... 2 Immunoglobuliner... 3 Immunoglobulinernas L-kedjor - kappa respektive lambda... 4 Antigen-antikroppskomplex och immunoprecipitat...5 Metoder för kvantitativ analys av specifika proteiner i kroppsvätskor...6 IMMAGE 800... 6 BN ProSpec... 8 Proteinreferenspreparat för kalibrering... 8 Kvalitetssäkring av analysen... 10 Statistik... 10 Syftet med föreliggande arbete...10 MATERIAL OCH METODER...11 Analys av kvalitetskontroll med IMMAGE 800...11 Analys av prov med IMMAGE 800...11 Kalibrering av standardkurvor för IgG, albumin, kappa och lambda med BN ProSpec...11 Analys av kvalitetskontroll med BN ProSpec...12 Analys av prov med BN ProSpec...12 Precision på BN ProSpec...13 Normalvärden...13 Statistik...13 Etiska aspekter...13 RESULTAT...14 Kalibrering BN ProSpec...14 Kvalitetskontroll...14 IMMAGE 800... 14 BN ProSpec... 14 Analys av Prov...14 IMMAGE 800... 14 BN ProSpec... 14 Metodjämförelse...15 BN ProSpec Precision...17 DISKUSSION...18 Slutsats...20 Bilaga 1... I Bilaga 2... II Bilaga 3...III Bilaga 4... IV Bilaga 5... V Bilaga 6... VI Bilaga 7... VII Bilaga 8... VIII Bilaga 9... IX Bilaga 10... X Bilaga 11... XI Bilaga 12... XII Bilaga 13... XIII

INTRODUKTION Njurarna fyller tre centrala funktioner utsöndrar vattenlösliga substanser som skall avlägsnas ur blodet, syntetiserar vissa hormoner samt reglerar kroppsvätskans volym, syra-basbalans samt osmolalitet. När ett symtom på sjukdom i njuren uppträder har mer än ¾ av njurfunktionen bortfallit, eftersom njurarna har en enorm reservkapacitet (1). Varje njure innehåller ca en miljon s.k. nefron, figur 1, i vilka reningen av blodet sker. Njurarna har därför en riklig blodförsörjning och när blodet når njurarna går det genom kapillärslyngor in i Bowmans kapsel och tillsammans bildar de glomerulus, som fungerar som ett högtrycksfilter. Detta filter består av tre lager, kapillärendotelet, det negativt laddade basalmembranet samt kapselepitelet. Filtret är tätt och proteiner med molekylmassa över 50 kda samt blodkroppar kan normalt inte penetrera detta, medan proteiner med molekylmassa under 15 kda kan lätt komma igenom. När det gäller proteiner som har en molekylmassa mellan 15 kda och 50 kda bestäms transporten genom glomeruli av laddning, storlek samt vilken form molekylen besitter. Proteiner är oftast negativt laddade och repelleras av den negativa laddningen i filtret (1). Figur 1. Nefronet utgör njurens reningsenhet. Från kapillärslyngorna, som går in i Bowmans kapsel, kommer ultrafiltratet, primärurinen, till proximala tubulus, där ett stort antal lösta ämnen resorberas till blodet. I efterföljande Henles nedåtgående och därefter uppåtgående slynga koncentreras urinen ytterligare för att sedan samlas i distala tubuli och därefter i s.k. uppsamlingskärl. Modifierad från Widmaier Eric P., Herschel Raff, Strang Kevin T. Vander s Human Physiology, The mechanisms of Body function (2008), 11 th edition, McGrew-Hill Publishing Company, New York. 1

Ultrafiltratet, det vill säga det filtrat som bildas vid filtrationen av blod igenom glomeruli, liknar blodet i sin sammansättning förutom att det är nästan helt fritt från proteiner och blodkroppar. De små mängder protein, som kan komma igenom glomeruli, reabsorberas normalt i proximala tubulus. Proximala tubuli har en stor förmåga att reabsorbera speciellt aminosyror och små peptider, vilka nästan reabsorberas fullständigt. Även polypeptider reabsorberas och större proteiner tas upp med endocytos för enzymatisk nedbrytning, s.k. proteolys, i tubulis lysosomer (1). Vid en del sjukdomar, ex. diabetes mellitus, kan basalmembranets täthet för proteiner och blodkroppar sänkas, vilket kan orsaka proteinuri (en ökad koncentration av protein i urinen) men även hematuri (blod i urinen) (1). Vid kraftig proteinuri (mer än 3,5 g protein/dygn i urinen) kan ödem (svullnad på grund av ansamling av vätska i vävnaderna), hyperlipidemi (onormala nivåer av lipider i blodet) och hypoalbuminemi (sänkt nivå albumin i blodet) uppstå. Detta tillstånd benämns nefrotiskt syndrom. Normalt utsöndras under ett dygn cirka 25 mg albumin i urinen, men när det skett skador på glomeruli kan den glomerulära permeabiliteten öka och ge upphov till s.k. glomerulär proteinuri. Den glomerulära permeabiliteten ökar vid till exempel glomerulonefrit och diabetes mellitus och då passerar även större proteiner ut i urinen (1). Glomerulär proteinuri kan delas in i två grupper, selektiv- respektive oselektiv glomerulär proteinuri. Vid selektiv glomerulär proteinuri återfinns i urinen plasmaproteiner med molekylmassa under 100 kda och dessa plasmaproteiner domineras av albumin, orosmucoid och transferrin. Vid oselektiv glomerulär proteinuri liknar proteinsammansättningen plasmans och även medelstora proteiner som immunglobulin G har passerat genom glomeruli ut i urinen (2). Lågmolekylära proteiner passerar, som ovan angivits, normalt glomeruli och läcker ut i primärurinen men ska sedan reabsorberas i stor utsträckning i tubuli som är ett rörsystem i njurarna. Vid metallförgiftning kan en skada i tubuli uppstå, vilket medför att reabsorptionen av primärurinens lågmolekylära proteiner blir nedsatt. Detta leder till tubulär proteinuri, dvs. att koncentrationen av lågmolekylära proteiner i urinen ökar. För att få ett mått på tubulär proteinuri kan immunoglobuliners lätta kedjor, kappa respektive lambda med molekylmassa omkring 25kDa, analyseras (2,3). Blodproteiner som analyseras i urin Albumin Albumin är det mest förekommande proteinet i blodet. Albumin syntetiseras i levern. Det innehåller inga sockermolekyler och är således inget glykoprotein som de flesta andra proteiner i blodet är. Molekylvikten hos albumin är cirka 66 kda och dess halveringstid är 3 veckor (3). Som viktigaste funktion har albumin att upprätthålla det kolloidosmotiska trycket som har betydelse för reglering av vätskeutbytet mellan plasma och extracellulära vätskor. En annan viktig funktion hos albumin är att transportera lipofila substanser, som sköldkörtelhormoner och steroidhormoner samt fettsyror. Även lipofila läkemedel binder till albumin, vilket vanligen leder till att den fria halten av dessa läkemedel i blodet blir mycket låg, oftast runt 2 % (3). 2

Om leverns förmåga att bilda proteiner blir nedsatt, kommer det att bli alltför låga halter albumin i blodet, vilket leder till för lågt kolloidosmotiskt tryck. Detta händer vid undernäring. När kolloidosmotiska trycket blir lågt kommer mängden vätska i vävnaderna att öka och ett så kallat ödem uppstår. Detta kan leda till en svullen mage och om albuminbristen beror på undernäring kallas tillståndet för kwashiorkor, vilket är ett vanligt tillstånd i utvecklingsländer. Albuminbrist kan även fås genom till exempel leverskador på grund av förgiftning, njurskador, tumörer i levern, brännskador eller svåra infektioner (1). När albumin läcker ut i urinen på grund av njurskador är beteckningen albuminuri. Är läckaget i urinen litet, 30-300 mg albumin/dygn, är beteckningen mikroalbuminuri. Genom att analysera Urin-albumin (U-albumin) kan ett värde på albumin i urinen erhållas och jämföras mot ett referensintervall för att undersöka om albuminvärdet är normalt (< 30 mg/dygn). Ökad sekretion av albumin i urin indikerar vaskulära och renala komplikationer, vilka kan orsakas av diabetes mellitus (4, 5). Immunoglobuliner Immunoglobuliner, antikroppar, bildas som en humoral immunrespons av plasmaceller vid immunsystemets kontakt med främmande ämnen, s.k. antigener (6). Immunoglobulinerna återfinns lösliga i intercellulära vätskor och sekret men även bundna till cellmembranet hos B-lymfocyter. Som funktion blockerar immunoglobulinerna patogena organismer och förhindrar därmed att de invaderar celler eller binder till extracellulär vävnad. Vidare binder och oskadliggör de patogena organismers toxiska produkter (6). Hos människa förekommer olika immunoglobulinklasser, IgG, IgA, IgM, IgE och IgD. Grundstrukturen hos de olika klasserna är densamma och består av två tunga polypeptidkedjor, H-kedjor, med molekylmassan 50-70 kda och två lätta polypeptidkedjor, L-kedjor, med molekylmassan 23 kda, figur 2. De tunga och de lätta polypeptidkedjorna hålls samman genom disulfidbryggor och icke kovalenta bindningar till en tetramer struktur med molekylmassa omkring 150-200 kda, figur 2. De N- terminala domänerna hos H-kedjan bildar tillsammans med L-kedjan antikroppens antigenbindande del, F ab. Resterande delar av H-kedjorna skapar tillsammans F c -delen, som svarar för bland annat komplementaktivering, sekretutsöndring och placentapassage (7). H-kedja L-kedja Ag-bind. del F ab Fc Hingeregion Figur 2. Generell struktur på ett immunoglobulin (antikropp). Modifierad från Laurells klinisk kemi (1). 3

Immunoglobulin G, IgG, återfinns i fyra olika subklasser, IgG1, IgG2, IgG3 och IgG4. Skillnaden mellan dessa subenheter beror på olikheter i den tunga kedjans så kallade hinge-region, figur 2 (8). IgG-molekyler finns i kroppsvätskor och bildar där både lösliga och olösliga komplex med antigen. Om det bildas lösliga eller olösliga komplex beror på antigenmängd, antigenstorlek och antikroppens bindningsstyrka. Eftersom samtliga IgG subklasser, förutom IgG4, aktiverar och binder komplementfaktorer, kan såväl olösliga som lösliga komplex vanligen snabbt elimineras (7). Brist på IgG1 ger ett generellt försämrat immunförsvar och återkommande infektioner. IgG1-brist ses oftast i kombination med IgG2- och IgG3-brist. Vid IgG2-brist eller låga värden på IgG2 blir infektionsbenägenheten ökad, framförallt när det gäller luftvägsinfektioner. Även IgG3-brist har förknippats med ökad frekvens av luftvägsinfektioner. Selektiv IgG4-brist anses inte ha någon säker klinisk relevans men medför ofta återkommande luftvägsinfektioner då IgG4-bristen är kombinerad med IgG2- brist (8). Förhöjda eller sänkta nivåer av IgG-subklasser har på ett eller annat sätt förknippats med ett stort antal kroniska sjukdomar, men sambanden är ofta komplexa och påverkas av andra immunologiska faktorer och därför måste tolkningen av IgGsubklasskoncentrationerna vägas mot andra laboratorieresultat och den kliniska bilden (8). Immunoglobulinernas L-kedjor - kappa respektive lambda Det finns två typer av konstanta delar (C-region) och därmed två typer av lätta kedjor, κ- (kappa) respektive λ- (lambda) kedjor. Dessa två kedjor analyseras som ett mått på så kallad tubulär proteinuri men även vid plasmacellsjukdom, till exempel multipelt myelom (1). κ- respektive λ- kedjornas koncentration i blodet bestäms av koncentrationerna av de intakta immunoglobulinmolekylerna, normalt av IgA-, IgG och IgM- koncentrationerna. De lätta kedjorna utgör cirka en tredjedel av hela immunoglobulinmolekylen. Avvikelser från detta förhållande uppstår då lätta kedjor produceras i överskott och sedan återfinns i serum. Vid antikroppsbildning mot ett antigen aktiveras vanligen flera B-celler och sk polyklonala antikroppar, innehållande κ alternativt λ som L-kedja, bildas mot detta antigen. Vid en polyklonal proliferation är förhållandet mellan κ och λ ungefär 2:1. Monoklonal proliferation innebär att en specifik B-cellklon prolifererar och ger upphov till en sk monoklonal antikropp mot antigenet. Dessa monoklonala antikroppar uppvisar bara en typ av lätt kedja, antingen κ eller λ. Kvoten κ/λ förändras således vid ökad produktion av monoklonala immunoglobuliner eller om fria monoklonala lätta kedjor bildas i överskott. En κ/λ kvot utanför referensintervallet (1,35-2,65) indikerar på existens av en monoklonal gammopati (9-11). Kompletta immunoglobulinmolekyler kan normalt inte passera den glomerulära filtreringsbarriären, medan fria lätta immunoglobulinkedjor filtreras genom glomeruli men reabsorberas sedan i tubuli (12). Vid tubulär proteinuri är dock koncentrationen av polyklonala fria lätta kedjor ökad (1). Vid plasmacellsjukdom, exempelvis multipelt myelom, analyseras monoklonala fria lätta kedjor, sk. Bence Jones proteiner, som då har ökat i koncentration. Närvaro av 4

monoklonala lätta kedjor i urinen, med eller utan M-komponent (en specifik monoklonal antikropp) i plasma, talar ofta för myelomdiagnos medan förekomsten av en M- komponent utan närvaro av monoklonala lätta kedjor i urinen mer talar för en benign sjukdom, MGUS (Monoclonal gammopathy with unknown significance). Vid myelom har den monoklonala lätta kedjan syntetiserats i överskott i förhållande till den monoklonala tunga kedjan och överskottet av den lätta kedjan kommer då att utsöndras i urinen med indikationen Bence Jones proteinuri. Påvisandet av kappa- och lambdakedjor i urin är således viktigt och kan utnyttjas för såväl diagnostiska ändamål som för uppföljning av sjukdomsförlopp (1). Antigen-antikroppskomplex och immunoprecipitat Vid en viss mängd antikroppar tillsätts successivt antigen, vilket gör att det först bildas lösliga antigen-antikroppskomplex, figur 3a, (15). Dock, när antigenkoncentrationen motsvarar antikroppskoncentrationen, dvs. den s.k. ekvivalenspunkten uppnås, börjar lösligheten minskas och s.k. immunoprecipitat uppträder, eftersom komplexen binds till stora aggregat, figur 3b. Blir antigenkoncentrationen högre än antikroppskoncentrationen erhålls på motsvarande sätt lösliga komplex, figur 3c. a b c Figur 3. Reaktion mellan antigen (Ag, gråfärgat) och antikropp (Ab). a. Vid antikroppsöverskott bildas lösliga Ag-Ab-komplex. b. När koncentrationen Ag=Ab nås den s.k. ekvivalenspunkten och immunprecipitat bildas. c. Om koncentrationen Ag>>Ab erhålls åter lösliga komplex. Tillstånd att publiceras från Dade Behring (15). 5

Ag-Ab-komplexprecipitat Ljusspridning Heidelberger-Kendall-kurvan beskriver hur lösligheten av antigen-antikroppskomplexen varierar med antigenkoncentrationen vid konstant antikroppskoncentration, figur 4. Antigenkoncentration Figur 4. Heidelberger-Kendall-kurva som anger mängden immunoprecipitat mot antigenkoncentrationen. Punkt (1) och (2) ger samma mätsignal. Tillstånd att publiceras från Dade Behring (15). Metoder för kvantitativ analys av specifika proteiner i kroppsvätskor IMMAGE 800 IMMAGE 800 (Beckman Coulter) är ett analysinstrument som nyttjas för kvantitativ bestämning av proteiner i exempelvis en kroppsvätska. Det nyttjar två mätprinciper, ratenefelometri respektive turbidometri med Near Infrared Particle Immunoassay (NIPIA) vid 940 nm. Den vanligaste av dessa två mätprinciper är rate-nefelometri (13). Nefelometri mäter den ljusspridning partiklar i en vätska eller gas orsakar. Ljuset sprids olika beroende på partiklarnas storlek, form och antal. Partikelkoncentrationen beräknas sedan med formeln c = k * I s /I, där k är en konstant, I s det spridda ljusets intensitet och I det inkommande ljusets intensitet (14). Vid rate-nefelometri mäts ljusintensitetens ökning under en viss tid från det ljus som sprids av suspenderade partiklar i en vätska i en kyvett. Ljuskällan är en laser med våglängden 670 nm och detektorn är placerad i 90 vinkel mot laserstrålen för mätning av ljusspridningen (13). Vid turbidometrisk mätning med NIPIA mäts istället minskningen av ljusintensiteten vid ljusstrålens passage genom en lösning innehållande ljusspridande partiklar i en kyvett. Ljuskällan är en ljusemitterande diod och mätningen med turbidimetri görs vid 0 vinkel från ljuskällan (13). 6

Rate-nefelometri och NIPIA mäter bildningen av partiklar i form av immunoprecipitationskomplex, dvs. antigen-antikroppskomplex. Vid rate-nefelometri kommer spridningen av ljus vid 90 att öka när komplexen bildas medan spridningen av ljus vid 0 vid NIPIA kommer att minska när komplexen bildas, figur 5 (13). Figur 5. Spridning av ljus då antigen-anikroppkomplex bildas (Mohamed Al-Hadad). Systemet i IMMAGE 800 utför antigenöverskottstest genom att applicera ytterligare antigen, bestående av humant serum, till den avslutade antigen-antikroppreaktionen. Om det finns obundna antikroppar kvar i reaktionen (överskott av antikroppar) kommer värdet att öka efter appliceringen av ytterligare antigen (ytterligare antigenantikroppskomplex bildas). Detta kan ses i ett diagram, där kurvan som sjunker efter att reaktionen är klar, kommer att stiga åter igen, figur 6. Om detta sker kommer IMMAGE 800 att använda värdet som erhölls då reaktionen tog slut innan antigenöverskottstestet och systemet kommer att räkna ut den slutliga partikelkoncentrationen. Om det inte skulle finnas några obundna antikroppar kvar efter avslutad reaktion kommer kurvan att sjunka när ytterligare antigen tillsätts, se streckad linje i figur 6. Instrumentet kommer då att späda provet ytterligare till nästa högre spädning och analysera provet åter tills kurvan kan stiger vid tillsats av ytterligare antigen efter avslutad reaktion. Detta gör instrumentet för att värdet på albumin, IgG och kappa inte ska vara falskt för lågt (13). Figur 6. Ljusintensitetens förändring mot reaktionstiden. 1. X= reaktionstiden (i sekunder) 2. Y= Ljusintensiteten 3. Responsen om fria antikroppar finns kvar vid antigenöverskottstestet (antikroppsöverskott) 4. Responsen om fria antikroppar inte finns kvar vid antigenöverskottstest (antigenöverskott). Tillstånd att publiceras från Beckman Coulter (13). 7

När det gäller analys av lambda har i föreliggande arbete antiserum från leverantören Dako nyttjats, eftersom detta antiserum anses vara bättre än det som erhålls från Beckman Coulter. För att kunna använda antiserum från en annan leverantör än Beckman Coulter läggs analysen in med en så kallad UDR (User Defined Reagent) metod. När UDR metod används, sker inget antigenöverskottstest och ingen automatisk spädning. En kalibrator används för att kalibrera en standardkurva genom att kalibratorn späds så att ett lägsta och ett högsta värde fås. Är resultatet på ett visst prov mer än högsta värdet i standardkurvan får provet spädas manuellt, eftersom kurvan planar ut efter högsta standardvärdet och ett falskt för lågt resultat kan annars fås (13). BN ProSpec BN ProSpec är ett alternativt analysinstrument för kvantitativ bestämning av plasmaproteiner i plasma, serum, urin och spinalvätska. Proteinkoncentrationerna bestäms med hjälp av kvantitativa utvärderingar av en immunokemisk reaktion (15). Nefelometri är mätprincipen som BN ProSpec använder sig av och det är också den vanligaste mätprincipen för immunokemisk bestämning av proteiner i urin, serum och andra kroppsvätskor. När ett prov innehållande antigen motsvarande antiserum appliceras i en kyvett innehållande specifika antikroppar bildas antigen-antikroppskomplex. Med nefelometri mäts ljus som sprids av antigen-antikroppskomplexet. En ljusstråle genereras av en laserdiod (840 nm ± 10nm) och skickas genom kyvetten, varvid ljusstrålen sprids av de existerande antigen-antikroppskomplexen. Ljusets mäts med en vinkel på 13-24 med en hybriddiod (detektor), medan ljus, som inte sprids, filtreras bort (15). Den uppmätta spridningens intensitet är vid antikroppsöverskott proportionell mot antalet antigen-antikroppskomplex i provet. Signalen är, vid konstant antikroppsnivå, proportionell mot antigennivån. Med hjälp av referenser med kända antigennivåer skapas en standardkurva och utifrån denna kan signalen från ljusspridningen läsas som antigenkoncentration (15). Vid antigenöverskott kan ett falskt för lågt värde erhållas, men BN ProSpec undviker detta genom att den utför en förreaktion på analysen. En del av provet kommer då att få reagera med reagenset. Om tröskelvärdet för antigenet inte överskrids under förreaktionen, portioneras den normala mängden prov och mätningen kan utföras. Om tröskeln däremot överskrids upprepas mätningen automatiskt vid nästa spädning om automatisk mätupprepning är inställd. En förreaktion utförs även för den nya spädningen och om tröskeln överskrids upprepas mätningen automatiskt vid nästa spädning. Denna process upprepas tills resultaten från förreaktionen ligger under den angivna tröskeln eller tills systemet når gränsen för tillåtna spädningar. Spädningarna som kan göras automatiskt görs i multipla spädningssteg (1:5, 1:20, 1:100, 1:400, 1:2000, 1:8000, 1:32000). Proven kan även förspädas manuellt (1:5, 1:20) och måste matas in i programvaran eftersom hänsyn till förspädningen kommer att tas när provet analyseras. Resultaten behöver då inte konverteras i efterhand då det räknas automatiskt (15). Proteinreferenspreparat för kalibrering Vid kvantitativa utvärderingar av immunonefelometriska mätningar krävs en referenskurva för varje proteinanalys. Standardkurvan erhålls med hjälp av standarder genom multipel punktkalibrering. Eftersom förhållandet mellan mätsignalen och 8

proteinkoncentrationen inte är proportionell, måste flera spädningar av en standard med känd antigenkoncentration utföras och analyseras. Referenskurvan beräknas sedan genom att anpassa den teoretiska kurvan till de uppmätta stödpunkterna. Prov med okänd antigenkoncentration kommer vid analys att få en mätsignal som jämförs med signalerna från standardspädningarna och antigenkoncentrationen avläses därefter från referenskurvan (15). Certified Reference Material 470 (CRM 470) är ett referensmaterial som är avsett för användning till preparation av kalibratorer och kontroller som används i kvantitativa bestämningar av serumproteiner, bland annat IgG och albumin. CRM 470 är ett internationellt referensmaterial som presenterades i juli 1993 av The European Bureau Communitaire de Réference (BCR) och College of the AmericanPathologists (CAP). De tio åren dessförinnan fanns det för serumproteiner ett stort antal olika referensmaterial, som hade använts runt om i världen. Dessa olika referensmaterial hade gett upphov till värden som kunde variera från 50 upp till 100% och lösningen till detta var att preparera ett enda internationellt referensmaterial. Det nya referensmaterialet skulle vara lämpat till modernare tekniker som bland annat nefelometri. Redan 1989 började The IFCC Committee on Plasma Protein Standardization arbetet med insamling, bearbetning, karakterisering och kalibrering av ett nytt referensmaterial för immunokemiska mätningar av 14 serumproteiner(16, 17). N Protein Standard SL är en lösning som används vid kalibrering av bland annat albumin, IgG, kappa och lambda. Denna lösning består av stabiliserat humant serum med tillsatser av IgE, ferritin och β2-microglobulin. Dessa tillsatser har ett mänskligt ursprung och kommer från serum med myelom (IgE), placenta (ferritin) och urin (β2-microglobulin). Koncentrationerna av plasmaproteinerna IgG och albumin har kalibrerats och jämförts mot CRM 470 (18). De lätta immunoglobulinkedjornas koncentration av standarden har beräknats genom att koncentrationen av immunoglobulinet multiplicerats med en speciell faktor beroende på vilket immunoglobulin det är (se tabell 1). Koncentrationen av de enskilda lätta immunoglobulinkedjorna, kappa respektive lambda, bestäms genom att det är ett speciellt förhållande mellan dessa beroende på vilket immunoglobulin som analyserats, tabell I (10). Tabell I. Förhållanden hos olika immunoglobuliner mellan lätta kedjans massa och hela antikroppsmolekylens samt mellan de lätta kedjorna. Dessa faktorer används vid beräkning av koncentrationen av kappa och lambda. Immunoglobulin Förhållandet mellan lätta kedjans massa och totala immunoglobulinmassan IgG 1 0,305 2,4 IgG 2 0,305 1,1 IgG 3 0,279 1,4 IgG 4 0,305 8,0 IgA 1 0,290 1,4 IgA 2 0,305 1,6 IgM 0,256 3,2 Förhållandet mellan kappa och lambda 9

Kvalitetssäkring av analysen Resultat från patientnära analyser ligger till grund för flertalet medicinska beslut. Det är därför viktigt med kvalitetssäkring av dessa analyser. Kvalitetssäkring omfattar bland annat granskning av hela processen från beställning av analys till resultatpresentation i patientjournalsystemet, lämpliga beskrivningar för hur analysen ska utföras, utbildning av personal, interna kontroller som analyseras dagligen, där resultat på dessa ska ligga inom ett förutbestämt intervall, och även externa kontroller. Externa kontroller skickas från EQUALIS (nationell kvalitetssäkringsorganisation), analyseras 10 gånger/år och innehåller substans med okänd halt. Med externa kontroller undersöks hur analysinstrumentet fungerar i jämförelse med andra analysinstrument (19). Statistik Medelvärdet är det genomsnittliga värdet och fås genom att summan av de enskilda mätvärdena divideras med antalet mätningar. Enheten är densamma som mätvärdenas enhet (20). Standardavvikelsen (S) är ett statistiskt mått på spridningen av värdena kring medelvärdet. Standardavvikelsen beräknas genom att summera kvadraterna på de individuella avvikelserna från medelvärdet, dividera med antal frihetsgrader (antal mätningar 1) och dra roten ur uttrycket. Enheten är densamma som mätvärdenas enhet (20). Variationskoefficienten (CV, coefficient of variation) uttrycker standardavvikelsen som procentandelar av medelvärdet och är en normaliserad standardavvikelse. CV gör alltså standardavvikelser på olika skalor jämförbara. CV räknas ut genom att dividera standardavvikelsen med medelvärdet och sedan multiplicera med 100 för att få svaret i procent. Enheten för CV är % (20). Precision är ett mått på reproducerbarheten, det vill säga att upprepade mätningar utförs på samma sätt för att undersöka hur nära resultaten ligger. Ett analysinstrument med en bra precision ger en liten avvikelse från medelvärdet (20). Korrelation är ett begrepp inom statistik som anger sambandet mellan två variabler, ex. två metoder. Korrelationen uttrycks som ett värde mellan 1 och -1, där 1 anger maximalt positivt samband, 0 anger inget samband och -1 anger maximalt negativt samband (20). Syftet med föreliggande arbete För närvarande analyseras vid Länssjukhuset i Kalmar U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda med IMMAGE 800. Syftet med föreliggande arbete är att analysera 37 urinprover med BN ProSpec och jämföra dessa resultat med dem som erhålls med IMMAGE 800. 10

MATERIAL OCH METODER Analys av kvalitetskontroll med IMMAGE 800 En kontroll för albumin, IgG, kappa och lambda nyttjades. Därefter placerades två små koppar i två större rör med en barkod för urinproteinkontroll nivå 1, lågt värde på albumin och IgG (UPCL1, Urine Protein Control Level 1) och en barkod för urinproteinkontroll nivå 2, högt värde på albumin och IgG (UPCL2, Urine Protein Control Level 2). Barkoden gör att maskinen känner igen dessa kontroller. Till de två små kopparna applicerades 100 µl av UPCL1 respektive UPCL2. UPLC1 och UPLC2 består av flytande human urin med tillsatser av albumin och IgG. Kontrollerna BioRS1 (lågt värde för kappa- och lambdakedjor) och BioRS3 (högt värde för kappa- och lambdakedjor) fanns tillsatta i två rör med barkod för dessa. BioRS1 och BioRS3 består av humant serum med tillsatser av serumproteiner. Kontrollerna analyserades i IMMAGE 800. Analys av prov med IMMAGE 800 Från män och kvinnor i olika åldrar som tidigare diagnostiserats beställdes 37 urinprover som analyserades med avseende på bland annat albumin, IgG, kappa och lambda. Dessa analyser analyseras med hjälp av rate-nefelometri. Vid analys av albumin tillsatte instrumentet först 300 µl av buffert 1, som innehåller fosfatbuffrad koksaltlösning med polymerförstärkare och Na-azid (<0,01%) till en kyvett. Därefter tillsattes 21 µl av provet och till slut 21 µl av reagenset som består av albuminantikroppar. Detta blandades, fick reagera och ljusintensitetens ökning mättes under en viss tid med en detektor som är placerad i 90 vinkel mot laserstrålen. Vid analys av IgG tillsatte instrumentet först 300 µl av buffert 1 till en kyvett. Därefter tillsattes 24 µl av provet och till slut 21 µl av reagenset som består av anti humant IgG. Detta blandades, fick reagera och ljusintensitetens ökning mättes under en viss tid med en detektor som är placerad i 90 vinkel mot laserstrålen. Vid analys av kappa tillsatte instrumentet först 300 µl av buffert 1 till en kyvett. Därefter tillsattes 24 µl av provet och till slut 21 µl av reagenset som består av kappa-antikroppar. Detta blandades, fick reagera och ljusintensitetens ökning mättes under en viss tid med en detektor som är placerad i 90 vinkel mot laserstrålen. Vid analys av lambda tillsatte instrumentet först 300 µl av buffert 1 till en kyvett. Därefter tillsattes 21 µl av provet och till slut 21 µl av reagenset som består av lambdaantikroppar. Detta blandades, fick reagera och ljusintensitetens ökning mättes under en viss tid med en detektor som är placerad i 90 vinkel mot laserstrålen. Kalibrering av standardkurvor för IgG, albumin, kappa och lambda med BN ProSpec En kalibrering för vardera analys (IgG, albumin, kappa och lambda) beställdes. Därefter placerades standarden N Protein Standard SL i racket och racket placerades i provrotorn i instrumentet. Standard pipetterades upp och portionerades ner i spädningskopparna och späddes enligt tabell II med N Diluent (fosfatbuffrad koksalt): 11

Tabell II. Spädningsschema för olika standarder. Kappa 1:320 1:160 1:80 1:40 1:20 1:10 1:5 Lambda 1:320 1:160 1:80 1:40 1:20 1:10 1:5 Albumin 1:20480 1:10240 1:5120 1:2560 1:1280 1:640 IgG 1:2560 1:1280 1:640 1:320 1:160 Standardspädningarna pipetterades ner i varsin kyvett och därefter pipetterades även reagenset upp och portionerades ner i kyvetten med standarden. Reaktion och mätning startades. Analys av kvalitetskontroll med BN ProSpec Kontroller för albumin, IgG, kappa och lambda nyttjades. Därefter applicerades 1 ml av N protein controll LC 2 ( humant serum med tillsatser av IgG, albumin, kappa och lambda) i ett rör. Röret placerades i instrumentet och analys av innehållet med avseende på U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda utfördes. Analys av prov med BN ProSpec Från män och kvinnor i olika åldrar som tidigare diagnostiserats beställdes 37 urinprover som analyserades med avseende på bland annat albumin, IgG, kappa och lambda. Dessa analyser analyseras med hjälp av nefelometri. Vid analys av U-albumin utfördes först en provspädning 1:5 med N Diluent i spädningskopparna. Därefter portionerade instrumentet ner 100 µl av det spädda provet och 85 µl av N Reaction buffer (buffert som innehåller polyetylenglykol och natriumklorid (11,6 g) i fosfatbuffert (0,05 mol/l) i kyvetten. Därefter tillsattes även 40 µl Albumin-reagens (antiserum mot humant albumin) och 100 µl N Reaction buffert i kyvetten. Reaktionen och mätningen startades. Vid analys av U-IgG portionerade instrumentet ner 100 µl av provet och 100 µl av N Reaction buffer i kyvetten. Därefter tillsattes även 40 µl IgG-reagens (antiserum mot humant IgG) och 60 µl N Reaction buffert i kyvetten. Reaktionen och mätningen startades. Vid analys av U-kappa portionerade instrumentet ner 10 µl av provet och 80 µl av N Reaction buffer i kyvetten. Därefter tillsattes även 40 µl Kappa-reagens (antiserum mot humant immunoglobulin lätta kedjan, к-typ) och 80 µl N Reaction buffert i kyvetten. Reaktionen och mätningen startades. Vid analys av U-lambda portionerade instrumentet ner 10 µl av provet och 85 µl av N Reaction buffer i kyvetten. Därefter tillsattes även 40 µl Lambda-reagens (antiserum mot humant immunoglobulin lätta kedjan, λ-typ) och 100 µl N Reaction buffert i kyvetten. Reaktionen och mätningen startades. 12

Precision på BN ProSpec Metodens precision bestämdes genom en repeterbarhet (s.k. inomserieprecision) och mellanliggande precision (total precision inom laboratoriet). Inomserieprecision erhölls genom att kontrollserum (1 och 2) nivå 1 och nivå 2 analyserades för vardera U-IgG, U- albumin, U-kappa och U-lambda 20 gånger på en dag. För totala precisionen analyserades två andra kontrollserum (3 och 4), nivå 1 och nivå 2, 6 gånger per dag i fem dagar. Normalvärden Referensintervallen, vid avdelning för klinisk kemi i länssjukhuset i Kalmar, för de olika urinproteinerna albumin, IgG, kappa och lambda hos vuxna ligger på <0,03 g/dygn för U- albumin, <10 mg/dygn för U-IgG, <15 mg/dygn kappa och <15 mg/dygn för lambda. Är det värden över dessa referensintervaller så tyder det på någon sjuklig förändring i njuren. Statistik Medelvärden, standardavvikelsevärden och variationskoefficienter beräknades med datorprogrammet Microsoft Office Excel 2003. Etiska aspekter Eftersom urinproven som användes vid denna studie användes för metodutveckling behövdes inget godkännande från etisk kommitté. Dock var proverna avidentifierade under studiens gång. 13

RESULTAT Kalibrering BN ProSpec Standarden för U-albumin gav värden på 0,00214 g/l; 0,00428 g/l; 0,00855 g/l; 0,0171 g/l; 0,0342 g/l och 0,0684 g/l för de olika spädningarna, bilaga 1: figur 10 och tabell IV. Standarden för U-IgG gav värden på 3,56 mg/l; 7,12 mg/l; 14,2 mg/l; 28,5 och 57 mg/l för de olika spädningarna, bilaga 2: figur 11 och tabell V. Standarden för U-kappa gav värden på 6,84 mg/l; 13,7 mg/l; 27,4 mg/l; 54,8 mg/l; 110 mg/l; 219 mg/l och 57 mg/l för de olika spädningarna, bilaga 3: figur 12 och tabell VI. Standarden för U-lambda gav värden på 3,78 mg/l; 7,56 mg/l; 15,1 mg/l; 30,3 mg/l; 60,5 mg/l; 121 mg/l och 242 mg/l för de olika spädningarna, bilaga 4: figur 13 och tabell VII. Kvalitetskontroll IMMAGE 800 Värdet på den låga respektive den höga kontrollen för U-albumin blev 0,011g respektive 0,032g medan den blev 13,40 mg respektive 44,50 mg för U-IgG; 63,2 mg respektive 153,0 mg för U-kappa och 27 mg respektive 65,5 mg för U-lambda, bilaga 5 och tabell VIII för gränsvärden för de olika U-proteinkontrollerna. BN ProSpec Kvalitetskontrollen gav värdet 0,252 g/l för U-albumin, 30,1 mg/l för U-IgG, 80,5 mg/l för U-kappa och 30,7 mg/l för U-lambda, bilaga 5: tabell IX, för gränsvärden för de olika U-proteinkontrollerna. Analys av Prov IMMAGE 800 Resultaten från de 37 olika proven resulterade i värden mellan 0,00382 g/l 4,16 g/l för U-albumin, < 3,00 mg/l 244 mg/l för U-IgG, < 6,11 mg/l 2110 mg/l för U-Kappa och < 9,50 mg/l 168 mg/l för U-Lambda, bilaga 6: tabell X. BN ProSpec Resultaten från de 37 olika proven resulterade i värden mellan 0,0021 g/l 4,95 g/l för U-albumin, < 3,56 mg/l 258 mg/l för U-IgG, < 6,84 mg/l 1560 mg/l för U-Kappa och < 3,78 mg/l 74,6 mg/l för U-Lambda, bilaga 7: tabell XI. 14

BN ProSpec Metodjämförelse Resultaten av de 37 urinprov, som analyserades med N-antiserum mot humant albumin, humant IgG och humant immunoglobulin samt mot lätta kedjan av typ к och av typ λ, på både IMMAGE 800 och BN ProSpec, korrelerades, tabell III och figur 6-9. Tabell III. Resultat vid jämförelse av de 37 urinprov som analyserades med IMMAGE 800 och BN Prospec (korrelation) Protein Linjär regression Korrelations-koefficient Albumin y = 1,2186x 0,0053 0,9976 = 0,999 IgG y = 1,0945x + 0,1688 0,9964 = 0,998 Kappa y = 1,2916x 0,5746 0,8975 = 0,947 Lambda y = 0,4282x + 9,4017 0,7795 = 0,883 Korrelation (U-albumin) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 y = 1,2186x - 0,0053 R 2 = 0,9976 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 IMMAGE 800 Figur 6. Korrelationen mellan U-albumin-värden från IMMAGE 800 och BN ProSpec. Detta diagram visar korrelationen för U-albumin värden upp till 1,8 g/l. 15

BN ProSpec BN ProSpec Korrelation (U-IgG) 180 160 140 120 100 80 y = 1,0945x + 0,1688 R 2 = 0,9964 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 IMMAGE 800 Figur 7. Korrelationen mellan U-IgG-värden från IMMAGE 800 och BN ProSpec Korrelation (U-kappa) 140 120 100 80 y = 1,2916x - 0,5746 R 2 = 0,8975 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 IMMAGE 800 Figur 8. Korrelationen mellan U-kappa-värden från IMMAGE 800 och BN ProSpec 16

BN ProSpec Korrelation (U-lambda) 90 80 70 60 50 y = 0,4282x + 9,4017 R 2 = 0,7795 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 IMMAGE 800 Figur 9. Korrelationen mellan U-lambda-värden från IMMAGE 800 och BN ProSpec BN ProSpec Precision Kontrollserum 1 (låg nivå) hade en inomseriespridning uttryckt som variationskoefficient (CV %) på ca 5,2 % för U-albumin och U-IgG, 5,1 % för U-kappa och 5,3 % för U- lambda, bilaga 8: tabell XII. Kontrollserum 2 (hög nivå) hade en inomseriespridning uttryckt som variationskoefficient på ca 1,6 % för U-albumin, 1,4 % för U-IgG, 1,7 % för U-kappa och 0,9 % för U-lambda, bilaga 9: tabell XIII. Kontrollserum 3 (låg nivå) hade en total precision uttryckt som variationskoefficient på ca 1,83 % för U-albumin, 2,57 % för U-IgG, 1,91 % för U-kappa och 2,50 % för U- lambda, bilaga 10 och 11: tabell XIV-XVII. Kontrollserum 4 (hög nivå) hade en total precision uttryckt som variationskoefficient på ca 4,02 % för U-albumin, 1,15 % för U-IgG, 1,19 % för U-kappa och 0,69 % för U- lambda, bilaga 11 och 12: XVIII-XXI. 17

DISKUSSION Värdena på de låga och höga kvalitetskontrollerna för U-proteinerna albumin, IgG, kappa och lambda, som analyserades med IMMAGE 800, blev samtliga godkända då de låg inom gränsvärdena för dessa kontroller, bilaga 5:tabell VIII, och de låg även mycket nära medelvärdena. Medelvärden och kontrollgränser sätts vid metodens inkörning. Uppföljning av kontroller sker regelbundet och eventuella justeringar kan göras. Hade kontrollerna inte legat inom godkänt gränsvärde hade en utredning av felet gjorts. Felen kan t.ex. vara fel på kontroll, reagens eller metod. Värdena på kvalitetskontrollerna för U-proteinerna albumin, IgG, kappa och lambda, som analyserades med BN ProSpec, blev likaså samtliga godkända då de låg inom gränsvärdena för dessa kontroller, bilaga 5: tabell IX. Resultaten, som erhölls för samtliga 37 patienter på både IMMAGE 800 och BN ProSpec, bör således vara tillförlitliga eftersom kontrollerna blev godkända. En kalibrering av en standardkurva gjordes inte på IMMAGE 800 eftersom det redan fanns en standardkurva för den lot som användes för reagensen. Kalibrering av standardkurvorna på BN ProSpec blev godkända eftersom värdet på Dev (%) inte blev ± 10 %. Dev (%)-värdet visar hur långt resultatet (koncentrationen) ligger från ett teoretiskt beräknat värde som ska vara det sanna värdet. Eftersom resultaten som erhölls inte låg ± 10 % från det sanna värdet blev kalibreringen godkänd. Inomseriespridning av analyserna U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda på både högre och lägre nivå har analyserats tidigare vid laboratoriets metodvalidering av IMMAGE 800, bilaga 13: tabell XXII-XXIII. IMMAGE 800 fick då lägst CV-värde på analysen U-IgG, låg nivå, vilket visar att IMMAGE 800 har bäst precision för lägre nivåer av U-IgG. Bäst precision för de högre nivåerna hade IMMAGE 800 för analysen U-kappa. Den analys, som IMMAGE 800 hade sämst precision för, var U-lambda. Alla CV-värden som ses i tabell XXII och XXIII i bilaga 13 är ändå godkända enligt EQUALIS och det är därför som avdelning för klinisk kemi på länssjukhuset i Kalmar har kunnat analysera U-proteinanalyser på IMMAGE 800. Inomseriespridningen för BN ProSpec, bilaga 8 och 9:tabell XII respektive XIII, visar att den har bäst precision för U-lambda hög nivå eftersom variationskoefficienten (CV) fick lägst värde för just U-lambda. Det visar alltså att samma prov som analyserades flera gånger i rad för U-lambda fick värden som var närmare varandra och varierade mindre än för de andra analyserna. BN ProSpec hade ändå låga CV-värden på de andra analyserna (hög nivå), vilket visar att den även har bra precision för U-albumin, U-IgG och U-kappa. När det gäller precision för låg nivå av samtliga fyra analyser låg alla CV-värdena runt cirka 5 %. Den analys, som har lägst CV-värde är U-kappa, som fick ett CV-värde på 5,0659 % och precisionen för den blev alltså bäst när det gäller analys av U-albumin, U- IgG, U-kappa och U-lambda (låg nivå). De andra analyserna fick CV-värden som inte låg långt därifrån, vilket visar att BN ProSpec har nästan lika bra precision för samtliga dessa analyser. Om inomseriespridningen för låg och hög nivå jämförs, ses att BN ProSpec har bättre precision då den analyserar högre värden på U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda än när den analyserar lägre värden. Det ser man genom att CV-värdena är lägre för alla analyser då nivån av dessa proteiner är högre än lägre. Med högre värden i detta fall 18

menas värden runt 0,14 g/l för albumin; 37 mg/l för U-IgG, 105 mg/l för U-kappa och 57 mg/l för U-lambda. Med lägre värden menas i detta fall värden runt 0,016 g/l för U- albumin, 3,5 mg/l för U-IgG, 24 mg/l för U-kappa och 9 mg/l för U-lambda. Att precisionen är sämre för prov med mycket lägre nivåer beror nog på att nivån närmar sig detektionsgränsen och signal/brus-förhållandet blir sämre. Precisionen för provet med högre nivåer hade inte så höga nivåer att det var nära detektionsgränsen och därför blev precisionen bättre. Den totala precisionen visar att alla analyser erhöll CV-värden, bilaga 10-12: tabell XIV- XXI, som var godkända enligt EQUALIS kvalitetsmål. Enligt dessa ska maximal avvikelse från totalmedelvärdet ligga under 10 %, det vill säga CV total = <10 % (21). BN ProSpec hade CV total -värden som låg under 5 % för samtliga analyser. Lägst CV total -värde hade U-lambda hög nivå (CV total =0,69 %), medan högst CV total -värde hade U-albumin hög nivå (CV total =4,02 %). Detta visar att BN ProSpec hade bäst total precision för U- lambda hög nivå. Precisionen (inomseriespridning) för IMMAGE 800 och BN ProSpec visar att IMMAGE 800 har bättre precision för de lägre nivåerna än vad BN ProSpec har, bilaga 8: tabell XII och bilaga 13: tabell XXII. En orsak till detta kan vara att de låga nivåerna var ännu lägre i provet som analyserades flera gånger med BN ProSpec än med IMMAGE 800. Så var fallet med U-albumin, U-IgG och U-lambda. Men när det gäller U-kappa så var halten i det prov som analyserades fler gånger i IMMAGE 800 högre än halten som analyserades fler gånger i BN ProSpec och ändå var precisionen bättre hos IMMAGE 800. CV-värdet för U-IgG och U-kappa med IMMAGE 800 var mycket lägre än CV-värdet för U-IgG och U-kappa med BN ProSpec vilket visar att IMMAGE 800 har en bättre precision för just dessa analyser vid låga halter. När det gäller U-lambda och U-albumin är det lite svårare att avgöra eftersom förhållandet, halten mot CV-värdet, inte skiljer lika mycket. Precisionen (inomseriespridning för högre nivåer) för IMMAGE 800 och BN ProSpec visar att BN ProSpec har bättre precision för U-IgG och U-lambda eftersom CV-värdet för dessa är lägre hos BN ProSpec än CV-värdet för dessa analyser hos IMMAGE 800, bilaga 9: tabell XIII och bilaga 13:tabell XXIII. När det gäller nivåerna för analyserna U- IgG och U-lambda ses att nivåerna för dessa är betydligt lägre hos provet som analyserades i BN ProSpec än IMMAGE 800, men eftersom nivåerna inte ligger nära någon detektionsgräns borde det inte spela någon större roll. När det gäller U-albumin och U-kappa har IMMAGE 800 bättre precision än BN ProSpec då CV-värdena var lägre för dessa då de analyserades med IMMAGE 800 än BN ProSpec. Korrelationen mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec gav ett positivt samband för alla analyser då korrelationskoefficienten låg på mer än 0 och närmare 1. Korrelationen var dock bäst för analysen U-albumin eftersom korrelationskoefficienten fick ett värde som låg närmare 1 än korrelationskoefficienten för de andra analyserna. Näst bäst var korrelationen för analysen U-IgG som fick ett värde som inte låg långt efter värdet för U- albumin. Värden för de 37 urinprov som analyserades på båda IMMAGE 800 och BN ProSpec var alltså ganska lika när de gäller U-albumin och U-IgG. När det gäller korrelationskoefficienten för U-kappa och U-lambda så låg dessa värden inte lika nära 1 som U-albumin och U-IgG gjorde. Det kan även ses vid jämförelse av värdena i tabell X och tabell XI i bilaga 6 respektive 7, för dessa två analyser då värdena inte var så lika som vid jämförelse av värdena på U-albumin och U-IgG. Sämst korrelation mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec var alltså för analyserna U-lambda och U-kappa, eftersom dessa analyser fick lägst värde på korrelationskoefficienten. Dock speglar detta inte helheten för U-lambda eftersom det finns två riktigt höga värden som gör att hela 19

trendlinjen blir annorlunda och värdena ligger inte nära linjen för det. När korrelationen utfördes på Microsoft Office Excel 2003 användes samtliga 37 resultat för albumin men inte alla 37 resultat för resterande. Att inte alla 37 resultat användes för U-IgG, U-kappa och U-lambda beror på att vissa resultat var mindre än värden, det vill säga att de låg under detektionsgränsen, och det klarar inte Microsoft Office Excel 2003 av att jämföra och därför togs dessa bort. Detta kan alltså ha påverkat korrelationen, både till det bättre men kanske även till det sämre. I figur 6-9, som visar korrelationen mellan IMMAGE 800 och BN ProSpec för de olika analyserna, finns värden både ovanför och under trendlinjen, vilket visar att ingen av analysinstrumenten visar konstant högre eller lägre värden än den andra. Det har alltså blivit slumpmässigt högre eller lägre för de olika resultaten på dessa två analysinstrument. Felkällor med dessa två metoder är t.ex. luftbubblor i prov och eller reagens. Det är därför viktigt att noga avlägsna eventuella luftbubblor före analys för annars kan instrumentet pipettera luft, vilket leder till att mängden prov eller reagens blir för liten och ett felaktigt resultat erhålls. Andra möjliga felkällor kan vara att reagenset är för gammalt eller fel på metod och instrument. Slutsats BN ProSpec kan användas vid analys av U-albumin, U-IgG, U-kappa och U-lambda då den uppfyller EQUALIS kvalitetsmål. 20

TACKORD Jag skulle vilja tacka alla på klinisk kemi laboratoriet vid länssjukhuset i Kalmar som hjälpt mig med det laborativa under examensarbetet. De som jag skulle vilja tacka extra mycket för detta är Inger Gustafson, Margareta Petersson Engdahl och Kristina Persson. Mina handledare, Ingvar Rydén och Anki Koch-Schmidt skulle jag vilja tacka extra mycket för all hjälp, speciellt med skrivandet av examensarbetet. Jag vill även tacka min familj som stöttat mig under hela examensarbetets gång. 21

REFERENSER 1. Nilsson-Ehle P, Ganrot PO, Grubb A et al. Laurells klinisk kemi i praktisk medicin (2003), 8:e uppl, Studentlitteratur, Lund. 2. Tencer J, Thysell H, Grubb A. Analyses of proteinuria: reference limits for urine excretion of albumin, protein HC, immunoglobulin G, kappa- and lambdaimmunoreactivity, orosmucoid and alpha 1-antitrypsin. Scand J Clin Lav Invest. 1996; 56: 691-700 3. Whicher J, Spence C. When is serum albumin worth measuring? Ann Clin Biochem 1987; 24: 572-80 4. Rowe DJ, Dawnay A, Watts GF. Microalbuminuria in diabetes mellitus: review and recommendations for the measurement of albumin in urine. Ann Clin Biochem 1990; 27: 297-312 5. Mogensen CE, Chachati A, Christensen CK et al. Microalbuminuria: an early marker of renal involvement in diabetes. Uremia Invest 1986; 9:85-95 6. Thomas L. Immunoglobulins (Ig). In: Thomas L (ed.) Clinical Laboratory Diagnostics, TH-Books, Frankfurt/Main 1998; 667-78 7. Roitt I, Brostoff J & Male D. Immunology (1996). 4th editition. Mosby: London 8. A.R Bradwell, IgG and IgA Subclasses in Disease. First edition, 1995 9. Skvaril F, et al. Imbalances of κ/λ ratios of immunoglobulins. In: Rotzmann SE, ed. Protein Abnormalities, Vol. 2. New York: Alan R. Liss, Inc., 1982:21-35 10. Lievens MM. Medical and technical usefulness of measurement of kappa and lambda immunoglobulin light chains in serum with an M-component. J Clin Chem Biochem 1989; 27: 519-23 11. Boege F, Koehler B, Schwab M. Die diagnostische Wertigkeit des Kappa/Lambda-Leichketten Quotienten bei Nachweis, Identifizierung und Quantifixierung monoklonaler Immunoglobuline im Vergleich zur Immunfixation, M-Gradient und quantitativer Immunoglobulinbestimmung: Unter-suchung an 101 Patientseren. Lab med 1989; 13: 369-74 12. Tillyer CR. Clinical applications of immunoglobulin free light chain estimations. Int J Clin Lab Res 1993; 23: 25-9 13. Beckman Coulter, Immage 800 Operations Manual A11403, March 2004 14. Wilson, K and Walker, J, (2005), Biochemistry and Molecular Biology, 6 th edition, Cambridge University Press, 583-584 15. DADE BEHRING, BN ProSPec system Instruktionsbok, augusti 2003 16. Baudner S, Bienvenu J, Blirup-Jensen S, et al. The certification of a matrix reference material for immunochemical measurement of 14 human serum proteins. CRM 470. Brussels: Community Bureau of Reference, Commision of the European Communities. BCR Information, Reference Materials. 1993 report EUR 15243 EN (ISSN 1018-5593): 1-172 17. Blirup-Jensen S, Just Svendsen P. A New International Reference Preparation for Proteins in Human Serum. Clinical Immunochemical Department, DAKO A/S, 2600 Glostrup, Copenhagen, Denmark. Uppsala J Med Sci 1994; 99: 251-258 18. N Protein Standard SL, DADE BEHRING, Edition December 2001 19. http://www.swedac.se/sdd/system.nsf/(guiview)/index.html 2010-04-15 kl 23.40 20. Ejlertsson G. Statistik för hälsovetenskaperna (2003), studentlitteratur, Denmark 21. http://www.equalis.se/ 2010-05-07 kl 11.40 22