KAPITEL 8 ERYTROCYTANTIKROPPSUNDERSÖKNING Grundversion 2.0 utgiven 2006-01-30 Förslag till ändringar senast 2006-12-01 till Johanna.Strindberg@karolinska.se HB-kap. 8v2.0-2006.doc 1 (12)
INNEHÅLLSFÖRTECKNING Sid 1 Definitioner 3 2 Faktorer av betydelse vid antikroppsundersökning 3 2.1 Syfte 3 2.2 Blodprov 3 2.3 Testerytrocyter 3 3 Metoder 4 3.1 Antikroppsscreening 4 3.2 Antikroppsidentifiering 4 Kontroller 4 4.1 Externa kvalitetskontroller 4 4.2 Interna kontroller 4 5 Antikroppsscreening 5 5.1 Antikroppsscreening - användningsområden 5 6 Antikroppsidentifiering 6 6.1 Antikroppsidentifiering 6 6.2 Kvantifiering 6 6.3 Hemolytisk transfusionsreaktion 7 7 Direkt antiglobulintest 7 7.1 Indikationer 7 7.2 Utredning vid positivt DAT 7 8 Avläsning, protokollföring, bedömning, uttolkning och besvarande 7 8.1 Avläsning 7 8.2 Protokollföring 8 8.3 Bedömning, uttolkning och besvarande 8 9 Referenser 8 Bilaga 1 Tabell: Interna kontroller 9 Bilaga 2 Laboratorieundersökningar vid hemolytisk transfusionsreaktion 10 HB-kap. 8v2.0-2006.doc 2 (12)
1 DEFINITIONER Se kap. 17. Med antikroppar avses i detta kapitel antikroppar mot erytrocyter. 2 FAKTORER AV BETYDELSE VID ANTIKROPPSUNDERSÖKNING 2.1 Syfte Syftet med antikroppsundersökning är att upptäcka kliniskt betydelsefulla irreguljära erytrocytantikroppar. 2.2 Blodprov Vid provtagning ska riktlinjer i SOSFS 1989:38 avseende såväl märkning av rör och remiss samt identitetskontroll följas. 2.2.1 Provets ålder vid antikroppsundersökning bör vara högst 5 dagar. 2.2.2 Prov skall förvaras vid 2-6 o C då undersökning inte pågår. 2.2.3 Plasma och serum har utvärderats som likvärdiga vad gäller påvisande av erytrocytantikroppar. Fortsättningsvis anges plasma. 2.3 Testerytrocyter 2.3.1 Testerytrocyter ska väljas så att de täcker in de flesta antigen mot vilka antikroppar av klinisk betydelse förekommer, se tabell nedan. De olika testerytrocyterna ska, resp. bör, tillsammans ha följande antigen: System Antigen som testerytrocyterna - - ska ha - bör ha Rh D, C, c*, E*, e* C W Kell K, k Kp a Duffy Fy a *, Fy b * Kidd Jk a *, Jk b * MNS S*, s*, M * = testerytrocyter som saknar det antitetiska antigenet bör väljas. Testerytrocyterna bör sakna HLA associerade antigen (Bg) 2.3.2 Testerytrocyternas fenotyp ska vara bestämd med två vid olika tillfällen tagna prov och om möjligt med olika reagens. 2.3.3 Erytrocyter från flera givare ska inte blandas. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 3 (12)
2.3.4 CE-märkta förvaringslösningar: Följ fabrikantens anvisningar. Erytrocytsuspension i isoton koksaltlösning eller LISS är hållbar två dygn vid 2-6 o C. Suspension av erytrocyter i egen plasma (ACD- eller CPD-blod) är hållbar i två veckor vid 2-6 o C. Förvaring av testerytrocyter på annat sätt måste valideras. 3 METODER 3.1 Antikroppsscreening Indirekt antiglobulintest med erytrocyter i lågjonlösning, IAT/LISS, påvisar de flesta antikroppar av klinisk betydelse och är standardteknik. IAT/LISS kan utföras med kolonnseparation, (t.ex. gelteknik), rörteknik eller fast-fas-teknik. De serologiska tekniker som används vid antikroppsscreening ska kunna påvisa irreguljära antikroppar med en känslighet som minst motsvarar IAT/LISS i rörteknik. 3.2 Antikroppsidentifiering Vid antikroppsidentifiering är IAT/LISS standardteknik. Andra serologiska tekniker som kan användas är koksaltteknik, IAT/NISS, IAT/PEG och enzymteknik. 4. KONTROLLER 4.1 Externa kvalitetskontroller Alla ska delta i externa kvalitetskontrollprogram motsvarande omfattningen av den egna verksamheten. 4.2 Interna kontroller Interna benämns de kontroller som utförs inom verksamheten, oavsett syften. Bilaga 1 visar kontroller i tabellform. 4.2.1 Ankomstkontroll utförs vid leverans av reagens för att säkerställa att den utlovade kvaliteten stämmer med ställda krav. Vid vidaredistribution inom region eller län behövs ingen ytterligare ankomstkontroll. De blodcentraler som ej utför egen ankomstkontroll på varan ska ha kopior på dokumentationen. Ankomstkontroll av kommersiella CE-märkta testerytrocyter är ej ett krav. Vid ankomst av testerytrocyter framställda vid annan blodcentral utförs stabilitetstest, se nedan. 4.2.2 Beredningskontroll utförs vid beredning av egna framställda testerytrocyter för att säkerställa att förväxling ej har skett. 4.2.3 Regelbunden stabilitetstest av testerytrocyter vid antikroppsscreening ska utföras, dock minst en gång per vecka. Dokumenterade rutiner för hur blodcentralen kan spåra och utföra omtestning ska finnas. I kontrollen används en svag antikropp, reaktionerna ska ej vara starkare än ++. Skillnad mellan testerytrocyter som har respektive saknar det antitetiska antigenet bör synas. Dokumenterade rutiner för hur avvikande känslighetskontroll hanteras ska finnas. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 4 (12)
4.2.4 Metodkontroll vid antikroppsscreening: Positiv kontroll ska ingå vid varje laboration. Den positiva kontrollen bör ge ++ reaktion med testerytrocyter med fullstarkt antigen. 4.2.5 Metodkontroll vid antikroppsidentifiering: Om provet ger genomgående positiva reaktioner med testerytrocyterna, ska test med autologa erytrocyter som negativ kontroll utföras i aktuella tekniker. Vid IAT med rörteknik skall sensibiliserade kontrollerytrocyter tillsättas vid negativ reaktion för att kontrollera att använt AHG/anti-IgG är aktivt. Vid IAT/PEG ska positiv kontroll ingå vid varje laboration, antikroppen som används ska vara utprovad så att PEG krävs för att tydligt visa förstärkt reaktivitet. Vid enzymteknik ska positiv kontroll ingå vid varje laboration, antikroppen som används ska vara utprovad för att visa tydligt förstärkt reaktivitet med enzymbehandlade testerytrocyter. 4.2.6 Kontroller vid fenotypsbestämning. Vid rörteknik eller annan teknik där reagens tillsätts skall positiv och negativ kontroll ingå i varje laboration. Testerytrocyten i den positiva kontrollen ska ha motsvarande antigen i enkel dos. Om reagens finns i kolonnerna räcker det med ankomstkontroll. Om allt blir positivt; kontrollera patientens erytrocyter med AB kontrollreagens (plasma från en icke immuniserad AB individ) för att se om spontanagglutination föreligger. 4.2.7 Kontroll vid titerbestämning bör utföras vid varje laboration genom att prov med känd titer analyseras parallellt, antingen ett tidigare titrerat prov från samma patient eller ett prov med känd titer. 4.2.8 Kontroll vid DAT. Vid positiv DAT ska AB-kontrollreagens användas för att avslöja ev. spontanagglutination. Vid negativ DAT med rörteknik ska sensibiliserade kontrollerytrocyter tillsättas för att visa att AHG/anti-IgG är aktivt. 4.2.9 Statistisk jämförelse av antikroppsfynd mellan olika tidsperioder bör utföras som kontroll för att t.ex. avslöja metodglidning eller undersöka ev. effekt av införd ny teknik. 5 ANTIKROPPSSCREENING Antikroppsscreening kallas den orienterande antikroppsundersökning som utförs för att upptäcka kliniskt viktiga irreguljära erytrocytantikroppar. Vid positivt utfall ska antikroppsidentifiering utföras. 5.1 Antikroppsscreening - användningsområden Antikroppsscreening ska utföras vid blodgruppering av prov från patienter och prov från den förebyggande mödravården. Den kan även utföras som enskild undersökning. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 5 (12)
Antikroppsscreening ska också utföras vid blodgruppering av prov från blodgivare vid nyanmälan samt efter graviditet och transfusion för att undvika att kliniskt viktiga irreguljära erytrocytantikroppar i plasma transfunderas till patient. Se kap. 7. 5.1.1 Antikroppsscreening ingår i BAS-test och kan komplettera MG-test. Se kap. 9. 6 ANTIKROPPSIDENTIFIERING 6.1 Antikroppsidentifiering Antikroppsidentifiering ska utföras av laboratorium med kompetens för detta. Positivt resultat vid antikroppsscreening eller förenlighetsprövning samt oväntat positiv reaktion vid plasma/serumgruppering kan föranleda antikroppsidentifiering. 6.1.1 För identifiering ska en panel av testerytrocyter av blodgrupp O användas, så utvald att så många antikroppar som möjligt ger unika mönster med de olika testerytrocyterna. 6.1.2 Val av metod beror på vilken antikroppsspecificitet som misstänks. Grundregel är att identifiering görs med samma metod som användes då misstanken uppkom. Erfarenheten hos den som bedömer identifieringen avgör sedan om ytterligare komplettering med andra metoder bör göras, regler för detta kan inte ges. 6.1.3 För att ett antikroppsfynd skall betraktas som alloantikropp krävs att patienten saknar det antigen antikropparna är riktade mot. Vid fenotypsbestämning ska fabrikantens rekommendation följas, avvikelse från denna ska valideras. 6.1.4 För att säkert bevisa en irreguljär erytrocytantikropp krävs tre positiva och fyra negativa reaktioner, där de testerytrocyter som har antigenet ger positiv reaktion och de som saknar antigenet ger negativ reaktion. Sannolikheten är då >95% att specificiteten stämmer. Om fler antikroppar förekommer samtidigt, ska varje antikropp bevisas med tre positiva reaktioner och fyra negativa. 6.1.5 Genomisk typning kan vara värdefull i vissa fall, t.ex. hos multitransfunderade patienter eller vid DAT-positivitet där endast IAT-teknik finns att tillgå vid fenotypsbestämning. 6.2 Kvantifiering Bestämning av antikroppshalt för kliniskt betydelsefulla antikroppar bör ske under graviditet och i samband med ABO-oförenliga transplantationer. 6.2.1 Semikvantitativ titerbestämning: Plasma späds i en geometrisk spädningsserie med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Varje spädningssteg undersöks med testerytrocyt enligt nedan med IAT/LISS. 6.2.2 Titer anges som det sista spädningssteg som ger en klart positiv reaktion, minst +. (Exempel: spädning 1:16 ger titer 16). HB-kap. 8v2.0-2006.doc 6 (12)
6.2.3 Titerbestämning under graviditet ska utföras mot testerytrocyter från givare som har även det antitetiska antigenet ifråga. IAT/LISS ska användas. Samma testerytrocyt bör användas varje gång. 6.2.4 Kvantifiering utförd med flödescytometri eller annan teknik som använder internationell standard, ger möjlighet att svara med mätvärde, vilket ger exaktare information än semikvantitativ titerbestämning. 6.3 Hemolytisk transfusionsreaktion Laboratorieundersökningar vid misstanke på hemolytiska transfusionsreaktioner, se Bilaga 2. 7 DIREKT ANTIGLOBULINTEST, DAT 7.1 Indikationer DAT utförs med bredspektrigt AHG vid anemiutredning och misstanke på hemolys, om reaktion med egna erytrocyter utfaller positivt, vid transfusionsreaktion och efter ABO-oförenlig stamcellstransplantation och minor ABO-inkompatibel organtransplantation samt vid frågeställningen bilirubinstegring hos nyfött barn. 7.2 Utredning vid positivt DAT Om DAT är positivt bör provet utredas med monospecifika reagens: Anti-IgG och anti-c3d, samt ev. anti-igm, anti-iga och anti-c3c. Undantag är barn < 4 månader. 8 AVLÄSNING, PROTOKOLLFÖRING, BEDÖMNING, UTTOLKNING OCH BESVARANDE 8.1 Avläsning Både okulär och maskinell avläsning förekommer. Vid okulär avläsning ska den som har satt provet avläsa, dokumentera reaktionsmönstret, datera och signera undersökningen. Vid maskinell avläsning ska full spårbarhet finnas till utrustning, reaktionsmönster, datum samt ansvarig för undersökningen. 8.1.1 Gradering av agglutinationsreaktioner måste vara noga fastställd och enhetlig inom laboratoriet och inom regionen. Avläsningsmall: ++++ i mikrokolonn teknik: alla erytrocyter ligger överst i kolonnen i rörteknik: ett enda agglutinat i fast fas: alla erytrocyter kläder hela brunnen i ett jämnt lager, +++ i mikrokolonn teknik: de flesta erytrocyterna ligger överst i kolonnen i rörteknik: flera stora agglutinat i fast fas: de allra flesta erytrocyterna kläder brunnens yta, några enstaka kan ligga mitt i brunnens botten HB-kap. 8v2.0-2006.doc 7 (12)
++ i mikrokolonn teknik: erytrocyter spridda i kolonnen i rörteknik: medelstora agglutinat och en del fria erytrocyter i fast fas: övervägande delen av erytrocyterna kläder brunnens yta, men en mindre del ligger mitt i brunnens botten + i mikrokolonn teknik: huvudparten av erytrocyterna ligger i kolonnens botten, men en del ligger en bit upp i kolonnen i rörteknik: ett flertal små agglutinat och många fria erytrocyter, i fast fas: en knapp av erytrocyter framträder tydligt mitt i brunnens botten, men en del kläder brunnens yta - i mikrokolonn teknik: alla erytrocyter ligger i kolonnens botten i rörteknik: alla celler fria i suspensionsmediet, i fast fas: alla erytrocyter ligger i en knapp mitt i brunnens botten 8.2 Protokollföring För varje undersökning ska i protokollet anges lab.nummer, undersökningsdatum, metod, använda teknik(er) och testerytrocyter, reaktionsmönster samt signatur för den som har avläst och registrerat reaktionerna. Använda kontroller och resultat av dessa kan anges i protokollet eller vara spårbara till annat protokoll. Spårbarhet till relevanta remissuppgifter skall säkerställas. Resultatet ska registreras i bloddatasystemet. 8.3 Bedömning och besvarande Ansvarig läkare eller biomedicinsk analytiker med behörighet för uppgiften ska bedöma resultatet av antikroppsidentifieringen och utforma svar. Svaret kan vid behov kompletteras med transfusionsråd, t.ex. val av blod vid transfusion, noggrann övervakning rekommenderas, blodet bör ges med blodvärmare. Svaret ska registreras i bloddatasystemet. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 8 (12)
9 REFERENSER Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10 th ed. Oxford, Blackwell Science Ltd, 1997. Issitt PD, Anstee DJ. Applied Blood Group Serology, 4 th ed. Durham NC, Montgomery Scientific Publications, 1998. AABB Technical Manual. Bethesda MD, American Association of Blood Banks, senaste upplagan. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, Strasbourg, Council of Europe Publishing, senaste upplagan. Huvudansvariga Version 1.0 1984: Version 1.1 1995: Version 2.0 2005: Gudrun Liedén Gudrun Liedén Johanna Strindberg, Jan Säfwenberg HB-kap. 8v2.0-2006.doc 9 (12)
BILAGA 1. Tabell: Interna kontroller Typ av kontroll Frekvens Kommentar Ankomstkontroll av reagens, ny batch Beredningskontroll av egna testerytrocyter Stabilitetstest av egna testerytrocyter Vid ankomst Vid beredning Minst en gång per vecka Positiv kontroll: testerytrocyt som har antigenet och det antitetiska antigenet Negativ kontroll: testerytrocyt som saknar antigenet. Förväxlingskontroll. Positiv kontroll: svag antikropp som ger ++ reaktioner. Antikroppsscreening Varje laboration Positiv kontroll: svag antikropp som ger ++ reaktioner. Antikroppsidentifiering Vid genomgående positiva reaktioner utförs som negativ kontroll test med autologa erytrocyter i aktuell teknik. - med IAT/PEG Varje laboration Positiv kontroll som kräver PEG för att visa förstärkt reaktivitet. - med enzymteknik Varje laboration Positiv kontroll som kräver enzym för att visa förstärkt reaktivitet. Fenotypsbestämning Kontrollreagens vid genomgående positiva reaktioner. - vid rörteknik och när reagens tillsätts i t.ex. gel Varje laboration Positiv kontroll: testerytrocyt som har antigenet och det antitetiska antigenet, negativ kontroll: testerytrocyt som saknar antigenet Titerbestämning Varje laboration Prov med känd titer analyseras parallellt. DAT Varje laboration Kontrollreagens vid genomgående positiva reaktioner. IAT och DAT med rörteknik Varje laboration Till rör med negativ reaktion sätts sensibiliserade kontrollerytrocyter HB-kap. 8v2.0-2006.doc 10 (12)
BILAGA 2. LABORATORIEUNDERSÖKNINGAR VID HEMOLYTISK TRANSFUSIONS- REAKTION En antigen-antikroppsreaktion mellan erytrocyter och antikroppar i cirkulationen på en människa (in vivo) leder i allmänhet till förkortad erytrocytöverlevnad. I vissa fall kan den ge akuta sjukdomssymtom (ångest, oro, bröst- och ländsmärtor, blodtrycksfall, frossa, feber, andnöd, chock, hemoglobinuri) och skada på flera organ (fr.a. njurar). Särskilt vid ABO inkompatibilitet kan livshotande reaktion inträffa. Laboratorieundersökningar vid misstanke på akut hemolytisk transfusionsreaktion Vid inträffad akut transfusionsreaktion ska blodprov från patienten taget efter transfusionen, samt den blodpåse som innehållit de erytrocyter som misstänks ha orsakat reaktionen, sändas till blodcentralen snarast möjligt. Använd BIS blankett 0, eller motsvarande typ av specialremiss, som protokoll. Om reaktionen rapporteras vara allvarlig, eller om nedanstående undersökningar tyder på transfusion av inkompatibla erytrocyter (t.ex. hemolys, positivt DAT i prov taget efter transfusion, oförenlig ABO grupp i transfunderad erytrocytenhet), ta omedelbart kontakt med jourhavande läkare på blodcentralen för ställningstagande till ev. akuta åtgärder. Av anvisningarna nedan bör punkt 1-4 göras så snart provet och blodpåsen nått blodcentralen. Dessa punkter bör vara slutförda före nästa transfusion. 1. Inspektera blodpåsen. Vid misstanke om hemolys eller annan grav avvikelse, tag prov från blodpåsen och prov från lika gammal erytrocytenhet i lagret, centrifugera rören och jämför ovanskiktets färg. Om det föreligger kraftig hemolys eller annan färgförändring i prov från den transfunderade påsen, meddela blodcentralens läkare. Undersök hur blodenheten har förvarats och transporterats före transfusion. 2. Jämför färgen på plasma i prov från patienten taget före och efter transfusionen. Vid hemolys är plasma i prov taget efter transfusion påtagligt rödare, brunare eller gulare. 3. Gör DAT på prov före och efter transfusionen. Vid positiv DAT ska förekomst av blandbild bedömas. Eluering kan ge värdefull information. Antikroppar hos patienten som bundits till transfunderade erytrocyter kan lossas från dessa, elueras, och i eluatet kan en ev. antikropp påvisas. 4. Utför ABO och RhD gruppering på erytrocyter från patienten tagna före och efter transfusion samt på erytrocyter från blodpåsen. Jämför med tidigare grupperingsresultat och bedöm ev. avvikelser. Utför MG-test med LISS/IAT mellan givna erytrocyter och plasma från patienten före och efter transfusionen. 5. Utför antikroppsscreening på plasma från patienten före och efter transfusionen. Eftersom antikroppshalten i prov efter transfusion kan vara lägre än i prov före (antikroppar kan sitta bundna till transfunderade givarerytrocyter) bör ev. antikroppsidentifiering göras på prov taget före transfusionen. Om material saknas för detta, gör identifiering på prov taget efter transfusionen. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 11 (12)
Laboratorieundersökningar vid misstanke på fördröjd hemolytisk transfusionsreaktion Om patienten vid tidigare tillfälle har bildat antikroppar, som inte kan påvisas vid antikroppsscreening inför den aktuella transfusionen, och om motsvarande antigen finns på de transfunderade erytrocyterna, kan transfusionen leda till en kraftigt ökad bildning av dessa antikroppar. De blir i regel påvisbara efter 4-7 dagar. Vanligen debuterar symtomen efter 7-8 dygn, men symtomdebut från 4 dygn upp till 3 veckor förekommer. Symtom är anemi, ikterus, eventuellt feber och njursvikt. Bild som vid autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) kan utvecklas. Laboratorieundersökningar vid blodcentralen är DAT inklusive ev. eluering, antikroppsscreening och antikroppsidentifiering. Om DAT eller antikroppsscreening utfaller positivt, kontrollera om patienten har fått erytrocyttransfusion den senaste månaden. HB-kap. 8v2.0-2006.doc 12 (12)